生化分析儀檢測原理課件

臨床生化檢驗(yàn)反應(yīng)原理

及報(bào)告審核檢驗(yàn)科黃小虎臨床生化檢驗(yàn)反應(yīng)原理

及報(bào)告審核檢驗(yàn)科黃小虎1全自動(dòng)生化分析儀全自動(dòng)生化分析儀2生化分析儀特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)亮點(diǎn)自動(dòng)化機(jī)械化的儀器設(shè)備模仿代替手工操作提高了工作效率減少了主觀誤差靈敏準(zhǔn)確快速標(biāo)準(zhǔn)化生化分析儀特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)亮點(diǎn)自動(dòng)化提高了工作效率3生化分析儀分類1按結(jié)構(gòu)原理分管道連續(xù)流動(dòng)式分立式——常用離心式干片式——急診常用2按測定速度分小型中型大型超大型（模塊式）3按自動(dòng)化程度分半自動(dòng)全自動(dòng)生化分析儀分類1按結(jié)構(gòu)原理分2按測定速度分3按自動(dòng)化程度分42004??????生化分析儀主要構(gòu)成加樣系統(tǒng)供排水系統(tǒng)構(gòu)成比色系統(tǒng)光源比色杯單色器檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)樣品轉(zhuǎn)盤試劑倉取樣裝置2004??????生化分析儀主要構(gòu)成加樣系統(tǒng)供排水系5基本原理臨床生化分析儀最常使用的是——分光光度法分光光度法——是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。

基本原理臨床生化分析儀最常使用的是——分光光度法6分光光度計(jì)組成光源樣品池單色器檢測器記錄裝置濾光器分光光度計(jì)組成光源樣品池單色器檢測器記錄裝置濾光器7光吸收曲線溶液對(duì)不同波長光的吸收程度，通常用光吸收曲線來描述。

在分光光度法中,以吸光度為縱坐標(biāo),以波長為橫坐標(biāo)作圖可得光吸收曲線。濃度不同的同種溶液,在該種曲線中其最大吸收波長相同，相應(yīng)的吸光度大小則不同，同一波長下摩爾吸數(shù)相同。光吸收曲線溶液對(duì)不同波長光的吸收程度，通常用光吸收曲線來描述8Lambert-Beer（朗伯-比爾）定律

當(dāng)一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時(shí)，樣品對(duì)光的吸光度與樣品的濃度及厚度成正比

A=kcb

A---吸光度k---吸光系數(shù)c---溶液濃度b---液層厚度Lambert-Beer（朗伯-比爾）定律

當(dāng)一束平行單色光9吸光系數(shù)

定義：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)測得的吸光度。K值的大小取決于吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溶液溫度和溶劑性質(zhì)等，與溶液濃度大小和液層厚度無關(guān)。但K值大小因溶液濃度所采用的單位的不同而異。

吸光系數(shù)

10討論：1.Lamber-Beer定律的適用條件（前提）:入射光為單色光溶液是均勻，無散射溶液2.該定律適用于固體、液體和氣體樣品3.在同一波長下，各組分吸光度具有加和性，如果溶液中同時(shí)存在兩種或兩種以上的吸光性物質(zhì),則測得的該溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物質(zhì)吸光度的總和，即：

A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac應(yīng)用：多組分測定討論：1.Lamber-Beer定律的適用條件（前提11定量分析方法(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比法(3)吸光系數(shù)法定量分析方法(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法12標(biāo)準(zhǔn)曲線法——最經(jīng)典方法

前提：固定儀器和固定條件A=K*BC過程：配置標(biāo)準(zhǔn)溶液系列→分別測定A→得C~A曲線樣品→測定A樣→

查得C樣標(biāo)準(zhǔn)曲線法——最經(jīng)典方法

前提：13標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比法在相同的條件下，配制濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為cx的樣品溶液，在最大吸收波長處，分別測定二者的吸光度值為As、Ax

，依據(jù)朗伯-比爾定律得:As=KbcsAx=Kbcx

則:cx=cs*Ax/AsX標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比法在相同的條件下，配制濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度14吸光系數(shù)法吸光系數(shù)法又稱絕對(duì)法，是直接利用朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式A＝Kbc進(jìn)行計(jì)算的定量分析方法。在手冊(cè)中查出待測物質(zhì)在最大吸收波長處的吸光系數(shù)或,并在相同條件下測量樣品溶液的吸光度A，則其濃度為：

或吸光系數(shù)法吸光系數(shù)法又稱絕對(duì)法，是直接利用朗伯-比爾定律的數(shù)15檢測方法1.終點(diǎn)法

2.固定時(shí)間法3.連續(xù)監(jiān)測法

檢測方法1.終點(diǎn)法16終點(diǎn)法終點(diǎn)分析法是基于反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其對(duì)光吸收強(qiáng)度的大小，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量的一類分析方法。反應(yīng)混合物進(jìn)行一定時(shí)間反應(yīng)后，達(dá)到平衡終點(diǎn)，即在顯色反應(yīng)處于穩(wěn)定階段時(shí)，監(jiān)測其顏色對(duì)光的吸收強(qiáng)度，以此計(jì)算待測物濃度。終點(diǎn)時(shí)間的確認(rèn)：一、根據(jù)時(shí)間-吸光度曲線如:Trinder（偶聯(lián)終點(diǎn)比色法）反應(yīng)測尿酸，反應(yīng)曲線上3-5分鐘時(shí)其A趨向穩(wěn)定,故可將5分鐘作為反應(yīng)終點(diǎn)。二、根據(jù)被測物反應(yīng)終點(diǎn)，結(jié)合干擾物的反應(yīng)情況來確定如:溴甲酚綠法測血清白蛋白

終點(diǎn)法終點(diǎn)分析法是基于反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的17分類終點(diǎn)法：一點(diǎn)終點(diǎn)法二點(diǎn)終點(diǎn)法免疫比濁法雙波長法分類終點(diǎn)法：18一點(diǎn)終點(diǎn)法一點(diǎn)終點(diǎn)法——在時(shí)間-吸光度曲線上吸光度不再改變時(shí)，選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定吸光度值。通常在反應(yīng)終點(diǎn)附近連續(xù)讀兩個(gè)吸光度，求出兩點(diǎn)的平均值，并根據(jù)兩點(diǎn)的差值判斷反應(yīng)是否達(dá)到平衡。一點(diǎn)終點(diǎn)法一點(diǎn)終點(diǎn)法——在時(shí)間-吸光度曲線上吸光度不再改變時(shí)19一點(diǎn)終點(diǎn)法的設(shè)置：以R和S混合之前的空氣空白、水空白或試劑空白的吸光度值為測定計(jì)算基點(diǎn)，以反應(yīng)達(dá)到平衡的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，校準(zhǔn)曲線通過零點(diǎn)且成直線，對(duì)于反應(yīng)速度比較快的實(shí)驗(yàn)多用。多見于單試劑項(xiàng)目，如：總蛋白，白蛋白等。一點(diǎn)終點(diǎn)法的設(shè)置：以R和S混合之前的空氣空白、水空白或試劑空202023/8/1821Am

T（時(shí)間）AS+R(吸光度）一點(diǎn)終點(diǎn)法反應(yīng)曲線

計(jì)算公式：C=(Am-Ab)*KAm----終點(diǎn)讀數(shù)點(diǎn)的吸光Ab----試劑空白吸光度K----校正系數(shù)2023/8/521AmTAS+R(吸光度）一點(diǎn)終點(diǎn)法21TP反應(yīng)曲線蛋白質(zhì)+Cu2+→Cu-蛋白質(zhì)絡(luò)合物550nm處吸收峰TP反應(yīng)曲線蛋白質(zhì)+Cu2+→Cu-蛋白質(zhì)絡(luò)合物5522

二點(diǎn)終點(diǎn)法第二試劑加入以前，選擇某一點(diǎn)讀取吸光度Am，經(jīng)過一定時(shí)間后反應(yīng)達(dá)終點(diǎn)后測第二個(gè)吸光度值A(chǔ)n,利用兩吸光度之差計(jì)算結(jié)果。第一點(diǎn)吸光度值由樣本本身或第一試劑與樣品的非特異性反應(yīng)有關(guān)，相當(dāng)于樣品空白，可有效的消除樣品自身的吸光度，如溶血，黃疸，脂血等的干擾。

二點(diǎn)終點(diǎn)法第二試劑加入以前，選擇某一點(diǎn)讀取吸光度Am，經(jīng)過23AnTAR2AmS+R1(吸光度）（時(shí)間）兩點(diǎn)終點(diǎn)樣本空白=S+R1S+R1+R2（體積校正因子）k0

計(jì)算公式

C=(An-K0*Am)*K

AnTAR2AmS+R1(吸光度）（時(shí)間）兩點(diǎn)終點(diǎn)樣本空白=24CRE反應(yīng)曲線肌酐在一系列酶的作用下生成H2O2，H2O2和4-氨基氨替比林反應(yīng)生成紅色醌類物質(zhì)，在540nm處有吸收峰。CRE反應(yīng)曲線肌酐在一系列酶的作用下生成H2O2，H2O2和25Mg反應(yīng)曲線在堿性溶液中，Mg與二甲苯胺藍(lán)形成重氮鹽類的紫色復(fù)合物，Mg2+濃度可由二甲苯胺藍(lán)吸光度的下降，通過光度測定法來測定。Mg反應(yīng)曲線在堿性溶液中，Mg與二甲苯胺藍(lán)形成重氮鹽類的紫色26免疫比濁法

通過物質(zhì)對(duì)光的散射或透射來測定物質(zhì)含量的方法：散射比濁：特定蛋白分析儀透射比濁：自動(dòng)生化分析儀通常作兩點(diǎn)終點(diǎn)法分析，多采用多點(diǎn)校準(zhǔn)。應(yīng)用：用Ab測定Ag（主要為微量蛋白：IG、C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab過量，此時(shí)Ag-Ab復(fù)合物的生成量隨Ag的增加而遞增，光散/透射強(qiáng)度與抗原量成正比。免疫比濁法通過物質(zhì)對(duì)光的散射或透射來測定物質(zhì)含量的27免疫比濁法優(yōu)點(diǎn)：方法簡便結(jié)果準(zhǔn)確可用于自動(dòng)化儀器檢測缺點(diǎn)：抗體用量大達(dá)平衡時(shí)間長免疫比濁法優(yōu)點(diǎn)：方法簡便28雙波長法

消除樣品中對(duì)測定有干擾的物質(zhì)的影響；在試樣中含有兩個(gè)組分a和b時(shí)，若要測定組分b,組分a有干擾，應(yīng)設(shè)法消除組分a的吸收干擾。首先選擇待測組分b的最大吸收波長λ1作為測量波長，然后用作圖的方法選擇參比波長λ2，使組分a在這兩個(gè)波長處的吸光度相等。試樣溶液在λ2和λ1兩個(gè)波長處的吸光度之差，只與待測組分的濃度成正比，而與干擾組分的濃度無關(guān)雙波長法消除樣品中對(duì)測定有干擾的物質(zhì)的影響；試樣溶29干擾物質(zhì)1.脂血：吸收光譜300--600nm呈下降趨勢2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm吸收峰3.膽紅素：300--500nm有吸收峰可見它們的吸收峰都較寬，且同測定波長有重疊現(xiàn)象。干擾物質(zhì)1.脂血：吸收光譜300--600nm呈下降趨勢30雙波長法雙波長測定優(yōu)點(diǎn)：

①消除噪音干擾②減少雜散光影響③減少樣品本身光吸收的干擾

雙波長法雙波長測定優(yōu)點(diǎn)：31固定時(shí)間法指在時(shí)間-吸光度曲線上選擇兩個(gè)測光點(diǎn)，這兩點(diǎn)既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點(diǎn)吸光度，利用這兩點(diǎn)吸光度差值計(jì)算結(jié)果。如：苦味酸法測肌酐計(jì)算公式：

C=(A2-A1)*KA1A2·●T(吸光度）●固定時(shí)間法指在時(shí)間-吸光度曲線上選擇兩個(gè)測光點(diǎn)，這兩點(diǎn)既32

測定底物的消耗或產(chǎn)物生成的速度的化學(xué)方法稱為連續(xù)監(jiān)測法（又稱動(dòng)態(tài)分析法、速率法或動(dòng)力學(xué)法）。在反應(yīng)速度恒定期（零級(jí)反應(yīng)期）來連續(xù)觀察和記錄一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)底物或產(chǎn)物量的變化。通過測定一段時(shí)間內(nèi)吸光度的變化速率（△A/min）來計(jì)算待測物的濃度。

酶活性測定如（ALT、AST、ALP、GGT等）常用連續(xù)監(jiān)測法（速率法）測定底物的消耗或產(chǎn)物生成的速度的化學(xué)方法稱為33酶促反應(yīng)曲線酶促反應(yīng)曲線34連續(xù)監(jiān)測法即零級(jí)反應(yīng)速率法,亦稱斜率法在較長反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi)(90-180秒)，每隔一定時(shí)間(5~30秒)讀取一次吸光度值，至少讀取4點(diǎn)，得到3個(gè)以上△A，最后算出反應(yīng)速率△A/min。連續(xù)監(jiān)測法即零級(jí)反應(yīng)速率法,亦稱斜率法35生化分析儀檢測原理ppt課件36酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線372023/8/1838A1TAS+R1R2A2(吸光度）（時(shí)間）連續(xù)監(jiān)測法A/min=[(A2-A1)-(空白)]/(t2-t1)t2t12023/8/538A1TAS+R1R2A2(吸光度）（時(shí)間38連續(xù)監(jiān)測法特點(diǎn)與固定時(shí)間法相比，屬于即時(shí)觀測，無需停止酶促反應(yīng)、不需添加其他呈色試劑，且可將多點(diǎn)的測定結(jié)果繪圖連線，快速、直觀查看酶促反應(yīng)進(jìn)程，很容易找到呈直線的線性期，檢查到是否偏離零級(jí)反應(yīng)。連續(xù)監(jiān)測法特點(diǎn)與固定時(shí)間法相比，屬于即時(shí)觀測，無需停止酶39典型酶聯(lián)法反應(yīng)曲線典型酶聯(lián)法反應(yīng)曲線40ALT反應(yīng)曲線ALT反應(yīng)曲線41AMY反應(yīng)曲線AMY反應(yīng)曲線42生化結(jié)果報(bào)告審核責(zé)任心不強(qiáng)，未對(duì)結(jié)果進(jìn)行認(rèn)真審核對(duì)檢測儀器或試劑方法學(xué)不夠了解工作經(jīng)驗(yàn)不足對(duì)儀器檢測的結(jié)果及室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果過于相信生化結(jié)果報(bào)告審核431.結(jié)合質(zhì)控判斷結(jié)果在控在控GLO=TP—ALB偏高1.結(jié)合質(zhì)控判斷結(jié)果在控在控GLO=TP—ALB偏高442.結(jié)合臨床資料審核結(jié)合病人的性別、年齡、臨床診斷、其他檢查結(jié)果審核

例：某病人檢測的TP為110g/L，該標(biāo)本沒有脂血等影響檢測結(jié)果的因素臨床診斷：多發(fā)性骨髓瘤

另：胰島素與低血糖、病人輸注藥物對(duì)結(jié)果的影響2.結(jié)合臨床資料審核結(jié)合病人的性別、年齡、臨床診斷、其他檢查45檢驗(yàn)項(xiàng)目間的內(nèi)在聯(lián)系各檢測參數(shù)間存在大小、比例、邏輯關(guān)系例：TC>HDL-C+LDL-C、TBI>DBICK>CK-MB

LDH>α-HBDH檢驗(yàn)項(xiàng)目間的內(nèi)在聯(lián)系各檢測參數(shù)間存在大小、比例、邏輯關(guān)系46影響檢驗(yàn)結(jié)果的因素

試劑線性范圍：

了解檢驗(yàn)項(xiàng)目試劑的線性范圍，對(duì)超過或低于范圍的項(xiàng)目，必須進(jìn)行相應(yīng)的減量稀釋或增量后重新測定。影響檢驗(yàn)結(jié)果的因素試劑線性范圍：47線性范圍

在實(shí)際工作中，用連續(xù)監(jiān)測法會(huì)遇到檢驗(yàn)結(jié)果為0或者負(fù)值的情況，此時(shí)不能盲目相信該結(jié)果低就出具低值報(bào)告，應(yīng)查看其反應(yīng)曲線例：某病人的尿液AMY檢測結(jié)果為0U/L其反應(yīng)曲線如下圖：線性范圍在實(shí)際工作中，用連續(xù)監(jiān)測法會(huì)遇到檢驗(yàn)結(jié)果48AMY反應(yīng)曲線AMY反應(yīng)曲線49AMY反應(yīng)曲線分析分析：由于測定物質(zhì)濃度過高處理：對(duì)測定物質(zhì)進(jìn)行十倍左右的稀釋再測定，直到反應(yīng)曲線恢復(fù)正常結(jié)果才可靠AMY反應(yīng)曲線分析分析：由于測定物質(zhì)濃度過高50AMY反應(yīng)曲線AMY反應(yīng)曲線51AMY反應(yīng)曲線第一次稀釋后AMY反應(yīng)曲線第一次稀釋后52檢測項(xiàng)目的方法學(xué)

分析：CK是由M和B兩類亞基組成的二聚體，其構(gòu)成為CK-MB(心型)約占0-3%、CK-MM(肌型)約占97-100%、CK-BB（腦型）約占0-1%

檢測項(xiàng)目的方法學(xué)分析：CK是由M和B兩類亞基53影響檢驗(yàn)結(jié)果的因素檢測項(xiàng)目的方法學(xué)：要了解該項(xiàng)目試劑采用的方法學(xué)：例：某病人在測定心肌酶譜時(shí)，其CK:246U/L、CK-MB:286U/L，標(biāo)本無溶血等因素影響,其結(jié)果中CK-MB﹥CK影響檢驗(yàn)結(jié)果的因素檢測項(xiàng)目的方法學(xué)：54CK-MB采用的檢測方法為免疫抑制法正常人體中，CK同工酶中CK-MM﹥CK-MB﹥CK-BB,其中CK-BB含量極少，可忽略。免疫抑制法正是建立于忽略CK-BB的基礎(chǔ)上。采用抗體抑制其M亞基活性，使CK-MM失去活性，而CK-MB失去一半的活性。單測定B亞基的活性，其結(jié)果×2即為CK-MB活性。由于在患輕度或中度腦損傷、腦血管意外及腦手術(shù)后造成腦組織發(fā)生實(shí)質(zhì)性損害的病人中，CK-BB會(huì)升高，這時(shí)該方法測定的CK-MB的活性相當(dāng)于是CK-MB+2CK-BB的活性之