超高壓提取萬壽菊中葉黃素的工藝優(yōu)化

超高壓提取萬壽菊中葉黃素的工藝優(yōu)化

0卜素家族研究黃素是自然界的天然色素。它是一種含有許多飽和雙鍵的推測，因此具有很強的抗氧化性。由于葉黃素用途廣泛,對其研究愈加深入。已研究的提取方法有熱浸提法1學習方法1.1試劑和儀器萬壽菊干花購于河北省安國市御顏坊中藥材有限公司,產(chǎn)地為河北。葉黃素標準品(90%)購于上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇(分析純)、丙酮(分析純)、乙腈(色譜純)和正己烷(分析純)購于天津市致遠化學試劑有限公司;乙酸乙酯(分析純)購于瑞達化工商行化工有限公司;甲醇(色譜純)購于山東禹王實業(yè)有限公司;去離子水為實驗室自制;真空密封袋(16絲)購于河北永賀塑料包裝制品有限公司。1.2儀器與設(shè)備HPP.W1-400/1超高壓設(shè)備:天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司;標準篩60目;2489型高效液相色儀:美國Waters公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:德州市昊誠實驗儀器有限公司;P-290真空封口包裝機:瑞安市貴澤電子商務(wù)商行。1.31.3.1反滲透膜提取t-溶劑法提取萬壽菊干花粉碎后過60目篩。稱取1g粉末于密封袋中,并加入一定體積(料液比為1∶20～1∶120(g/mL))的試劑(氯仿、乙酸乙酯、正己烷、甲醇和乙醇)于密封真空袋,混勻放入提取容器中。調(diào)節(jié)參數(shù)值(提取壓力:50～300MPa;保壓時間:1～6min;提取次數(shù):1～6次)進行提取。取出高壓處理后的料液,抽濾。為獲得提取液中以其他形式存在的葉黃素,對提取液進行皂化。皂化參數(shù)參考孟繁玲等1.3.2真空袋中采用高壓提取提取溶劑對工藝的影響重中之重稱量5份萬壽菊粉末,每份1g,分別加入40mL的氯仿、乙酸乙酯、正己烷、甲醇和乙醇于真空袋中。置于提取容器內(nèi),設(shè)定參數(shù)值:壓力100MPa,循環(huán)3次,保壓時間為3min,進行高壓提取。待處理后得葉黃素提取液。1.3.3單因素試驗設(shè)計經(jīng)預(yù)實驗,將保壓時間、提取壓力、循環(huán)次數(shù)和料液比進行單因素優(yōu)化。具體優(yōu)化考察范圍及水平設(shè)定見表1。1.3.4反應(yīng)域優(yōu)化實驗在上述實驗結(jié)果上,采用響應(yīng)面軟件,進行了4個因素的響應(yīng)面實驗設(shè)計,其參數(shù)見表2。建立數(shù)學模型,以得到最佳工藝。1.3.5傳統(tǒng)提取比較實驗(1)熱提取提取稱量粉末1g,料液比1∶40(g/mL),提取溶劑為乙醇,加熱回流4h,抽濾,皂化處理。得葉黃素提取液(2)從微波超聲的合作中提取的提議稱量粉末1g,料液比1∶40(g/mL),提取溶劑為乙醇,50℃超聲提取0.5h后,抽濾,皂化處理,得葉黃素提取液。1.3.6標準曲線的繪制(1)流動相比例色譜柱選用DiamonsilC18反相柱(200mm×4.6mm×5μm);波長為445nm;流動相比例是甲醇與乙腈的比為80∶20;流動相流速為1.0mL/min;進樣量為10μL(2)葉黃素標準品母液稱量10mg葉黃素標準品于10mL容量瓶中用甲醇溶解并定容,配制質(zhì)量濃度為1mg/mL的葉黃素標準品母液。采用對半稀釋法,配得質(zhì)量濃度為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/mL的葉黃素標準溶液,按照上述HPLC檢測方法進行測定,1.3.7提取率計算按上述處理得到的葉黃素提取液,經(jīng)HPLC法檢測其濃度。葉黃素提取率公式為:2結(jié)果與分析2.1種提取劑提取率的對比本研究對5種提取試劑進行篩選。在同等條件下進行提取,對比不同溶劑對提取實驗結(jié)果的影響,實驗結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,其影響由大到小順序為:氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、正己烷。其中提取率表現(xiàn)最優(yōu)的3種溶劑為氯仿、乙酸乙酯和乙醇,提取率分別為25.64%、23.8%、22.67%,對比這些提取率結(jié)果相差不大。這3種溶劑比較,就有機試劑的毒性而言,乙醇為三者中最小,價格相對便宜且來源廣,易回收可反復(fù)使用2.2料液比及提取次數(shù)對葉黃素提取率的影響按照上述實驗方法,分析了料液比、保壓時間、提取壓力及提取次數(shù)4個因素對萬壽菊中葉黃素提取率的影響。試驗結(jié)果如圖2所示。由圖2(a)可知,在料液比從1∶20(g/mL)提高到1∶120(g/mL),葉黃素提取率隨著料液比的升高呈先升高后趨于平緩。料液比的變化對于提取原料中葉黃素的結(jié)果影響較大,較小的料液比無法將原料中的葉黃素完全提取出來,故在較小料液比時葉黃素的提取率較小。而當料液比1∶80(g/mL)時,料液比足夠大,可將原料中的有效成分完全提取出來,所以在料液比進一步增大時,對提取率的結(jié)果影響不大。故料液比進一步優(yōu)化范圍為1∶60～1∶100(g/mL)。由圖2(b)可知,當保壓時間從1min提高到6min時,葉黃素提取率隨保壓時間的升高呈先升高后幾乎不變。保壓時間5min到6min其結(jié)果不變。保壓期間高壓設(shè)備對物料持續(xù)施加壓力,保壓時間過短,有可能造成提取溶劑對原材料浸潤不充分或細胞有效成分無法擴散到提取溶劑中,但保壓時間過長,則會浪費大量能耗。故選擇保壓時間進一步優(yōu)化范圍為3～5min。由圖2(c)可知,在提取壓力從50MPa提高到300MPa,葉黃素提取率隨著提取壓力的升高呈先升高后趨于平緩。提取壓力150MPa后在升高提取壓力時,葉黃素提取率基本維持穩(wěn)定。這可能是萬壽菊干花粉末質(zhì)地較為細膩、疏松,再經(jīng)歷超高壓處理時葉黃素已擴散至溶劑中。通俗來說,提取壓力越大,提取率越高,但當提取率達到臨界值時,過高的壓力只會造成資源的浪費,且可能導(dǎo)致提取材料結(jié)構(gòu)損壞,影響提取效率。故選擇料液比進一步優(yōu)化范圍為100～200MPa。由圖2(d)可知,在提取次數(shù)從1次提高到6次,葉黃素提取率隨提取次數(shù)的升高呈先升高后稍有降低。提取次數(shù)為3次時,葉黃素提取率達到峰值。隨提取次數(shù)再增加,葉黃素提取率稍有下降,說明提取次數(shù)過多可能對葉黃素結(jié)構(gòu)具有一定的破壞性。故選提取次數(shù)進一步優(yōu)化范圍為2～4次。2.3box-behnken設(shè)計及試驗以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ),利用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理,進行分析試驗,考察料液比(2.3.1實驗結(jié)果擬合回歸方程的建立與顯著性檢驗。利用Design-Expert8.0.6軟件,通過對多項式回歸分析,得到的擬合全變量二次回歸方程模型為:=62.66+5.30根據(jù)建立的模型進行方差分析和顯著性的檢驗,方程顯著性檢驗分析結(jié)果見表4?；貧w模型的2.3.2這兩個因素之間的交叉效應(yīng)圖3為不同因素的交互作用對回收率的影響,響應(yīng)曲面越陡峭,表明該因素對回收率的影響越大2.3.3模型有效性驗證由響應(yīng)面結(jié)果分析,得到的最優(yōu)條件為:料液比為1∶95.21(g/mL),提取次數(shù)為4次,保壓時間為3min,提取壓力為200MPa。在此條件下驗證模型的有效性,并與傳統(tǒng)熱回流法和超聲-微波協(xié)同提取法進行比較,試驗重復(fù)3次。結(jié)果顯示,傳統(tǒng)熱回流法提取率為14.26±0.45mg/g、超聲-微波協(xié)同提取法提取率為9.73±0.66mg/g、超高壓輔助提取葉黃素的提取率為68.57±2.31mg/g。試驗結(jié)果與軟件得出的最優(yōu)預(yù)測值69.38mg/g相近。對比結(jié)果表明,超高壓輔助提取法顯著優(yōu)于傳同回流法和超聲-微波輔助提取法。在所得模型的擬合下程度較