經(jīng)典開題報(bào)告課件

研究生：Tim3/Tim3L信號(hào)通路激活在Hp免疫致病及Hp疫苗免疫防治中的作用及其機(jī)制導(dǎo)師：研究生：Tim3/Tim3L信號(hào)通路激活在Hp免疫致病及Hp1研究背景研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)及擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題研究方法、手段、技術(shù)路線及可行性分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析課題創(chuàng)新之處年度計(jì)劃及預(yù)期進(jìn)展實(shí)驗(yàn)條件及經(jīng)費(fèi)預(yù)算研究背景2研究背景研究背景3Hp在人群中感染率高，能引起多種嚴(yán)重疾病機(jī)體免疫反應(yīng)在Hp感染致病和Hp疫苗免疫保護(hù)中均起重要作用研究Hp感染的免疫致病機(jī)制及Hp疫苗防治機(jī)制有重大意義Hp在人群中感染率高，能引起多種嚴(yán)重疾病4Th免疫反應(yīng)分泌IL-2、IFN-γ、TNF介導(dǎo)細(xì)胞免疫

ThTh1Th2分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)Treg分泌IL-10、TGFβ免疫抑制Th免疫反應(yīng)分泌IL-2、IFN-γ、TNFThTh1Th25Th1Th2IFN-γ(-)

(-)

IL-4

Th1與Th2關(guān)系Th1Th2IFN-γ(-)(-)IL-4Th1與Th6Hp與Th反應(yīng)Hp感染Th1占優(yōu)勢(shì)Th1和Th2失衡招募Treg感染持續(xù)存在Hp疫苗誘導(dǎo)Th1、Th2Th1和Th2失衡糾正Treg減少感染清除Hp與Th反應(yīng)Hp感染Th1占優(yōu)勢(shì)Th1和Th2失衡招募Tr7Tim家族Tim家族8Tim蛋白結(jié)構(gòu)Tim蛋白結(jié)構(gòu)9Tim-3是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與T細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)的Tim家族成員表達(dá)在成熟Th1細(xì)胞膜上不表達(dá)在未成熟Th細(xì)胞、Th2細(xì)胞上包含Ig-V樣結(jié)構(gòu)域的信號(hào)肽、粘附素樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)域、細(xì)胞內(nèi)尾巴Tim-3激活后降低Th1反應(yīng)Galectin-9是Tim-3的配體，主要表達(dá)在CD4+的T細(xì)胞Tim-3/Galectin-9通路的激活可導(dǎo)致Th1細(xì)胞效應(yīng)功能的終止Tim3和Tim3配體Tim-3是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與T細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)的Tim家族成員Ti10Tim-3與Th1Tim-3與Th111TLR家族及配體TLR家族及配體12TLR4信號(hào)通路TLR4信號(hào)通路13我們前期研究發(fā)現(xiàn)阻斷Tim-3信號(hào)通路可增加TLR4、MyD88表達(dá)、激活NF-κBTLR信號(hào)的負(fù)性調(diào)控因子SIGIRR可上調(diào)Tim-3的表達(dá)提示：Tim-3和TLR4信號(hào)通路可相互調(diào)控

Tim3和TLR4我們前期研究發(fā)現(xiàn)Tim3和TLR414我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Tim-3信號(hào)通路后，Treg減少說(shuō)明Tim-3信號(hào)通路在調(diào)節(jié)Treg控制炎癥反應(yīng)中起重要作用Treg和Tim-3我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Tim-3信號(hào)通路后，Treg減少T15Tim-3/Tim-3L是新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)Th反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，并且與TLR4信號(hào)通路和Treg密切相關(guān)TLR4信號(hào)通路Treg變化Th反應(yīng)Tim-3/Tim-3LHp致病和疫苗免疫保護(hù)Tim-3/Tim-3L是新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)Th反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，并16我們的研究還發(fā)現(xiàn)Tim-3阻斷提高Hp疫苗的免疫保護(hù)率，但并不降低Hp自然感染小鼠胃黏膜內(nèi)Hp定植密度加劇Hp疫苗接種小鼠和Hp感染小鼠胃黏膜炎癥程度提示Tim-3信號(hào)通路參與Hp感染的免疫致病和Hp疫苗的免疫保護(hù)作用問(wèn)題：Tim-3信號(hào)通路激活，將會(huì)對(duì)Hp感染和Hp疫苗免疫產(chǎn)生何種影響？目前尚不清楚

我們的研究還發(fā)現(xiàn)Tim-3阻斷17體外研究

體內(nèi)研究

研究?jī)?nèi)容體外研究體內(nèi)研究研究?jī)?nèi)容18研究Tim-3信號(hào)通路激活對(duì)Hp感染和Hp疫苗接種小鼠Th1和Th2免疫反應(yīng)、TLR4信號(hào)通路及Treg的影響，以及這些影響對(duì)Hp感染引起的的炎癥反應(yīng)和Hp疫苗免疫保護(hù)作用之間的關(guān)系體內(nèi)研究研究Tim-3信號(hào)通路激活對(duì)Hp感染和Hp疫苗接種小鼠Th119Hp感染和Hp疫苗接種小鼠給予Tim-3L，觀察以下指標(biāo)：小鼠脾細(xì)胞中Tim-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的變化胃黏膜局部Tim-3表達(dá)、Treg和幾個(gè)有代表性的Th1（IFN-γ、LI-12）和Th2（IL-4、IL-10）細(xì)胞因子含量的變化胃黏膜局部TLR4信號(hào)通路的幾個(gè)中間環(huán)節(jié)和下游分子（TLR4、MyD88、NF-κB）的變化。胃黏膜內(nèi)Hp感染、炎癥程度情況觀察指標(biāo)Hp感染和Hp疫苗接種小鼠給予Tim-3L，觀察20淋巴細(xì)胞對(duì)Hp刺激的增殖反應(yīng)Tim-3陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量培養(yǎng)上清液中Th1和Th2細(xì)胞因子含量CD4+效應(yīng)T細(xì)胞中TLR4信號(hào)通路的幾個(gè)中間環(huán)節(jié)和下游分子的變化比較它們與未處理組的差異

體外研究觀察小鼠的脾淋巴細(xì)胞用Tim-3L(Galectin-9)預(yù)處理后與Hp共培養(yǎng)后：

淋巴細(xì)胞對(duì)Hp刺激的增殖反應(yīng)體外研究觀察小鼠的脾淋巴細(xì)胞用21闡明Tim-3信號(hào)通路激活對(duì)Hp感染和Hp疫苗接種小鼠Th1和Th2免疫反應(yīng)、TLR4信號(hào)通路及Treg的影響，以及這些影響對(duì)Hp感染引起的的炎癥反應(yīng)和Hp疫苗免疫保護(hù)作用之間的關(guān)系研究目標(biāo)闡明Tim-3信號(hào)通路激活對(duì)Hp感染和Hp疫苗接種小鼠Th122闡明Hp感染和疫苗接種后Tim-3/Tim-3L信號(hào)通路的變化及與疾病和疫苗保護(hù)機(jī)制的關(guān)系明確通過(guò)對(duì)Tim-3/Tim-3L信號(hào)通路的調(diào)控可否減輕Hp相關(guān)性疾病的嚴(yán)重程度和提高疫苗的免疫保護(hù)作用擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題闡明Hp感染和疫苗接種后Tim-3/Tim-3L信號(hào)通路的變23研究方法和步驟研究方法和步驟24體內(nèi)研究未經(jīng)處理組:①Hp感染組②Hp疫苗組③對(duì)照組Tim3配體處理組：①Hp感染組②Hp疫苗組③對(duì)照組體外研究未經(jīng)處理組：①Hp刺激組②空白組Tim3配體處理組：①Hp刺激組②空白組試驗(yàn)分組體內(nèi)研究試驗(yàn)分組25Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1接種于含7.5%無(wú)菌綿羊血的空腸彎曲菌選擇性培養(yǎng)瓊脂基礎(chǔ)上，微需氧條件下（O25%、CO210%、N285%）37℃培養(yǎng)2-3天

Hp菌液行超聲粉碎后，分別與霍亂毒素（CT）和殼聚糖構(gòu)建以CT和殼聚糖為佐劑的Hp疫苗HP培養(yǎng)及疫苗制備Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1接種于含7.5%無(wú)菌綿羊血的空腸彎曲菌選擇266-8周齡的SPF級(jí)的BALB/C小鼠，給予含109/ml的SS1Hp菌液，0.5ml/只灌胃，隔日1次，共5次。末次灌胃4周后，取10只小鼠處死，取胃黏膜進(jìn)行病理檢查和Hp培養(yǎng)，確定Hp感染模型的建立

Hp感染小鼠模型6-8周齡的SPF級(jí)的BALB/C小鼠，給予含109/ml的276-8周齡的SPF級(jí)的BALB/C小鼠，每只小鼠給予0.5ml含5ugCT和1.2mgHp抗原的PBS或0.5ml含殼聚糖微球-1.2mgHp抗原有效量的PBS，于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次，免疫后4周給予109/ml的SS1Hp菌液，0.5ml/只攻擊小鼠，隔日1次，共4次。末次攻擊后4周處死小鼠，取標(biāo)本檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)Hp疫苗的接種6-8周齡的SPF級(jí)的BALB/C小鼠，每只小鼠給予0.5m28在小鼠Hp接種和疫苗接種的第1周內(nèi)，每天腹腔內(nèi)注射100μgGalectin-9

Galectin-9預(yù)處理在小鼠Hp接種和疫苗接種的第1周內(nèi)，每天腹腔內(nèi)注射100μg29用淋巴細(xì)胞分離液分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，終濃度為500nM/ml的Galectin-9預(yù)處理2h，按細(xì)胞與細(xì)菌比例：1:100、1:200、1:300濃度，共同孵育24-48（3、6、12、24、48）小時(shí)后，測(cè)細(xì)胞的增殖反應(yīng)，并收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)

Hp刺激鼠脾淋巴細(xì)胞用淋巴細(xì)胞分離液分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，終濃度為500nM/ml30采用Westernblot法和免疫組化法檢測(cè)胃黏膜內(nèi)及培養(yǎng)細(xì)胞TLR4、MyD88、NF-κB和Tim-3采用Westernblot法和免疫組化法檢測(cè)胃黏膜內(nèi)Treg采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞及培養(yǎng)細(xì)胞Tim-3陽(yáng)性細(xì)胞采用ELISA法檢測(cè)胃黏膜及培養(yǎng)上清內(nèi)細(xì)胞因子含量采用細(xì)菌培養(yǎng)和組織學(xué)Giemsa染色法檢測(cè)Hp采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)方法檢測(cè)方法31技術(shù)路線流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾內(nèi)Tim3陽(yáng)性細(xì)胞胃粘膜內(nèi)TLR4通路關(guān)鍵分子免疫組化、westernblotBALB/C小鼠未處理組Tim3配體組空白組Hp感染組疫苗組胃粘膜病理及Hp檢測(cè)胃粘膜內(nèi)Th1Th2細(xì)胞因子ELLISA檢測(cè)技術(shù)路線流式細(xì)胞儀檢胃粘膜內(nèi)TLR4BALB/C小鼠未處理組32技術(shù)路線鼠脾淋巴細(xì)胞Tim3配體組未處理組Hp刺激組空白組培養(yǎng)細(xì)胞Tim3陽(yáng)性細(xì)胞流式細(xì)胞儀培養(yǎng)上清Th1Th2細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)TLR4信號(hào)通路分子WesternBlot細(xì)胞增殖試驗(yàn)MTT技術(shù)路線鼠脾淋巴細(xì)胞Tim3配體組未處理組Hp刺激組空白組培33課題選題合理，具有理論基礎(chǔ)課題所采用的技術(shù)均已建立，在技術(shù)上確保了本項(xiàng)目的完成本實(shí)驗(yàn)所需的儀器設(shè)備本單位基本齊全

可行性分析課題選題合理，具有理論基礎(chǔ)可行性分析34計(jì)量資料: ①多個(gè)樣本的比較采用方差分析，當(dāng)方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)②多個(gè)樣本的兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)計(jì)數(shù)資料:采用X2檢驗(yàn)等級(jí)資料：采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。P≤

0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料: 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析35

Tim3/Tim3L信號(hào)通路在Hp感染致病及疫苗免疫中作用研究國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道創(chuàng)新之處Tim3/Tim3L信號(hào)通路在Hp感染致病及疫苗免疫362011.12-2012.02

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，完成綜述2012.03-2012.04

收集資料，完成各項(xiàng)準(zhǔn)備工

作，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)2012.05-2012.12

正式實(shí)驗(yàn)，并檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)2013.01-2013.03

整理數(shù)據(jù)并分析，統(tǒng)計(jì)處

理，完成論文年度計(jì)劃2011.12-2012.02查閱相關(guān)文獻(xiàn)，完成綜述年度37激活Tim3/Tim3L信號(hào)通路可影響Hp感染和Hp疫苗免疫小鼠Th免疫反應(yīng)、TLR4信號(hào)通路及Treg通過(guò)調(diào)節(jié)Tim3/Tim3L信號(hào)通路可影響Hp感染結(jié)局及Hp疫苗免疫效果發(fā)表一篇SCI論文，題目為Tim3/Tim3L信號(hào)通路在幽門螺桿菌免疫致病及疫苗免疫中的作用及機(jī)制

預(yù)期研究結(jié)果激活Tim3/Tim3L信號(hào)通路可影響Hp感染和Hp疫苗免疫38BALB/C小鼠2000元消耗材料費(fèi)8000元WesternBlot20000元抗體