基于金釵石斛麥冬提取物的保濕功效評(píng)價(jià)

基于金釵石斛麥冬提取物的保濕功效評(píng)價(jià)

中醫(yī)認(rèn)為，皮膚干燥、粗糙、無(wú)光等問(wèn)題主要是由于肝腎陰虛、干熱癥氣、肺脾功能喪失以及面部缺乏潤(rùn)養(yǎng)。金釵石斛（Dendrobiumnobile）具有滋陰清熱、養(yǎng)胃生津、潤(rùn)肺止咳、益腎明目作用，且其氣味輕清、甘滋輕靈、補(bǔ)而不膩，可以兼顧脾胃運(yùn)化水液不足之弊端。麥冬（Ophiopogonjaponicas）則能養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心，被用于治療熱傷津液等。二者配合，藥性協(xié)調(diào)而平和，滋陰潤(rùn)燥之力更勝。研究表明，水通道蛋白3(Aquaporin3,AQP3）負(fù)責(zé)水、甘油及尿素等物質(zhì)的運(yùn)輸，其在保持表皮水合作用方面發(fā)揮重要作用，AQP表達(dá)量的變化、功能缺失可以影響皮膚屏障和導(dǎo)致皮膚干燥、彈性下降等皮膚損傷筆者通過(guò)體外培養(yǎng)永生化人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）、熒光定量PCR的方法對(duì)兩者及其復(fù)配提取物的保濕功效進(jìn)行研究，為其在化妝品中的應(yīng)用提供依據(jù)。1試驗(yàn)部分1.1表皮細(xì)胞管理策略金釵石斛、麥冬（上海華宇藥業(yè)有限公司）；永生化人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT，博溪生物科技有限公司）；試驗(yàn)用水為去離子水；KcGrowth表皮細(xì)胞培養(yǎng)液（博溪生物科技有限公司）；PBS、MTT、DMSO、RNA提取試劑盒（Takara）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）；熒光染料（Takara）。CO1.2測(cè)試方法1.2.1金瓣石斛濃縮液的制備稱取金釵石斛100g，以10倍質(zhì)量去離子水煎煮提取2次，每次1h，濃縮處理，加入3倍體積的95%乙醇醇沉，過(guò)濾，取沉淀物定容至100g，即得金釵石斛濃縮液，生藥質(zhì)量濃度1g/mL；取麥冬100g，以10倍質(zhì)量去離子水煎煮提取2次，每次1h，濃縮，加入3倍體積的95%乙醇醇沉，然后過(guò)濾，取濾液定容至100g，即得麥冬濃縮液，生藥質(zhì)量濃度1g/mL；稱取金釵石斛濃縮液與麥冬濃縮液，以質(zhì)量比1︰1、4︰3和3︰4復(fù)配，得到相對(duì)應(yīng)的金釵石斛麥冬復(fù)配提取物，生藥質(zhì)量濃度1g/mL。1.2.2金飾石斛、天麻及其復(fù)配提取物的配制將HaCaT細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化后接種至96孔板，制備成細(xì)胞懸液。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用培養(yǎng)液稀釋配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%、2%、0.4%、0.08%、0.016%、0.0032%、0.00064%和0.00013%）的金釵石斛、麥冬及其復(fù)配提取物。待細(xì)胞鋪板率達(dá)到40%時(shí)進(jìn)行給藥，試驗(yàn)組加入不同濃度金釵石斛、麥冬及其復(fù)配提取物，調(diào)零孔（空白培養(yǎng)基對(duì)照）加入新鮮培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)板放置在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO1.2.3冬及其復(fù)配提取物形態(tài)學(xué)試驗(yàn)濃度根據(jù)實(shí)際檢測(cè)的細(xì)胞毒性結(jié)果，確定金釵石斛、麥冬及其復(fù)配提取物形態(tài)學(xué)試驗(yàn)濃度。設(shè)立給藥組與對(duì)照組，每組設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，按相應(yīng)的接種密度接種細(xì)胞至24孔板中，37℃孵箱（體積分?jǐn)?shù)5%CO1.2.4哈干因皮膚潮濕而對(duì)皮膚移植的分析將細(xì)胞以1.5×101.2.5統(tǒng)計(jì)處理比較試驗(yàn)結(jié)果采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用MicrosoftExcel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著性差異。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果采用22結(jié)果與討論2.1金瓣石斛/線性早熟-內(nèi)酰胺提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞活性的影響取不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的金釵石斛、麥冬及兩者復(fù)配提取物分別處理HaCaT細(xì)胞24h后，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)，金釵石斛提取物、質(zhì)量比1︰1和4︰3的金釵石斛/麥冬復(fù)配提取物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%、0.08%、0.016%、0.0032%、0.00064%和0.00013%時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響（P>0.05）。麥冬提取物和質(zhì)量比3︰4的金釵石斛/麥冬復(fù)配提取物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.08%、0.016%、0.0032%、0.00064%和0.00013%時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響（P>0.05）。參考MTT試驗(yàn)結(jié)果，選擇相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)。從圖1～圖5的試驗(yàn)結(jié)果照片可見，金釵石斛、麥冬和3種配比的金釵石斛/麥冬復(fù)配提取物均從質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%開始，對(duì)細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯影響，包括細(xì)胞的大小、形狀結(jié)構(gòu)、數(shù)量等均無(wú)明顯改變。2.2金瓣石斛/天麻紅外包的保濕功效基于HaCaT細(xì)胞活性影響試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)HaCaT細(xì)胞活性和形態(tài)均無(wú)明顯影響的質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件，同時(shí)兼顧今后配方中添加應(yīng)用的可行性，試驗(yàn)最終分別采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.05%和0.01%處理細(xì)胞，對(duì)AQP3、FLG和CAS14的mRNA表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。AQP3對(duì)皮膚水合及屏障功能也起著重要作用，表皮細(xì)胞之間的水通道蛋白構(gòu)成了細(xì)胞間水分輸送的主要通路FLG參與人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞終末分化時(shí)細(xì)胞間交叉聯(lián)結(jié)膜的形成，隨著角質(zhì)細(xì)胞成熟脫水，F(xiàn)LG分解生成大量的天然保濕因子，這對(duì)保持皮膚的水合作用和皮膚屏障十分重要CAS14具有組織特異性，是調(diào)節(jié)proFLG(Profilaggrin）去磷酸化成為FLG的關(guān)鍵酶，主要在維持表皮的穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用圖10列出了金釵石斛/麥冬（質(zhì)量比4︰3）復(fù)配提取物對(duì)保濕相關(guān)基因表達(dá)影響PCR結(jié)果。從圖10可以看出，質(zhì)量比4︰3金釵石斛/麥冬復(fù)配提取物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%時(shí)，對(duì)FLG、CAS14、AQP3的mRNA表達(dá)均有顯著提升作用（P<0.05或0.01）。這一結(jié)果，同樣說(shuō)明了中藥配伍所帶來(lái)的成分變化和協(xié)同增效的作用，且配伍時(shí)藥物之間比例的變化，也會(huì)導(dǎo)致功效的差異以往研究證實(shí)，金釵石斛與麥冬提取物均具有較好的保濕性能，這與本試驗(yàn)結(jié)果是一致的。所有試驗(yàn)結(jié)果不僅證實(shí)了這兩種提取物以及兩者復(fù)配物的保濕作用，且從對(duì)皮膚保濕相關(guān)基因表達(dá)的影響方面探究了其保濕的機(jī)理。金釵石斛、麥冬單味藥的提取物，僅表現(xiàn)出對(duì)AQP3的促進(jìn)作用，但將兩者以不同比例復(fù)配后，對(duì)基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控就發(fā)生了改變，包括所影響基因種類的差異、上下調(diào)的改變和影響程度的變化，比如以質(zhì)量比1︰1復(fù)配的提取物對(duì)CAS14的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)的作用，而質(zhì)量比3︰4復(fù)配物則表現(xiàn)為顯著的上調(diào)作用；質(zhì)量比4︰3復(fù)配物則對(duì)AQP3、FLG和CAS14三個(gè)基因的mRNA均有顯著上調(diào)作用。這都提示了中草藥配伍對(duì)于功效活性方面的影響，因?yàn)橹兴幨亲裱嗅t(yī)理論配伍，在合適的劑量配比之下，協(xié)同發(fā)揮作用3cas14基因表達(dá)水平的變化基因表達(dá)研究顯示，金釵石斛、麥冬單藥能夠上調(diào)AQP3的mRNA表達(dá)，兩者的復(fù)配提取物則表現(xiàn)出不同的調(diào)控作用，質(zhì)量比1︰1復(fù)配物表現(xiàn)出對(duì)AQP3和FLG的促進(jìn)作用，質(zhì)量比