E.coli中的Y家族DNA聚合酶

PAGEPAGE9E.coli中的Y家族DNA聚合酶—PolⅣ和PolV（2023版）曲競超摘要：PolⅣ和PolV作為E.coli中的Y家族DNA聚合酶，分別由dinB和umuDC基因編碼。由于其特殊結(jié)構(gòu)，PolⅣ和PolV可對帶有非編碼損傷的DNA進(jìn)行移損合成。移損合成作為一種損傷耐受機(jī)制，可在DNA損傷暫時(shí)未被修復(fù)的情況下保持DNA復(fù)制的連續(xù)性和基因組的完整性，但保真度相較同作為損傷耐受機(jī)制的依賴于同源重組的后復(fù)制缺口修復(fù)和復(fù)制叉回退明顯偏低。除移損合成外，PolⅣ和PolV還在其它多種不同的生化過程中發(fā)揮作用，并具有多重生理功能。本文將結(jié)合現(xiàn)有的有關(guān)實(shí)驗(yàn)和研究成果，對E.coli中的Y家族DNA聚合酶（PolⅣ和PolV）進(jìn)行比較全面和系統(tǒng)的介紹。概述。1999年，J·瓦格納等人（1）和M·F·古德曼等人（2）先后通過有關(guān)實(shí)驗(yàn)，在E.coli中鑒定了屬于Y家族（3）的DNA聚合酶Ⅳ（PolⅣ）和DNA聚合酶V（PolV）。PolⅣ和PolV分別由dinB基因和umuDC基因編碼（1）（2）（4），（在靜止期和對數(shù)期細(xì)胞中）其表達(dá)均受SOS反應(yīng)正調(diào)控。PolⅣ可直接合成并具有活性，在E.coli細(xì)胞中的本底水平為250拷貝（5）（注：PolⅢ的水平僅為10-20拷貝（6）），僅次于PolⅠ（400拷貝）；在SOS反應(yīng)早期，dinB基因激活表達(dá)，PolⅣ的細(xì)胞水平可提升至2500拷貝（5）（7）。在靜止期細(xì)胞中，PolⅣ的表達(dá)除可受SOS反應(yīng)調(diào)控外，還受到RpoS反應(yīng)的正調(diào)控；RpoS反應(yīng)對PolⅣ的正調(diào)控發(fā)生于靜止期晚期，且完全不能歸結(jié)于（或者說，完全不通過）SOS反應(yīng)（4）。除表達(dá)外，在靜止期細(xì)胞中，PolⅣ還在蛋白穩(wěn)定性和活性方面分別受到GroE（8）和Rep(9)蛋白的正調(diào)控，而RpoS（4）和Ppk（10）蛋白也可能對PolⅣ的活性具有正調(diào)控作用。在對數(shù)期細(xì)胞中，RpoS雖不影響PolⅣ的表達(dá)，但可間接（通過SbcCD和RecB等蛋白）影響（上調(diào)）PolⅣ的活性（包括致變性[僅當(dāng)PolⅣ過量表達(dá)時(shí)]和移損合成活性）（11）（12）。PolV的合成過程十分復(fù)雜：由umuDC操縱子編碼的UmuD蛋白須在被Lon蛋白降解前經(jīng)RecA*催化自裂解，形成（在SOS反應(yīng)中具有致變活性的）UmuD'蛋白，繼而2個(gè)UmuD'蛋白和1個(gè)UmuC蛋白必須在被ClpXP和Lon蛋白降解前結(jié)合，以形成穩(wěn)定的UmuD'2UmuC復(fù)合物（UmuD'2C）——PolV（2）（13）（14）。PolV的表達(dá)受SOS反應(yīng)的正調(diào)控（15）。在沒有SOS反應(yīng)開啟的情況下，UmuC和UmuD的細(xì)胞含量分別為15和180拷貝，PolV則（由于UmuD'的缺乏）處于無法通過Western印記雜交分析被檢測到的水平；在SOS反應(yīng)開啟后且在SOS反應(yīng)晚期（SOS反應(yīng)開啟約30分鐘后[該時(shí)間可能由于實(shí)驗(yàn)條件的不同而有所差別]），umuDC基因激活表達(dá)，UmuC和UmuD的細(xì)胞含量分別提升至200和2400拷貝，PolV的細(xì)胞含量則提升至15-60拷貝（15-19）。在經(jīng)紫外照射的細(xì)胞中，除SOS反應(yīng)外，PolV的細(xì)胞含量還受到GroE的正調(diào)控（GroE可與UmuC直接相互作用，從而保護(hù)其不受Lon的降解。）（20），而Ppk也可能對PolV的細(xì)胞含量或活性具有正調(diào)控作用（10）。PolV自身僅具有非常微弱的DNA合成活性，其DNA復(fù)制功能的有效發(fā)揮需要其它因子的輔助（見下文“PolV的TLS”和“PolV參與的后復(fù)制缺口修復(fù)和RecA振動(dòng)模型”）。注：①根據(jù)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)之間的相似性，DNA聚合酶被歸于不同的家族。PolI、PolⅡ和PolⅢ被分別歸于A、B、C家族。PolⅣ和PolV被歸于Y家族，它們彼此相似，但與其它已知家族的DNA聚合酶均無相似性。（15）②UmuD的自裂解（即去除N末端的24個(gè)氨基酸殘基）需由RecA*催化；RecA*催化UmuD自裂解的機(jī)制與其催化LexA（與UmuD具有同源性）自裂解的機(jī)制相似，但效率要低很多，從而使得UmuD'在SOS反應(yīng)開啟約45分鐘后才開始積累。（19）③Lon可快速降解UmuC和UmuD，但難以降解UmuD'；在體內(nèi)，UmuD和UmuD'最初都以同二聚體的形式存在——UmuD2和UmuD'2，但同時(shí)存在的UmuD2和UmuD'2會(huì)快速的彼此交換亞基從而形成異二聚體——UmuDUmuD'，在其中，由UmuD介導(dǎo)，UmuD'會(huì)特異性的被ClpXP降解。（13）（14）④現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在E.coli菌株FC40進(jìn)入靜止期約10小時(shí)后，PolⅣ的細(xì)胞水平在RpoS的正調(diào)控下提高約3倍（在此之前，PolⅣ在靜止期FC40中的水平與其在對數(shù)期FC40中的水平基本相同。），且（在RpoS的細(xì)胞水平和活性基本保持穩(wěn)定的情況下，）這種高水平會(huì)維持至少3天(4)(21)。如果RpoS缺失（RpoS-），PolⅣ會(huì)快速減少，從而使得：在進(jìn)入靜止期48小時(shí)后，PolⅣ在RpoS-菌株中的數(shù)量比在野生型FC40中低30-50倍(4)(21)。PolⅣ并不穩(wěn)定，但RpoS對PolⅣ的穩(wěn)定性沒有影響，因而在靜止期，PolⅣ要保持高水平需要dinB基因在RpoS調(diào)控下的持續(xù)轉(zhuǎn)錄(21)。PolⅣ和PolV的結(jié)構(gòu)特性。與E.coli的其它三種DNA聚合酶”（PolI、PolⅡ和PolⅢ）相同，PolⅣ和PolV亦包含手指、拇指和手掌結(jié)構(gòu)域（均隸屬于N末端的聚合酶催化核心結(jié)構(gòu)域），但不同的是：由于其手指和拇指結(jié)構(gòu)域明顯較小，PolⅣ和PolV擁有開放和廣闊的DNA結(jié)合域，可使帶有巨大結(jié)構(gòu)性損傷的DNA進(jìn)入其催化活性中心。此外，PolⅣ和PolV在其C末端還有獨(dú)特的第四個(gè)結(jié)構(gòu)域——小指結(jié)構(gòu)域（或稱聚合酶輔助結(jié)構(gòu)域）。該結(jié)構(gòu)域可以固定DNA底物并使之朝向拇指結(jié)構(gòu)域，也可與其它輔因子（如β滑動(dòng)夾蛋白）相互作用共同調(diào)節(jié)DNA的合成。（22）-（24）PolⅣ和PolV進(jìn)行移損合成的方式及場景。憑借其獨(dú)特結(jié)構(gòu)，PolⅣ和PolV可對帶有非編碼損傷的DNA進(jìn)行移損合成（translesionsynthesis，TLS），具體方式為：“通過延伸在DNA損傷處形成的鏈滑移中間體跳過模板鏈上的DNA損傷”（PolⅣ傾向于此種方式）或“在模板鏈的DNA損傷處向合成鏈插入核苷酸（不依賴于堿基配對但仍具有模板依賴性），并對新形成的引物末端進(jìn)行延伸（PolV傾向于此種方式）”。PolⅣ和PolV因此可被稱為E.coli中的TLS聚合酶。根據(jù)現(xiàn)有的有關(guān)試驗(yàn)結(jié)果，在正常的復(fù)制過程中，當(dāng)遇到存在于先導(dǎo)鏈或后隨鏈模板上的DNA損傷時(shí),復(fù)制叉至少會(huì)有兩種可能涉及TLS的表現(xiàn):一種是越過DNA損傷繼續(xù)前行（需要依賴于DnaG的復(fù)制重啟）,從而在身后留下一段包含DNA損傷的子鏈缺口（平均長度為800nt[約為E.coli中岡崎片段平均長度的一半]，亦被稱為“后復(fù)制缺口”[post-replicativegaps]）;另一種（發(fā)生于DNA損傷存在于先導(dǎo)鏈模板時(shí)）是陷于停滯（先導(dǎo)鏈DNA聚合酶[PolⅢ]會(huì)停止于DNA損傷前1nt處，或在DNA損傷上游空轉(zhuǎn)，對新生鏈3'端反復(fù)進(jìn)行[少量DNA的]降解與合成，DNA解旋酶DnaB和后隨鏈復(fù)制則會(huì)超過DNA損傷位點(diǎn)繼續(xù)向前進(jìn)行一段距離，從而在DNA損傷下游形成一段DNA單鏈區(qū)。）。在前一種情況中，PolⅣ或PolV可憑借其TLS功能修復(fù)子鏈缺口——后復(fù)制TLS（E.coli亦可通過由RecA介導(dǎo)的切除修復(fù)[需要UvrABC]或同源重組[需要Holliday連接體的形成和拆分]修復(fù)子鏈缺口。這兩種路徑可統(tǒng)稱為同源依賴性缺口修復(fù)[homologydependentgaprepair--HDGR]。在通過同源重組修復(fù)子鏈缺口的過程中，DNA損傷可能不會(huì)被修復(fù)，而需要在后續(xù)的修復(fù)過程中得到解決。）；在后一種情況中，PolⅣ或PolV可憑借其TLS功能幫助復(fù)制叉通過DNA損傷繼續(xù)前行——復(fù)制中TLS（E.coli亦可通過復(fù)制叉回退[forkregression--FR，需要RecA]重啟復(fù)制過程。其間，DNA損傷可能不會(huì)被修復(fù)，而需要在后續(xù)的修復(fù)過程中得到解決。）。在這兩種情況中，通過TLS，基因組的完整性和DNA復(fù)制的連貫性分別得以保持，但DNA損傷依然存在，需要在后續(xù)的修復(fù)過程中得到解決，因而TLS（以及HDGR和FR）被認(rèn)為是一種“損傷耐受機(jī)制（路徑）”，簡稱DT機(jī)制（路徑）-DamageToleranceMechanism（Pathway）。（15）（17）（18）（25-36）注：①“非編碼損傷”（noncodingorreplication-blockinglesions）是指對DNA復(fù)制構(gòu)成明顯阻礙的DNA損傷。那些對DNA復(fù)制沒有明顯阻礙但可導(dǎo)致點(diǎn)突變率顯著提升的DNA損傷被稱為“錯(cuò)碼損傷”（miscodinglesions）。（15）本文在討論TLS時(shí)，只涉及“非編碼損傷”。②當(dāng)遇到后隨鏈模板上的DNA損傷時(shí)，復(fù)制叉會(huì)幾乎沒有停頓的越過DNA損傷繼續(xù)前行，并在身后的后隨鏈上留下一段包含DNA損傷的子鏈缺口。當(dāng)遇到先導(dǎo)鏈模板上的DNA損傷時(shí)，復(fù)制叉會(huì)陷于停滯，其重啟可通過三條路徑實(shí)現(xiàn)：（一）復(fù)制體直接越過DNA損傷在下游重啟DNA復(fù)制；若復(fù)制體解體，則可通過PriC路徑在下游實(shí)現(xiàn)復(fù)制體的重新組裝和DNA復(fù)制的重啟（無論如何，DnaG都是必需的；在重啟的復(fù)制叉身后，會(huì)在先導(dǎo)鏈上形成一段包含DNA損傷的子鏈缺口。）。（二）憑TLS聚合酶直接通過DNA損傷。（三）復(fù)制叉回退。③現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，HDGR和TLS是具有競爭關(guān)系的兩條路徑,它們之間的競爭進(jìn)而對它們的調(diào)控發(fā)生于HDGR的聯(lián)會(huì)前階段（抑制子鏈缺口的擴(kuò)展或RecA蛋白絲在子鏈缺口處的組裝可同時(shí)導(dǎo)致HDGR的減少和TLS的增加）。（118）此外，這兩條路徑的配比還受DNA損傷的性質(zhì)和SOS反應(yīng)等因素的影響。（118）（119）④R·P·?？怂沟热苏J(rèn)為：PolⅣ和PolV對后復(fù)制缺口的修復(fù)需要與PolⅠ、PolⅡ或PolⅢ共同完成。主要原因有三：（一）后復(fù)制缺口的平均長度為800nt，遠(yuǎn)超PolⅣ和PolV在進(jìn)行TLS和正常DNA復(fù)制時(shí)的延伸能力（見下文“PolⅣ和PolV的DNA合成速度和延伸能力”）；（二）PolsⅠ-V與后復(fù)制缺口中的空置模板/引物接頭的結(jié)合是隨機(jī)的，且遵循經(jīng)典的質(zhì)量作用定律；（三）PolⅣ和PolV自身對模板/引物接頭的親和力很低，從而與模板/引物接頭的結(jié)合極不穩(wěn)定，其DNA復(fù)制需要β滑動(dòng)夾的輔助。因此，PolⅣ和PolV對后復(fù)制缺口的修復(fù)主要包括兩個(gè)階段：由PolⅣ或PolV催化的“TLS階段”和有PolⅠ、PolⅡ或PolⅢ參與的“后TLS階段”。（見下文“PolⅣ參與的后復(fù)制缺口修復(fù)”和“PolV參與的后復(fù)制缺口修復(fù)和RecA振動(dòng)模型”）PolⅣ的TLS。根據(jù)“工具帶模型”（toolbeltmodel）和現(xiàn)有的有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（37-43），在復(fù)制叉處，PolⅣ的TLS需要β滑動(dòng)夾的輔助和調(diào)控：PolⅣ可通過小指結(jié)構(gòu)域與β滑動(dòng)夾的邊緣位點(diǎn)（鄰近β滑動(dòng)夾的二聚體界面和疏水裂隙）接觸，并與PolⅢ的ε亞基競爭β滑動(dòng)夾的疏水裂隙；通過（以非活化構(gòu)象）先后占據(jù)β滑動(dòng)夾的邊緣位點(diǎn)和ε疏水裂隙，PolⅣ可在復(fù)制過程中遇到PolⅢ不能通過的DNA損傷時(shí)迅速取代PolⅢ進(jìn)行TLS（該過程受到PolⅢ的ε亞基與β滑動(dòng)夾的疏水裂隙間的動(dòng)態(tài)相互作用的限制[見下文]，且除需要PolⅣ與β滑動(dòng)夾的邊緣位點(diǎn)和疏水裂隙的接觸外，還[至少在SOS反應(yīng)條件下]需要PolⅣ和PolⅢ之間的相互作用（37）（39）（40）（43）。此外，至少在體外，對PolⅣ的復(fù)制而言，在占據(jù)β滑動(dòng)夾的疏水裂隙后，它與β滑動(dòng)夾的邊緣位點(diǎn)的接觸便不再必要（40）。）。在完成TLS后，由于PolⅣ的延伸能力較低，PolⅢ會(huì)快速取代PolⅣ繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制，而在此之前，PolⅢ可能以非活化構(gòu)象結(jié)合于β滑動(dòng)夾的ɑ疏水裂隙，也可能脫離β滑動(dòng)夾但（由于PolⅢα-DnaXτ-DnaB相互作用）仍存在于復(fù)制體中。注：①首先，β滑動(dòng)夾是一包含兩個(gè)原聚體的同源二聚體，其每個(gè)原聚體都有一個(gè)疏水裂隙（即滑動(dòng)夾結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)）；PolⅢ擁有ɑεθ三個(gè)亞基，并在其（具有DNA復(fù)制活性的）ɑ亞基和（具有校對核酸外切酶活性的）ε亞基內(nèi)分別具有一強(qiáng)一弱兩個(gè)滑動(dòng)夾結(jié)合基序（CBM）。在進(jìn)行性復(fù)制過程中，PolⅢ的兩個(gè)CBM會(huì)同時(shí)結(jié)合于β滑動(dòng)夾的兩個(gè)（完全相同的）疏水裂隙（38）（與PolⅢ的ɑ和ε亞基結(jié)合的疏水裂隙可被相應(yīng)的記為ɑ疏水裂隙和ε疏水裂隙）。其次，與PolⅢ的ɑ亞基相比，PolⅢ的ε亞基對β滑動(dòng)夾疏水裂隙的親和力要弱約250倍，因而會(huì)在進(jìn)行性復(fù)制過程中頻繁脫離疏水裂隙（39），這為PolⅣ與ε疏水裂隙的結(jié)合提供了機(jī)會(huì)，而與β滑動(dòng)夾的邊緣位點(diǎn)的接觸則使PolⅣ能夠更好的抓住這種機(jī)會(huì)。再次，對PolⅢ的復(fù)制而言，只有其ɑ亞基與β滑動(dòng)夾的疏水裂隙的結(jié)合是必要的（40）（41）。最后，PolⅢ的ε亞基同時(shí)與ɑ亞基和β滑動(dòng)夾結(jié)合，從而可促進(jìn)ɑ亞基與β滑動(dòng)夾結(jié)合的穩(wěn)定性，進(jìn)而有助于提高ɑ亞基的延伸能力和DNA合成速度（37）（38）。②PolⅣ的C末端小指結(jié)構(gòu)域包含243-351氨基酸殘基。在該結(jié)構(gòu)域與β滑動(dòng)夾的復(fù)合物共晶結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)域的346QLVLGL351殘基作為C末端CBM與β滑動(dòng)夾的一個(gè)原聚體的疏水裂隙結(jié)合，而其303VWP305殘基則越過β滑動(dòng)夾的二聚體界面與相鄰滑動(dòng)夾原聚體的邊緣位點(diǎn)（E93、L98）接觸。（44）與對β滑動(dòng)夾的疏水裂隙的親和力相比，PolⅣ對β滑動(dòng)夾的邊緣位點(diǎn)的親和力要弱約100倍。③與細(xì)胞含量處于較低的正常水平時(shí)相比，當(dāng)細(xì)胞含量因SOS反應(yīng)顯著提升時(shí)，PolⅣ可更加頻繁的接觸鄰近ɑ疏水裂隙的β滑動(dòng)夾的低親和力邊緣位點(diǎn)，并有效的與PolⅢ競爭β滑動(dòng)夾的ɑ疏水裂隙，從而促進(jìn)PolⅢ與β滑動(dòng)夾分離并以更高的頻率取代PolⅢ與β滑動(dòng)夾和模板/引物接頭結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致PolⅢ延伸能力的下降（注：該過程發(fā)生于進(jìn)行性DNA復(fù)制過程中，且無需DNA損傷的存在，但需要PolⅣ與β滑動(dòng)夾的疏水裂隙和PolⅢ的相互作用，并受PolⅣ與β滑動(dòng)夾的邊緣位點(diǎn)的相互作用的促進(jìn)，但受到PolⅢ的ε亞基與β滑動(dòng)夾的疏水裂隙間的動(dòng)態(tài)相互作用的限制；在細(xì)胞含量處于較低的正常水平時(shí)，PolⅣ難以取代行進(jìn)中的PolⅢ并導(dǎo)致PolⅢ延伸能力的下降。（37）（39）（40）（43））。由于PolⅢα-DnaXτ-DnaB相互作用，在行進(jìn)過程中被PolⅣ取代并與β滑動(dòng)夾分離的PolⅢ可能持存于復(fù)制體中，直至PolⅣ因有限的延伸能力脫離模板/引物接頭，從而允許PolⅢ恢復(fù)對復(fù)制叉的控制（43）?，F(xiàn)有的有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（37）（39）（40）（43）綜合傾向于表明：PolⅣ與受阻于DNA損傷的PolⅢ的轉(zhuǎn)換（switch）和對行進(jìn)中的PolⅢ的取代（displacement）是兩個(gè)不同的過程（前一個(gè)過程關(guān)乎復(fù)制中TLS，后一個(gè)過程則可能關(guān)乎在DNA損傷反應(yīng)中對DNA復(fù)制的抑制（108）。），β滑動(dòng)夾的ε疏水裂隙（及鄰近邊緣位點(diǎn)）和ɑ疏水裂隙（及鄰近邊緣位點(diǎn)）分別在這兩個(gè)過程中發(fā)揮著重要作用?！霸赟OS反應(yīng)條件下（PolⅣ的細(xì)胞含量較高），前一個(gè)過程需要PolⅣ和PolⅢ的相互作用（43）”，由此可以推測“在正常條件下（PolⅣ的細(xì)胞含量較低），該過程亦需要PolⅣ和PolⅢ的相互作用（與該假設(shè)一致，在正常條件下，PolⅣ并非被動(dòng)的等待受阻于DNA損傷的PolⅢ從模板-引物接頭上脫離，而是積極主動(dòng)的獲取對模板-引物接頭的控制（40）。）”，而如果該推測成立，那么“在正常條件下，PolⅣ只能與受阻于DNA損傷的PolⅢ發(fā)生切換（40）（42）（49）”這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明：PolⅢ的ɑ亞基在DNA損傷處可能會(huì)發(fā)生構(gòu)象上的變化，而這種變化可能揭露出ɑ亞基與PolⅣ的作用位點(diǎn)，從而使PolⅣ能夠在結(jié)合于β滑動(dòng)夾的ε疏水裂隙后進(jìn)一步與PolⅢ的ɑ亞基相互作用，以獲取對模板引物接頭的控制。④即使在行進(jìn)復(fù)制叉中沒能通過與β滑動(dòng)夾的邊緣位點(diǎn)的接觸結(jié)合至β滑動(dòng)夾的ε疏水裂隙，PolⅣ也仍可在受阻于DNA損傷的復(fù)制叉處實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，并進(jìn)而取代受阻的PolⅢ進(jìn)行TLS，而該過程依然受到PolⅢ的ε亞基與β滑動(dòng)夾的疏水裂隙間的動(dòng)態(tài)相互作用的限制（見下文）。⑤M·H·拉莫斯等人2017年通過體外實(shí)驗(yàn)（116）顯示：與“工具帶模型”做出的“在進(jìn)行性復(fù)制過程中，β滑動(dòng)夾可憑借其兩個(gè)疏水裂隙同時(shí)結(jié)合PolⅢ和另一TLS聚合酶”的假設(shè)不符，PolⅢ和PolⅣ無法同時(shí)與β滑動(dòng)夾穩(wěn)定結(jié)合，而只能交替結(jié)合至β滑動(dòng)夾，因而PolⅣ與β滑動(dòng)夾的穩(wěn)定結(jié)合要求PolⅢ從β滑動(dòng)夾上脫離。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與S·C·科瓦爾奇科夫斯基等人2021年取得的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果（PolⅣ可以一種濃度和CBM依賴性的方式結(jié)合至復(fù)制體，并與復(fù)制體一起在無損DNA模板上行進(jìn)很長一段距離。（95））不符，并與張承宇等人2019年取得的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（E.coli對NFZ和MMS的敏感性只受PolⅢ的ε亞基和β滑動(dòng)夾疏水裂隙間的動(dòng)態(tài)相互作用的影響，PolⅢ的ɑ亞基對β滑動(dòng)夾疏水裂隙親和力的大幅提升不能增強(qiáng)E.coli對NFZ和MMS的敏感性（39））不相協(xié)調(diào)。⑥現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PolⅣ不僅可通過小指結(jié)構(gòu)域與β滑動(dòng)夾（的疏水裂隙和邊緣位點(diǎn)）相互作用，還可與PolⅢ的ɑ和ε亞基以及SSB相互作用。（117）C·B·加巴伊等人雖認(rèn)為“PolⅣ可在復(fù)制叉處與受阻于DNA損傷的PolⅢ發(fā)生轉(zhuǎn)換”，但根據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出：至少在體外，這種轉(zhuǎn)換無需PolⅣ與β滑動(dòng)夾的邊緣位點(diǎn)的接觸（雖可受到這種接觸的促進(jìn)），而是可通過PolⅣ與PolⅢ對β滑動(dòng)夾的疏水裂隙的直接競爭而實(shí)現(xiàn)（45）。除在受阻于DNA損傷的復(fù)制叉處取代PolⅢ并進(jìn)行TLS外，PolⅣ還可于后復(fù)制缺口處行使TLS功能（參與后復(fù)制缺口修復(fù)）。在該過程中，PolⅣ很可能不必與PolⅢ相互作用。在復(fù)制叉越過DNA損傷繼續(xù)前進(jìn)（從而形成后復(fù)制缺口）時(shí)，復(fù)制體會(huì)將β滑動(dòng)夾留在身后，該滑動(dòng)夾不會(huì)停留于（后復(fù)制缺口中）DNA損傷處的模板/引物接頭，而是會(huì)在DNA損傷上游的dsDNA上自由滑動(dòng)（46），并可在與PolⅣ隨機(jī)結(jié)合后輔助其進(jìn)行后復(fù)制TLS（見下文“PolⅣ參與的后復(fù)制缺口修復(fù)”）。S·S·亨利克斯等人利用單分子時(shí)差顯微鏡對熒光標(biāo)記的PolⅣ在分別經(jīng)環(huán)丙沙星、甲基磺酸甲酯（MMS）處理和經(jīng)紫外照射的E.coli中的活動(dòng)進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示：PolⅣ主要（約90%）在復(fù)制叉以外的區(qū)域行使功能，且即使在SOS反應(yīng)組成型開啟從而細(xì)胞含量大幅提升時(shí)，PolⅣ與DNA的結(jié)合也依賴于DNA損傷的存在（這與傳統(tǒng)的由濃度驅(qū)動(dòng)的聚合酶競爭假設(shè)不符）（47）。與亨利克斯等人取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同，E·S·思羅爾等人構(gòu)建了承載功能性內(nèi)源PolⅣ和光激活熒光蛋白融合物的E.coli菌株，并使用粒子跟蹤光活化定位顯微鏡對該菌株進(jìn)行了成像研究，結(jié)果顯示，“PolⅣ的聚集位置和募集機(jī)制會(huì)依DNA損傷類型的不同而有所差別；在經(jīng)MMS處理的細(xì)胞中，PolⅣ富集于復(fù)制叉（這與M·K·斯科特蘭等人取得的有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[即：若PolⅣ因突變特異性的喪失與PolⅢ相互作用的能力，其在體內(nèi)處理由MMS造成的DNA損傷的能力將顯著下降。（43）]相一致），且PolⅣ的募集需要β滑動(dòng)夾（48）。張承宇等人在有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（39）（50）（51）的基礎(chǔ)上指出：“在E.coli中，復(fù)制中TLS和后復(fù)制TLS是兩條具有競爭關(guān)系的TLS路徑（加巴伊等人亦在有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上得出過類似結(jié)論（45）），對這兩條路徑的選擇受PolⅢ的ε亞基和β滑動(dòng)夾疏水裂隙間的動(dòng)態(tài)相互作用的調(diào)控，這種動(dòng)態(tài)相互作用（獨(dú)立于ε亞基的校對核酸外切酶活性）構(gòu)成了對PolⅣ與β滑動(dòng)夾的疏水裂隙進(jìn)而與模板/引物接頭的結(jié)合具有阻礙作用的動(dòng)力學(xué)屏障；PolⅣ克服這種屏障的能力與其細(xì)胞水平正相關(guān)；與細(xì)胞水平較高時(shí)（如在SOS反應(yīng)條件下）相比，在細(xì)胞水平較低（如本底水平）時(shí)，PolⅣ更難克服這種屏障（或者說，更難捕獲PolⅢ的ε亞基脫離β滑動(dòng)夾的疏水裂隙時(shí)形成的開放狀態(tài)，或更難促進(jìn)這種開放狀態(tài)的形成。），從而會(huì)更多的進(jìn)行后復(fù)制TLS”；SSB可通過與PolⅣ的相互作用（非特異性的）促進(jìn)PolⅣ在受阻于DNA損傷的復(fù)制叉（而非在行進(jìn)復(fù)制叉）處的富集，從而有助于PolⅣ克服這種屏障，更多的進(jìn)行復(fù)制中TLS。注：PolⅢ的ε亞基和β滑動(dòng)夾疏水裂隙間的動(dòng)態(tài)相互作用不影響復(fù)制體越過DNA損傷并在下游重啟DNA復(fù)制的內(nèi)在傾向和能力。在遇到先導(dǎo)鏈模板上的DNA損傷時(shí)，復(fù)制體越過DNA損傷并在下游重啟DNA復(fù)制的速度可能不受DNA損傷的化學(xué)性質(zhì)的影響；該過程在體外耗時(shí)約為4分鐘，在體內(nèi)耗時(shí)估計(jì)約為10秒鐘，因而在體內(nèi)可能有尚未發(fā)現(xiàn)的因子促進(jìn)該過程的進(jìn)行。（39）亨利克斯等人之所以觀察到“PolⅣ主要（約90%）在復(fù)制叉以外的區(qū)域行使功能，且即使在SOS反應(yīng)組成型開啟時(shí)PolⅣ與DNA的結(jié)合也依賴于DNA損傷的存在”可能在一定程度上是因?yàn)椋涸谄鋵?shí)驗(yàn)中，受試菌株的PolⅣ水平普遍較低。的確，經(jīng)亨利克斯等人測定，PolⅣ在其所用受試菌株（MG1655）中的本底水平僅為20拷貝（遠(yuǎn)低于S·R·吉姆等人在E.coli菌株YG2247[P90C的衍生菌株]中測定的250拷貝（5））；在經(jīng)環(huán)丙沙星處理后，PolⅣ的細(xì)胞水平雖有顯著提升，但仍僅為250拷貝（遠(yuǎn)低于吉姆等人在經(jīng)MMS處理的YG2247中測定的2500拷貝（5））（47）。PolV的TLS。根據(jù)不同模型，PolV的TLS所需的輔助蛋白雖基本相同，但PolV在激活和進(jìn)行TLS的具體方式上卻有很大不同。根據(jù)福克斯等人提出的“順式激活模型”，PolV的TLS需要RecA*和β滑動(dòng)夾的輔助：在進(jìn)行性復(fù)制過程中，當(dāng)復(fù)制體遇到模板鏈上的DNA損傷時(shí)，PolⅢ受阻于DNA損傷處，繼而從模板/引物接頭上脫離，在DNA損傷下游則會(huì)形成一段（會(huì)首先被SSB覆蓋的）DNA單鏈區(qū)。RecA*在RecFOR的催化下形成于該單鏈區(qū)，并促進(jìn)SOS反應(yīng)的開啟和PolV（UmuD'2C）的合成。TLS聚合酶（PolsⅡ[見下文]、Ⅳ、V）隨機(jī)的與空置的模板/引物接頭結(jié)合（遵循經(jīng)典的質(zhì)量作用定律，各TLS聚合酶與空置模板/引物接頭隨機(jī)結(jié)合的概率取決于其相對細(xì)胞含量。）。PolV一旦結(jié)合至模板/引物接頭，并與RecA*的3'末端和β滑動(dòng)夾結(jié)合，具有完整的TLS功能的RecA*-PolV-β滑動(dòng)夾復(fù)合物便會(huì)形成。RecA*可通過對單鏈模板的拉伸（在模板鏈上存在難以復(fù)制的DNA序列[如二級結(jié)構(gòu)]時(shí)）促進(jìn)PolV對新生鏈的延伸，并可通過其3'末端與PolV的相互作用激活作為TLS聚合酶的PolV，從而確保PolV相對于DNA底物的正確定位；隨對新生鏈的延伸，PolV不斷從3'末端按3'→5'方向置換RecA*，同時(shí)RecA*從5'末端按5'→3'方向發(fā)生解離。在整個(gè)TLS過程中，β滑動(dòng)夾促進(jìn)了PolV與DNA底物結(jié)合的穩(wěn)定性（根據(jù)P·法姆等人的假設(shè)，這有助于PolV在延伸過程中與RecA*的3'末端保持接觸。）。在每次結(jié)合至模板/引物接頭后，PolV須在被高保真度DNA聚合酶替換前，于RecA*和β滑動(dòng)夾的輔助下合成足夠長的有效TLS補(bǔ)丁（TLSpatch），否則過短的TLS補(bǔ)丁會(huì)因DNA損傷導(dǎo)致的DNA結(jié)構(gòu)變形而被具有3'→5'校對活性的高保真度DNA聚合酶降解，從而使既發(fā)的TLS歸于無效（PolⅣ的TLS也有同樣的要求）。（15）（17）（28）（52-55）注：①?？怂沟热巳〉玫挠嘘P(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：5nt的TLS補(bǔ)丁（包括在損傷位點(diǎn)處插入的1nt和隨后[在損傷位點(diǎn)下游]插入的正確的4nt）即可得到PolⅢ和PolⅡ的有效延伸。（17）（54）②每次結(jié)合至模板/引物接頭后，PolV合成的TLS補(bǔ)丁的平均長度可受（所要通過的）DNA損傷的化學(xué)性質(zhì)和序列環(huán)境等因素的影響。比如，體外實(shí)驗(yàn)顯示：每次結(jié)合至位于G-AAF加合物處的模板/引物接頭后，PolV在RecA*和β滑動(dòng)夾的輔助下合成TLS補(bǔ)丁的平均長度約為18nt，合成有效TLS補(bǔ)丁的概率約為75%；相比之下，每次結(jié)合至位于TT（6-4）或TT-CPD損傷處的模板/引物接頭后，PolV在RecA*和β滑動(dòng)夾的輔助下合成TLS補(bǔ)丁的平均長度和合成有效TLS補(bǔ)丁的概率均略有下降。（52-54）根據(jù)古德曼等人提出的“反式激活模型”，PolV的TLS需要RecA、ATP和β滑動(dòng)夾的輔助：與DNA損傷反式排列的RecA*可通過其3'末端向PolV傳輸一個(gè)結(jié)合有ATP的RecA單體，從而形成具有DNA合成（包括TLS）活性的PolV-ATP-RecA復(fù)合物（PolVMut），繼而該復(fù)合物會(huì)沿DNA鏈搜索需要進(jìn)行TLS的部位，并會(huì)在完成TLS后，很快通過ATP水解脫離模板/引物接頭（注：PolVMut與模板/引物接頭的結(jié)合需要ATP，或者說，PolV-RecA復(fù)合物只有在與ATP結(jié)合形成PolVMut后，才能與模板/引物接頭結(jié)合；PolVMut具有DNA依賴性ATP酶活性，但其形成和TLS均無需ATP水解。），這在很大程度上限制了PolV復(fù)制未受損DNA的范圍。如果ssDNA和RecA*依然存在，脫離模板/引物接頭的PolV可通過與先前相同的方式被重新激活，并再次進(jìn)行DNA合成（包括TLS）。在PolVMut的TLS過程中，β滑動(dòng)夾可以促進(jìn)PolV與DNA底物結(jié)合的穩(wěn)定性，并可抑制PolVMut的ATP酶活性，從而延長其在模板/引物接頭上停留的時(shí)間（這可顯著提升PolVMut合成有效TLS補(bǔ)丁的效率）。（18）（55-64）注：①與“順式激活模型”截然相反，根據(jù)“反式激活模型”，在PolV的TLS過程中，RecA*并不存在于DNA損傷下游的單鏈區(qū)，其對PolV的激活相對于DNA損傷（或者說，需要進(jìn)行TLS的部位）是反式的；在激活PolV后，RecA*遂不在PolV的TLS過程中發(fā)揮作用（19）（60）。導(dǎo)致這種不同的主要原因是：首先，古德曼等人進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)顯示，“位于一個(gè)模板/引物DNA分子上的PolV可被形成于另一引物/模板DNA分子中之模板鏈的RecA*激活”（62）；其次，古德曼等人在有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（55）（56）的基礎(chǔ)上認(rèn)為，“PolV難以置換模板鏈上的RecA*，因而如果RecA*存在于DNA損傷下游的單鏈區(qū)，PolV的TLS會(huì)受到極大阻礙（19）”。有趣的是，古德曼等人2012年發(fā)表的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（62）顯示：于體外，在β滑動(dòng)夾存在的情況下，RecA*既可順式催化，也可反式催化PolV的TLS；被激活的PolV在沒有RecA*存在的模板鏈上的延伸能力明顯高于其在有RecA*存在的模板鏈上的延伸能力。據(jù)此，可以設(shè)想：在體內(nèi)，PolV既可被RecA*順式激活，也可被RecA*反式激活，但通常激活以順式方式進(jìn)行（因?yàn)镻olV在SOS反應(yīng)晚期出現(xiàn)并發(fā)揮作用。此時(shí)，RecA的細(xì)胞含量大幅提升，所有的ssDNA很可能都被RecA蛋白絲覆蓋。），并且（由于PolV自身具有一定的置換RecA*的能力，或由于某種[些]蛋白因子[如SSB、UvrD、PcrA]的作用）存在于DNA損傷下游的RecA*不會(huì)阻礙PolV有效進(jìn)行TLS，但會(huì)限制其復(fù)制未受損DNA的范圍。②至于PolV的TLS是否需要β滑動(dòng)夾，古德曼等人的觀點(diǎn)并非始終一致（15）。他們曾在2002年后的一段相當(dāng)長的時(shí)間里認(rèn)為：雖然可在某些條件下促進(jìn)PolV的TLS，但β滑動(dòng)夾并不為PolV的TLS所需要。直至2012-2021年，他們的觀點(diǎn)才（在有關(guān)生化實(shí)驗(yàn)[以含有TT-CPD或無堿基位點(diǎn)的環(huán)狀ssDNA模板為反應(yīng)底物，從而更接近體內(nèi)條件]（62）（64）的基礎(chǔ)上）逐漸發(fā)生改變，認(rèn)為PolV的TLS需要β滑動(dòng)夾，從而與福克斯等人（通過有關(guān)遺傳實(shí)驗(yàn)（15）得出）的觀點(diǎn)取得一致。③與PolⅣ一樣，PolV亦可與β滑動(dòng)夾的疏水裂隙以外的區(qū)域相互作用（65）；PolV亦可由β滑動(dòng)夾介導(dǎo)與PolⅢ發(fā)生轉(zhuǎn)換進(jìn)而催化TLS，且這種轉(zhuǎn)換亦受到PolⅢ的ε亞基和β滑動(dòng)夾疏水裂隙間的動(dòng)態(tài)相互作用的限制（39）（根據(jù)古德曼等人的觀點(diǎn)，在這種轉(zhuǎn)換發(fā)生前，PolV可能就已被RecA*激活為PolVMut（19）。）。無論“順式激活模型”還是“反式激活模型”，PolV的TLS都需要RecA和β滑動(dòng)夾。此外，A·羅賓遜等人通過有關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示：PolV主要在后復(fù)制TLS過程中發(fā)揮作用（59）。在“反式激活模型”描述的情境中，于DNA損傷上游的dsDNA上自由滑動(dòng)的β滑動(dòng)夾可與在DNA上游走的PolVMut結(jié)合，并輔助其進(jìn)行后復(fù)制TLS。dNTP池的大小對PolⅣ和PolV的TLS的影響。dNTP池的大小與PolⅢ的DNA合成活性正相關(guān)，而與PolⅢ的3'→5'校對活性負(fù)相關(guān)。dNTP池的擴(kuò)大可抑制PolⅢ的3'→5'校對活性，從而顯著提升E.coli細(xì)胞通過TLS處理多種DNA損傷（如G-AAF、TT-CPD、TT（6-4））的能力，且同時(shí)不降低TLS過程對TLS聚合酶的依賴。在受到基因毒性壓力（如紫外照射）時(shí)，E.coli細(xì)胞會(huì)通過SOS反應(yīng)上調(diào)TLS聚合酶的水平，同時(shí)通過不依賴于SOS反應(yīng)的路徑上調(diào)nrdAB基因的表達(dá)，使dNTP池?cái)U(kuò)大（3-4倍）；dNTP池的擴(kuò)大和TLS聚合酶水平的上調(diào)協(xié)同作用促進(jìn)TLS。（15）PolⅣ和PolV的TLS能力。PolⅣ和PolV通過DNA損傷的效率可受DNA損傷的性質(zhì)和序列環(huán)境的影響。從“可通過DNA損傷的類型”這個(gè)方面講，PolV可通過多種類型的DNA損傷（如6-4胸腺嘧啶光產(chǎn)物、cis-syn型胸腺嘧啶二聚物、無堿基位點(diǎn)、腺嘌呤加合物），因而對受損DNA的復(fù)制能力較強(qiáng)，而與之相比，（有遺傳證據(jù)支持的）PolⅣ所能通過的DNA損傷的類型則比較有限（只有少數(shù)位于DNA小溝的[由諸如BaP、NFZ、4-NQO等導(dǎo)致的]N2-鳥嘌呤加合物和烷基化加合物[如3meA，可由MMS導(dǎo)致]），因而對受損DNA的復(fù)制能力較弱。目前，有研究人員在相關(guān)實(shí)驗(yàn)和研究成果的基礎(chǔ)上認(rèn)為：PolⅣ被進(jìn)化來專門處理輕微的小溝損傷，而PolV則可處理包括大溝損傷在內(nèi)的較為嚴(yán)重的DNA損傷。（1）（5）（15）（17）（29-33）（66）（也見參考文獻(xiàn)（94））注：①現(xiàn)有的以E.coli為材料進(jìn)行的有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明：TLS是PolV的一項(xiàng)重要生理功能；在多種致變條件下，TLS均主要由PolV催化進(jìn)行。（33）（67）-（69）②PolⅣ和PolV在TLS能力和存在時(shí)間上的差異可對TLS的發(fā)生路徑產(chǎn)生影響。由于包含大溝損傷在內(nèi)的嚴(yán)重DNA損傷難以被PolⅣ通過，而多可被PolV通過，所以在正常生長的E.coli細(xì)胞中（無PolV），復(fù)制叉在遇到先導(dǎo)鏈模板上的此類損傷時(shí)往往只能選擇兩種方式加以應(yīng)對：一是復(fù)制叉回退；二是越過損傷繼續(xù)前進(jìn)，從而在身后留下一段子鏈缺口（后復(fù)制缺口），繼而通過同源重組或待到SOS反應(yīng)晚期由PolV（和其它DNA聚合酶）進(jìn)行修復(fù)（見下文“PolⅤ參與的后復(fù)制缺口修復(fù)和‘RecA震動(dòng)模型’”）。因此，在正常生長的E.coli細(xì)胞中，由發(fā)生于先導(dǎo)鏈模板的嚴(yán)重DNA損傷引發(fā)的TLS主要為后復(fù)制TLS。③?？怂沟热苏J(rèn)為：在E.coli中，不存在可根據(jù)DNA損傷的性質(zhì)（如DNA損傷的化學(xué)性質(zhì)和其在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)上的位置）特異性的募集適恰的TLS聚合酶的分子機(jī)制（或者說，DNA損傷不能“指導(dǎo)”TLS聚合酶與受阻模板/引物接頭的結(jié)合）。就TLS而言，TLS聚合酶與β滑動(dòng)夾和模板/引物接頭的結(jié)合是隨機(jī)的，且遵循經(jīng)典的質(zhì)量作用定律（主要參數(shù)為：TLS聚合酶的細(xì)胞含量及其對β滑動(dòng)夾和模板/引物接頭的親和力）（15）（17）。在此基礎(chǔ)上，TLS過程可被近似的看做一種試錯(cuò)過程：如果隨機(jī)結(jié)合至β滑動(dòng)夾和模板/引物接頭的TLS聚合酶可通過DNA損傷并合成足夠長的（或者說，有效的）TLS補(bǔ)丁，TLS便獲得成功；反之，如果隨機(jī)結(jié)合至β滑動(dòng)夾和模板/引物接頭的TLS聚合酶不能通過DNA損傷或不能合成足夠長的TLS補(bǔ)丁，TLS便以失敗告終，新一輪的嘗試（起始于新一輪的TLS聚合酶與β滑動(dòng)夾和模板/引物接頭的隨機(jī)結(jié)合）便會(huì)開始（15）（17）。此外，C·印第安尼等人通過有關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示“在行進(jìn)復(fù)制叉中，達(dá)到SOS反應(yīng)誘導(dǎo)水平的RecA可顯著促進(jìn)PolsⅡ、Ⅳ、V取代PolⅢ進(jìn)行DNA復(fù)制，并導(dǎo)致DNA復(fù)制速度的下降（SSB則反而會(huì)促進(jìn)PolⅢ的DNA復(fù)制，并抑制TLS聚合酶的DNA復(fù)制。）”，從而表明“在行進(jìn)復(fù)制叉處，TLS聚合酶和PolⅢ之間的切換很可能受到比單純的‘質(zhì)量作用驅(qū)動(dòng)’更加復(fù)雜的機(jī)制的調(diào)控”（70）。PolⅣ和PolV對受損DNA的復(fù)制保真度和導(dǎo)致定標(biāo)突變（targetedmutagenesis）的能力。PolⅣ和PolV對受損DNA的復(fù)制保真度可受DNA損傷的化學(xué)性質(zhì)和序列環(huán)境的影響。總體而言，受各自對受損DNA的復(fù)制保真度和TLS能力等因素的影響，與PolⅣ相比，PolV導(dǎo)致定標(biāo)突變的能力更強(qiáng)。（5）（29）（32）（33）注：現(xiàn)有的以E.coli為材料進(jìn)行的有關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，“在多種致變條件下，絕大部分定標(biāo)突變都源自PolV的TLS”。（33）（67）-（69）PolⅣ和PolV對未受損DNA的復(fù)制保真度。由于不具有3'–5'核酸外切酶活性從而缺乏校對功能（該功能的缺失可使DNA聚合酶的復(fù)制保真度下降102-103倍），且不具有獨(dú)特的α螺旋（相當(dāng)于PolI中的O螺旋，可提高DNA聚合酶的復(fù)制保真度），PolⅣ和PolV對未受損DNA的復(fù)制保真度遠(yuǎn)低于已知的E.coli的其它3種DNA聚合酶（PolI、PolⅡ、PolⅢ）（1）（2）（24）（71），而與PolⅣ相比，PolV對未受損DNA的復(fù)制保真度（10-3-10-4）還要低5-10倍（29）。因此，PolⅣ和PolV在對未受損DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，均會(huì)以很高的頻率導(dǎo)致非定標(biāo)突變（untargetedmutagenesis）的發(fā)生。在對未受損DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，PolⅣ的復(fù)制進(jìn)而致變能力的理想發(fā)揮依賴于β、γ復(fù)合物和SSB（β、γ復(fù)合物和SSB可顯著提升PolⅣ的延伸能力；β、γ復(fù)合物可使PolⅣ的延伸能力、DNA合成效率和對dNTP的親合力分別提高300-400倍、約3000倍和約10倍。）（29）（72-74）；PolV的復(fù)制進(jìn)而致變能力的理想發(fā)揮依賴于RecA、ATP、SSB和β、γ復(fù)合物（RecA*、SSB和β，γ復(fù)合物可顯著提升PolV的延伸能力和DNA合成效率[RecA可在SSB、β,γ復(fù)合物和ATP存在的情況下，使PolV的DNA合成效率提高15000倍]。）（15）（17）（29）（53）（55）（57）（60-62）（75）。注：①由于對未受損DNA的復(fù)制保真度極低，PolV在E.coli細(xì)胞中受到極其嚴(yán)格的調(diào)控。除在上文中已提及的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控（涉及UmuC、UmuD的表達(dá)）和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（涉及UmuC、UmuD、UmuD'的穩(wěn)定性和PolV的DNA復(fù)制活性）外，現(xiàn)有的有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PolV還在時(shí)間和空間上受到一種特殊機(jī)制的調(diào)控：在經(jīng)紫外照射約45分鐘后（不同實(shí)驗(yàn)條件下，該時(shí)間可能有所差異），UmuC開始合成，但不會(huì)被立即激活，其絕大部分先是被吸附于細(xì)胞內(nèi)膜，直至UmuD'（在RecA*催化下）出現(xiàn)（經(jīng)紫外照射約90分鐘后[不同實(shí)驗(yàn)條件下，該時(shí)間可能有所差異]）并與UmuD'結(jié)合后，才會(huì)被釋放至細(xì)胞質(zhì)中。（59）②在E.coli細(xì)胞中，PolⅡ亦可在β滑動(dòng)夾的輔助下對含有某些損傷（如?C加合物、處于特定序列環(huán)境中的G-AAF加合物）的DNA進(jìn)行TLS，并導(dǎo)致定標(biāo)突變（如C

→T堿基轉(zhuǎn)換、-2移碼

）的高頻發(fā)生（76）（77）（注：取決于DNA損傷的化學(xué)性質(zhì)和序列環(huán)境，PolⅡ可單獨(dú)或與PolV一起進(jìn)行TLS（31）（78）；與PolsⅣ、V一樣，PolⅡ亦可與β滑動(dòng)夾的疏水裂隙以外的區(qū)域相互作用（79），并亦可由β滑動(dòng)夾介導(dǎo)與PolⅢ發(fā)生轉(zhuǎn)換進(jìn)而催化TLS，且這種轉(zhuǎn)換亦受到PolⅢ的ε亞基和β滑動(dòng)夾的疏水裂隙間的動(dòng)態(tài)相互作用的限制（39）。），但由于具有3'–5'校對活性，其對未受損DNA的復(fù)制保真度較高。與PolⅣ和PolV一樣，PolⅡ亦可受SOS反應(yīng)正調(diào)控（在SOS反應(yīng)中，PolⅡ的細(xì)胞水平可從本底水平的≤50拷貝提升至≤350拷貝。）；除SOS反應(yīng)外，PolⅡ在經(jīng)絲裂霉素C（MMC）處理的對數(shù)期細(xì)胞中的充分表達(dá)還需要RpoS反應(yīng)的調(diào)控（80）。至于PolⅡ的生理功能，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：除進(jìn)行TLS外，PolⅡ還可在復(fù)制（特別是后隨鏈復(fù)制）過程中糾正PolⅢ導(dǎo)致的復(fù)制錯(cuò)誤（81）（82）；在經(jīng)紫外照射的細(xì)胞中參與催化高保真度的復(fù)制重啟（83）；參與對鏈間交聯(lián)（84）以及由紫外照射（85）和氧化（80）（86）造成的DNA損傷的修復(fù)；在細(xì)胞因養(yǎng)分脅迫而處于靜止期時(shí)，增強(qiáng)和提高細(xì)胞的長期生存能力和進(jìn)化適合度（87）；在對數(shù)期細(xì)胞中促進(jìn)遺傳多樣性（88）。③TLS雖然不總是致變，但本質(zhì)上容易出錯(cuò)，因而被稱為誤性（error-prone）DT機(jī)制，而HDGR和FR則因其高保真度被稱為無誤（error-free）DT機(jī)制。PolⅣ和PolV導(dǎo)致的定標(biāo)突變的類型。雖然由PolⅣ和PolV導(dǎo)致的定標(biāo)突變譜可受DNA損傷的化學(xué)性質(zhì)和序列環(huán)境的影響，但總體而言，由于在進(jìn)行TLS的方式上的傾向性（見上文“PolⅣ和PolV進(jìn)行TLS的方式及場景”），PolⅣ傾向于導(dǎo)致移碼，而PolV傾向于導(dǎo)致堿基置換。（5）（18）（32）（33）PolⅣ和PolV導(dǎo)致的非定標(biāo)突變的類型。在對未受損DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，PolⅣ主要導(dǎo)致由單堿基缺失造成的移碼，而與PolⅢ相比，PolⅣ導(dǎo)致堿基置換的頻率也明顯較高；PolV主要導(dǎo)致發(fā)生于嘌呤與嘧啶之間的堿基顛換，而與PolⅢ相比，PolV導(dǎo)致其它類型突變（如移碼以及發(fā)生于嘌呤與嘌呤之間或嘧啶與嘧啶之間的堿基轉(zhuǎn)換）的頻率也明顯較高。值得注意的是：作為最重要的復(fù)制后DNA修復(fù)系統(tǒng)，MMR可非常有效的防止移碼和堿基轉(zhuǎn)換的發(fā)生，但防止堿基顛換的效率相對較低。因此，相較于PolⅤ，PolⅣ的致變性在更大程度上受到MMR的抑制。（1）（5）（18）（29）（89-93）注：由PolⅢ導(dǎo)致的復(fù)制錯(cuò)誤如不被修復(fù)，則有75%會(huì)導(dǎo)致移碼和堿基轉(zhuǎn)換。（91）PolⅣ和PolV的DNA合成速度和延伸能力。體外實(shí)驗(yàn)顯示：（一）在β滑動(dòng)夾存在的情況下，PolⅣ在無損DNA模板上的平均合成速度為3-5nt/秒，平均延伸能力為300-400nt（在無β滑動(dòng)夾存在的情況下，PolⅣ在無損DNA模板上的延伸能力僅為≤1nt。），每次駐留于模板/引物接頭的平均時(shí)間約為97秒；當(dāng)DNA損傷（[-ta]-BaP-dG）存在時(shí)，PolⅣ的平均延伸能力（相對于其在無損DNA模板上的平均延伸能力）大幅下降至約5nt，從而表明其駐留于模板/引物接頭的時(shí)間大部分用于通過DNA損傷。（二）在β滑動(dòng)夾和RecA存在的情況下，PolⅤ在無損DNA模板上的平均合成速度約為0.3nt/秒，平均延伸能力約為25nt（最大延伸能力約為100nt；在無β滑動(dòng)夾存在的情況下，PolⅤ在無損DNA模板上的延伸能力僅為1nt。），每次駐留于模板/引物接頭的平均時(shí)間約為86秒；當(dāng)DNA損傷（G-AAF加合物、TT（6-4）或TT-CPD）存在時(shí)，PolⅤ通過DNA損傷的時(shí)間約為24-34秒，PolⅤ的平均延伸能力小幅下降至約15-18nt。（15）（17）（53）（54）（72）注：在E.coli中，PolⅤ是合成速度最慢的DNA聚合酶；PolⅢ的DNA合成速度最快，為>650nt/秒；PolⅠ和PolⅡ在無損DNA模板上的DNA合成速度則分別為13-15nt/秒和20-30nt/秒。此外，在無損DNA模板上，PolⅠ、PolⅡ和PolⅢ的延伸能力分別為≤700nt、≥1600nt和≥50000nt，且其延伸能力強(qiáng)烈依賴于β滑動(dòng)夾；若β滑動(dòng)夾不存在，其延伸能力將分別大幅下降至15-20nt、5nt和10-15nt（平均約12nt）。（15）（17）在無損DNA模板上，PolⅣ和PolⅤ的平均延伸能力和合成速度雖有顯著差異（300-400ntvs25nt；3-5nt/秒vs0.3nt/秒），但其每次駐留于模板/引物接頭的平均時(shí)間卻相差不大（97秒vs86秒），這表明其對模板/引物接頭的親和力比較接近，而這種親和力可能主要來源于其與β滑動(dòng)夾的相互作用。（17）PolⅣ參與的后復(fù)制缺口修復(fù)（Post-replicativeGapRepair）。2020年，?？怂沟热嗽谟嘘P(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上明確指出，“PolⅣ和PolⅤ是在后復(fù)制缺口而非復(fù)制叉處行使TLS功能（該觀點(diǎn)值得商榷）；PolⅣ和PolⅤ的TLS是后復(fù)制缺口修復(fù)的有機(jī)組成部分”，并對PolⅣ和PolⅤ參與的后復(fù)制缺口修復(fù)進(jìn)行了研究和描述。（17）在PolⅣ參與的后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，根據(jù)?？怂沟热说募僭O(shè)：（一）β滑動(dòng)夾發(fā)揮著不可或缺的輔助作用；PolⅣ可隨機(jī)結(jié)合至DNA損傷處的模板/引物接頭，但這種結(jié)合很不穩(wěn)定，因而PolⅣ很難進(jìn)一步與在DNA損傷上游的dsDNA上自由滑動(dòng)的β滑動(dòng)夾結(jié)合。PolⅣ與β滑動(dòng)夾的結(jié)合因此成為整個(gè)后復(fù)制缺口修復(fù)反應(yīng)的限速步驟。（二）由于PolⅣ的細(xì)胞含量較高（本底水平250拷貝，SOS反應(yīng)誘導(dǎo)下可達(dá)2500拷貝），所以當(dāng)后復(fù)制缺口包含高保真度DNA聚合酶無法通過的小溝損傷時(shí)，PolⅣ可通過反復(fù)結(jié)合至模板/引物接頭，最終實(shí)現(xiàn)與β滑動(dòng)夾的結(jié)合，進(jìn)而有效進(jìn)行TLS。（三）在進(jìn)行TLS時(shí)，PolⅣ的延伸能力非常有限（見上文），因而在其完成TLS并脫離模板/引物接頭后，仍會(huì)有大段的后復(fù)制缺口需要填補(bǔ)。在正常（或者說無損）的模板/引物接頭上，PolⅣ無法與高保真度DNA聚合酶競爭（即使在SOS反應(yīng)條件下亦是如此），因而在PolⅤ未激活表達(dá)時(shí)，后TLS時(shí)期的后復(fù)制缺口修復(fù)基本上完全由高保真度DNA聚合酶催化完成。這使得：當(dāng)PolⅤ未激活表達(dá)時(shí)，在PolⅣ參與的包含小溝損傷的后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，非定標(biāo)突變僅高發(fā)于TLS補(bǔ)丁。（17）注:①PolⅤ可能在大多數(shù)情況下都在后復(fù)制缺口（而非復(fù)制叉）處行使TLS功能，因?yàn)镻olⅤ僅在SOS反應(yīng)晚期才開始出現(xiàn)（此時(shí)，需由PolⅤ進(jìn)行TLS處理的DNA損傷可能大都已存在于后復(fù)制缺口中。），且即使在SOS反應(yīng)的正調(diào)控下，PolⅤ也只能達(dá)到15-60拷貝的細(xì)胞水平，從而可能較難克服由PolⅢ的ε亞基和β滑動(dòng)夾疏水裂隙間的動(dòng)態(tài)相互作用構(gòu)成的動(dòng)力學(xué)屏障，進(jìn)而更傾向于進(jìn)行后復(fù)制TLS。PolⅣ的情況則有所不同：PolⅣ具有較高的本底水平（250拷貝），而在SOS反應(yīng)早期，PolⅣ更可達(dá)到2500拷貝的細(xì)胞水平，從而可更大程度的克服由PolⅢ的ε亞基和β滑動(dòng)夾疏水裂隙間的動(dòng)態(tài)相互作用構(gòu)成的動(dòng)力學(xué)屏障，進(jìn)而更多的進(jìn)行復(fù)制中TLS?，F(xiàn)有的一系列體外實(shí)驗(yàn)表明：PolⅣ可有效的在復(fù)制叉處對含某些損傷的DNA進(jìn)行TLS（39）（45）（66）；現(xiàn)有的一系列體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也傾向于表明：至少在某些條件下，PolⅣ會(huì)在相當(dāng)程度上于復(fù)制叉處行使TLS功能（39）（43）（48）（50）（94）。有研究人員甚至認(rèn)為：PolⅣ可能是（或至少在某些條件[如DNA損傷反應(yīng)]下是）復(fù)制體的一個(gè)組成部分，它有助于復(fù)制體克服模板鏈上的障礙，順暢前行（45）（66）（95）。②福克斯等人假設(shè)：在后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，在Y家族DNA聚合酶完成DNA復(fù)制并脫離模板/引物接頭后，留下的β滑動(dòng)夾不會(huì)停留于該接頭，而是會(huì)在其上游的dsDNA上自由滑動(dòng)。（17）PolⅤ參與的后復(fù)制缺口修復(fù)和“RecA震動(dòng)模型”。福克斯等人2018年通過有關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示：在對含TT（6-4）損傷的后復(fù)制缺口進(jìn)行的修復(fù)過程中，非定標(biāo)突變不僅高發(fā)于TLS補(bǔ)丁，還頻發(fā)于TLS補(bǔ)丁的下游區(qū)域（長達(dá)數(shù)百nt），甚至可在DNA損傷的上游區(qū)域（以一定程度上低于DNA損傷下游區(qū)域的頻率）被觀察到；非定標(biāo)突變率雖自DNA損傷位點(diǎn)向下整體的逐漸下行，但下行幅度并不均勻，而是（在長達(dá)數(shù)百nt的后復(fù)制缺口內(nèi)）呈現(xiàn)出具有周期性的震蕩模式（表現(xiàn)為：幾十nt的低突變區(qū)與約50nt的高突變區(qū)交替存在。從圖像上看，與TLS補(bǔ)丁相比，TLS補(bǔ)丁下游的高突變區(qū)[亦被稱為“后TLS補(bǔ)丁”--“post-TLSpatch”]由于受相鄰低突變區(qū)的影響，尺寸較為寬大，邊界也較為模糊。），且TLS補(bǔ)丁下游的高突變區(qū)的形成由PolⅤ介導(dǎo)，而與PolⅣ無關(guān)；在DNA損傷的上游區(qū)域觀察到的非定標(biāo)突變亦由PolⅤ導(dǎo)致（DNA損傷上游的高突變區(qū)亦被稱為“前TLS補(bǔ)丁”--“pre-TLSpatch”。）；由PolⅤ導(dǎo)致的非定標(biāo)突變并未受到MMR的有效抑制。（17）（96）對于這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，?？怂沟热私o出的解釋主要包括：（一）在后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，PolsⅠ-V隨機(jī)的與空置模板/引物接頭結(jié)合，各聚合酶與空置模板/引物接頭隨機(jī)結(jié)合的概率取決于其相對細(xì)胞含量。（二）TLS補(bǔ)丁下游的高突變區(qū)的形成由PolⅤ介導(dǎo)而與PolⅣ無關(guān)是因?yàn)椋篜olⅣ與模板/引物接頭的結(jié)合極不穩(wěn)定，以至于即使在SOS反應(yīng)條件下（PolⅣ的細(xì)胞含量可大幅提升至2500拷貝），PolⅣ在結(jié)合至模板/引物接頭后進(jìn)一步與在該接頭上游的dsDNA上自由滑動(dòng)的β滑動(dòng)夾結(jié)合的效率依然很低，而若無β滑動(dòng)夾輔助，PolⅣ在正常DNA模板上的延伸能力僅為≤1nt。雖然PolⅤ與模板/引物接頭的結(jié)合同樣極不穩(wěn)定，但與PolⅣ不同，存在于后復(fù)制缺口的RecA*可通過其3'末端與PolⅤ的相互作用為PolⅤ與模板/引物接頭的結(jié)合提供額外的穩(wěn)定性，從而顯著提高了PolⅤ進(jìn)一步與β滑動(dòng)夾結(jié)合的效率，進(jìn)而使得PolⅤ在完成TLS后且在細(xì)胞含量較低的情況下依然能夠在后復(fù)制缺口修復(fù)過程中反復(fù)導(dǎo)致高突變區(qū)的形成。（三）在有損和無損DNA模板上，每次結(jié)合至模板/引物接頭后，在β滑動(dòng)夾和RecA的輔助下，PolⅤ的平均延伸能力分別僅為15-18nt和25nt（在無損DNA模板上的最大延伸能力也僅為約100nt）。“PolⅤ-RecA復(fù)合物”（即：PolⅤ脫離復(fù)合物--PolⅤdissociationcomplex[PolV-dc]）離開模板/引物接頭后，在模板/引物接頭和RecA*的3'末端之間會(huì)留下一段空隙。這段空隙使得PolⅤ無法同時(shí)與模板/引物接頭和RecA*的3'末端結(jié)合（或者說，無法功能性的結(jié)合至模板/引物接頭），而高保真度DNA聚合酶此時(shí)可（功能性的）結(jié)合至模板/引物接頭，并（通常）在沒有β滑動(dòng)夾輔助的情況下進(jìn)行DNA復(fù)制，隨高保真度DNA聚合酶對模板/引物接頭的延伸，RecA*按3'→5'方向發(fā)生回退（由RecA單體從RecA*3'末端的解離導(dǎo)致）。由于沒有β滑動(dòng)夾的輔助，高保真度DNA聚合酶的延伸能力非常有限，平均僅為約12nt。當(dāng)高保真度DNA聚合酶脫離模板/引物接頭時(shí)，在模板/引物接頭和RecA*的3'末端之間會(huì)形成0-3nt（即0nt、1nt、2nt或3nt）的空隙，且其中只有一種尺寸的空隙可供PolⅤ同時(shí)與模板/引物接頭和RecA*的3'末端結(jié)合。繼而，高保真度DNA聚合酶會(huì)以較大概率結(jié)合至模板/引物接頭，并繼續(xù)形成一段低突變區(qū)；PolⅤ則會(huì)以較小概率功能性的結(jié)合至模板/引物接頭，并進(jìn)一步與β滑動(dòng)夾結(jié)合，進(jìn)而再次形成一段高突變區(qū)。這種PolⅤ和高保真度DNA聚合酶交替功能性的結(jié)合至模板/引物接頭并對其進(jìn)行延伸的過程可反復(fù)進(jìn)行，從而可以解釋“非定標(biāo)突變率在后復(fù)制缺口內(nèi)呈現(xiàn)出的具有周期性的震蕩模式”。（四）雖然概率較小，但結(jié)合至模板/引物接頭的高保真度DNA聚合酶仍可能與（在模板/引物接頭上游的dsDNA上自由滑動(dòng)的）β滑動(dòng)夾結(jié)合，從而有助于導(dǎo)致“非定標(biāo)突變率在后復(fù)制缺口內(nèi)自DNA損傷位點(diǎn)向下整體的逐漸下行”。（五）由PolⅤ導(dǎo)致的非定標(biāo)突變可在DNA損傷的上游區(qū)域（以在一定程度上低于DNA損傷下游區(qū)域的頻率）被觀察到是因?yàn)椋涸贒NA損傷或（過短的）無效TLS補(bǔ)丁處的新生鏈3'端可被高保真度DNA聚合酶降解，從而使后復(fù)制缺口擴(kuò)大至（RecA*也隨即延伸至）DNA損傷的上游區(qū)域。在PolⅤ出現(xiàn)前，由此產(chǎn)生的DNA損傷上游的單鏈區(qū)由高保真度DNA聚合酶填補(bǔ)；在PolⅤ出現(xiàn)后，PolⅤ會(huì)隨機(jī)參與對該單鏈區(qū)的填補(bǔ)，并導(dǎo)致非定標(biāo)突變的發(fā)生。（六）由PolⅤ導(dǎo)致的非定標(biāo)突變并未受到MMR的有效抑制是因?yàn)椋涸诤髲?fù)制缺口修復(fù)過程中，由于沒有復(fù)制叉的存在，MMR的效能受到抑制。（17）（96）注：①福克斯等人認(rèn)為：在PolⅤ對含TT（6-4）損傷的后復(fù)制缺口進(jìn)行修復(fù)時(shí)，細(xì)胞處于SOS反應(yīng)中，RecA的細(xì)胞含量大幅提升，因而所有ssDNA都會(huì)被RecA蛋白絲覆蓋。（17）②生理?xiàng)l件下，在RecA*中，一個(gè)RecA單體會(huì)結(jié)合3個(gè)核苷酸，因而形成于DNA損傷下游的RecA*的3'末端與模板/引物接頭之間可能會(huì)存在0-2nt的空隙，而其中只有一種尺寸的空隙可供PolⅤ同時(shí)與模板/引物接頭和RecA*的3'末端結(jié)合。其余尺寸的不適恰空隙則可依憑RecA*固有的動(dòng)態(tài)特性（源于由ATP水解驅(qū)動(dòng)的RecA*的內(nèi)部重組）或由高保真度DNA聚合酶對新生鏈3'端反復(fù)進(jìn)行的降解與合成（類似于在由DNA損傷導(dǎo)致的停滯復(fù)制叉中受阻PolⅢ的一種表現(xiàn)——見上文“PolⅣ和PolV進(jìn)行TLS的方式及場景”）而被調(diào)整至適恰狀態(tài)。（17）③?？怂沟热思僭O(shè)：在后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，大多數(shù)高保真度DNA聚合酶在結(jié)合至模板/引物接頭后便開始對其進(jìn)行延伸，并會(huì)在與（于模板/引物接頭上游的dsDNA上自由滑動(dòng)的）β滑動(dòng)夾結(jié)合前（因有限的延伸能力）脫離模板/引物接頭。（17）④福克斯等人指出：在兩種情況下，PolV會(huì)和PolⅣ一起參與到包含小溝損傷的后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，并導(dǎo)致非定標(biāo)突變的頻繁發(fā)生。（1）后復(fù)制缺口包含的小溝損傷需由PolⅣ和PolV協(xié)同催化通過（17），比如：對含[+ta]-BaP-dG的DNA的TLS需由PolⅣ和PolV協(xié)作催化完成（具體方式可能是：一者在DNA損傷處向合成鏈插入核苷酸，另一者負(fù)責(zé)對由此形成的新的引物3'端進(jìn)行延伸。（97））。（2）小溝損傷的數(shù)量過多，耗竭了由PolⅣ介導(dǎo)的快速通過（DNA損傷的）能力，細(xì)胞進(jìn)入SOS反應(yīng)晚期，PolV出現(xiàn)并參與到包含小溝損傷的后復(fù)制缺口修復(fù)過程中（17）。鑒于在后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，PolV可反復(fù)結(jié)合至模板/引物接頭并導(dǎo)致TLS補(bǔ)丁和前、后TLS補(bǔ)丁的形成，福克斯等人于2020年在“順式激活模型”及有關(guān)實(shí)驗(yàn)和研究成果的基礎(chǔ)上提出“RecA震動(dòng)模型”，以描述結(jié)合于模板/引物接頭的PolV在覆蓋有RecA*的ssDNA上的延伸過程。根據(jù)該模型，PolV隨機(jī)結(jié)合至后復(fù)制缺口中的模板/引物接頭，并與（由RecFOR催化形成于模板/引物接頭下游的）RecA*的3'末端結(jié)合。RecA*的3'末端和PolV的相互作用為PolV與模板/引物接頭的結(jié)合提供了額外的穩(wěn)定性，從而顯著提升了PolV進(jìn)一步與在模板/引物接頭上游的dsDNA上自由滑動(dòng)的β滑動(dòng)夾結(jié)合的效率。RecA單體會(huì)以一定的速度從RecA*的3'末端脫離。如果一個(gè)RecA單體在PolV與β滑動(dòng)夾結(jié)合后從RecA*的3'末端脫離（伴有ATP水解[ATP→ADP]），那么它仍會(huì)結(jié)合于PolV（RecA*3'末端的RecA單體對PolV的親和力高于其對RecA*中相鄰單體的親和力），并導(dǎo)致“模板/引物接頭-β滑動(dòng)夾-PolV-RecA-ADP復(fù)合物”（即:PolV功能性復(fù)合物-PolVfunctionalcomplex[PolV-fc]）的形成（該過程被稱為“RecA俘獲”）。由于RecA-ADP復(fù)合物對ssDNA的親和力很低，所以在PolV-fc中，RecA-ADP會(huì)處于與ssDNA快速結(jié)合與分離的循環(huán)狀態(tài)，即所謂的“RecA震動(dòng)”。這種震動(dòng)一方面可使PolV感知它與RecA*的3'末端之間的距離（或者說“空隙”）；另一方面，可在復(fù)制過程中確保結(jié)合至β滑動(dòng)夾的PolV在DNA底物上的正確定位（這有助于PolV通過模板鏈上的DNA損傷和難以復(fù)制的DNA序列[與PolⅣ不同，PolV的延伸能力的確不會(huì)受到模板鏈上的DNA損傷的顯著影響——見上文“PolⅣ和PolV的DNA合成速度和延伸能力”]）。“RecA俘獲”發(fā)生后，PolV-fc與RecA*的3'末端之間會(huì)形成一段3nt的空隙，而在RecA震動(dòng)過程中，RecA-ADP復(fù)合物需占據(jù)5nt的ssDNA片段，因而此時(shí)PolV-fc無法延伸。直至又一RecA單體從RecA*的3'末端脫離，從而使PolV-fc與RecA*的3'末端之間的空隙擴(kuò)大至6nt，PolV-fc此時(shí)向前延伸1nt（使空隙縮小至5nt）便會(huì)停止，直至又一RecA單體從RecA*的3'末端脫離，從而使空隙擴(kuò)大至8nt。此后，PolV-fc每次向前延伸3nt（使空隙縮小至5nt）便會(huì)停止,直至又一RecA單體從RecA*的3'末端脫離，使空隙再度擴(kuò)大至8nt。如此循環(huán)往復(fù)，直至PolV-dc（PolV-RecA）脫離模板/引物接頭。如果處于RecA*3'末端的RecA單體總能在遇到PolV-fc前就從RecA*上脫離，從而使得PolV-fc與RecA*的3'末端之間始終有>5nt的空隙，那么PolV-fc的延伸便可沒有停頓的持續(xù)進(jìn)行，直至PolV-dc脫離模板/引物接頭（每次形成后，PolV-fc的延伸既可間斷進(jìn)行，也可持續(xù)進(jìn)行，還可以兩種方式相結(jié)合的形式進(jìn)行。）。在PolV完成DNA復(fù)制并脫離模板/引物接頭后，模板/引物接頭和RecA*的3'末端之間會(huì)形成一段5-8nt的空隙。（17）注：在無損DNA模板上，PolV的延伸速度（約0.3nt/秒）約為PolⅣ的（3-5nt/秒）十分之一。?？怂沟热苏J(rèn)為：造成這種顯著差異的原因可能是“RecA震動(dòng)模型”所描述的PolV的獨(dú)特延伸方式（17）。在提出“RecA震動(dòng)模型”的同時(shí)，?？怂沟热酥赋?，在PolV的后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，RecA主要具有四種功能：（一）通過催化SOS反應(yīng)和UmuD自裂解促進(jìn)PolV的合成（RecA*）；（二）為PolV與模板/引物接頭的結(jié)合提供額外的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)PolV進(jìn)一步與在模板/引物接頭上游的dsDNA上自由滑動(dòng)的β滑動(dòng)夾結(jié)合（RecA*）；（三）拉伸模板鏈以使PolV-fc能在其包含的難以復(fù)制的DNA序列上平滑延伸（RecA*）；（四）通過RecA震動(dòng)使PolV感知其與RecA*的3'末端之間的距離（空隙），并在復(fù)制過程中確保結(jié)合至β滑動(dòng)夾的PolV在DNA底物上的正確定位（RecA-ADP）。（17）在提出“RecA震動(dòng)模型”后，?？怂沟热诉M(jìn)一步指出：關(guān)于PolV在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出的生化特性，之所以出現(xiàn)多種不同的、甚至是相互沖突的模型（如“順式激活模型”和“反式激活模型”）是因?yàn)?在PolV的后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，不同形態(tài)的RecA（RecA-ATP、RecA-ADP）和β滑動(dòng)夾發(fā)揮了復(fù)雜的、時(shí)序性的重要作用，從而使得PolV的生化特性敏感的依賴于實(shí)驗(yàn)條件（如核苷酸輔因子的性質(zhì)、模板-引物接頭的幾何性狀），進(jìn)而導(dǎo)致了在體外實(shí)驗(yàn)中取得的不同的、甚至相互沖突的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。福克斯等人并認(rèn)為：“RecA震動(dòng)模型”整合了現(xiàn)有的大部分相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并可能成為調(diào)和該領(lǐng)域中許多長期存在且令人困惑的矛盾和爭論的一個(gè)范例。（17）注：“RecA震動(dòng)模型”比“順式激活模型”和“反式激活模型”更加復(fù)雜，其有效性建立在許多尚需驗(yàn)證的假設(shè)之上。此外，與“順式激活模型”相比（“RecA震動(dòng)模型”不再認(rèn)為PolV能在延伸過程中置換RecA*），“RecA震動(dòng)模型”同“反式激活模型”之間的矛盾或許更加尖銳，兩者在PolV的激活方式上仍持不同觀點(diǎn)；兩者對“ATP和ADP在PolV的DNA合成過程中所發(fā)揮的作用”的解釋亦截然不同，正相反對。PolⅣ和PolV的生理功能。（一）PolⅣ和PolV均可在DNA損傷反應(yīng)中通過TLS促進(jìn)DNA復(fù)制的連續(xù)性和基因組的完整性（18）（31）。此外，PolⅣ有較高的本底水平和很高的保守性（PolⅣ的同源物存在于迄今被研究過的所有生物體中[PolV的同源物則僅在原核生物中被發(fā)現(xiàn)]），并可延伸錯(cuò)位（凸起）的模板/引物接頭（1）（31），且可以相對較高的保真度對含有某些小溝損傷（如N2-furfuryl-dG、N2-CEdG）的DNA進(jìn)行TLS（98）（99），因而在正常生長的細(xì)胞中，“催化（由異常模板/引物接頭導(dǎo)致的）停滯復(fù)制叉的重啟（31）”和“對含有某些頻發(fā)且較難被切除修復(fù)的小溝損傷的DNA進(jìn)行TLS（40）（98）（99）”很可能是PolⅣ的（可解釋其高本底水平和保守性的）兩項(xiàng)重要生理功能。（二）古德曼等人2002年通過以E.coli為材料進(jìn)行的有關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示：在細(xì)胞因養(yǎng)分脅迫而處于靜止期時(shí)，PolⅣ和PolV可通過確保染色體復(fù)制和促進(jìn)遺傳多樣性，增強(qiáng)和提高細(xì)胞的長期生存能力和進(jìn)化適合度（注：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，不存在能夠造成DNA損傷進(jìn)而引發(fā)SOS反應(yīng)的外部因素[如紫外照射]。）（86）。目前，“在細(xì)胞受到選擇壓力并處于靜止期時(shí)促進(jìn)遺傳多樣性是否是PolⅣ和PolV的一項(xiàng)生理功能”還有待進(jìn)一步確證，但有越來越多的證據(jù)（許多來自于E.coli中的適應(yīng)性突變研究（100））顯示：答案很可能是肯定的（15）（17）（100）。（三）雖然目前尚無PolⅣ和PolV參與堿基切除修復(fù)過程的遺傳證據(jù)，但有研究顯示：AP裂合酶活性為PolⅣ和PolV所固有（101）。（四）PolⅣ（或PolⅡ）和PolV可以同核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)一起修復(fù)存在于兩條互補(bǔ)鏈上且緊密間隔的DNA損傷，并導(dǎo)致突變率的提高（核苷酸切除修復(fù)誘發(fā)突變-NERiM），該過程不依賴于活躍的DNA復(fù)制，甚至可在靜止期E.coli中發(fā)生（注：在發(fā)生于靜止期E.coli的NERiM過程中，PolⅡ基本不發(fā)揮作用。）（102）。（五）有研究人員在有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上指出：PolⅣ很可能在重建解體復(fù)制叉的過程中發(fā)揮作用（103）（104）。在通過BIR路徑重建解體復(fù)制叉的過程中，在包含PolⅢ的復(fù)制叉被重新建立前，D環(huán)的穩(wěn)定可能需要PolⅣ對侵入鏈3'端的延伸（可能無需β滑動(dòng)夾（48））。（103）（105）（六）目前有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)達(dá)到SOS反應(yīng)誘導(dǎo)水平時(shí)，PolⅣ可在一定程度上降低DNA的復(fù)制速度，而PolⅣ的過量合成（如：>100000拷貝/細(xì)胞）則可顯著抑制DNA復(fù)制，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡（106-108）（其原因可能是：過量合成時(shí)，PolⅣ可不受控制的取代PolⅢ與模板/引物接頭結(jié)合（106）（107）。的確，在體外，當(dāng)PolⅣ對PolⅢ的濃度比達(dá)于SOS反應(yīng)條件下的3倍時(shí)，PolⅣ已可不必接觸β滑動(dòng)夾，而直接通過與PolⅢ的相互作用取代PolⅢ與模板/引物接頭結(jié)合，從而使PolⅢ的延伸能力[較PolⅣ不存在時(shí)]下降2倍（43）。），PolⅣ也因此被認(rèn)為發(fā)揮著DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)效應(yīng)器的作用，可在DNA損傷反應(yīng)中遲滯DNA復(fù)制（106）（107）（該觀點(diǎn)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。現(xiàn)有的與該觀點(diǎn)不相一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PolⅣ功能的缺失并未使E.coli對可導(dǎo)致不能被PolⅣ通過的DNA損傷的作用劑[如紫外照射]表現(xiàn)出增強(qiáng)的敏感性。（43））。（七）PolⅣ可與轉(zhuǎn)錄延伸因子NusA相互作用，進(jìn)而恢復(fù)因DNA損傷陷于停滯的轉(zhuǎn)錄過程（“轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)TLS”）（109）。PolⅣ、UmuC、UmuD、RecA、PolV之間的相互作用及影響和由UmuC、UmuD構(gòu)成的DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)。現(xiàn)有的有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：（一）PolⅣ可與RecA、UmuD2和UmuD'2直接相互作用，并形成穩(wěn)定的復(fù)合物（PolⅣ-RecA、PolⅣ-UmuD2、PolⅣ-UmuD'2、PolⅣ-RecA-UmuD2、PolⅣ-RecA-UmuD'2）。（110）（二）在快速生長的E.coli細(xì)胞中，UmuD的過量合成可顯著抑制PolⅣ的致-1移碼活性，而UmuD的缺失則可顯著促進(jìn)PolⅣ的致-1移碼活性。（110）（三）在因饑餓而處于靜止期的E.coli菌株（FC40）中，UmuD（或UmuD'）的過量合成可顯著抑制PolⅣ的致-1移碼活性。（110）（四）UmuD對PolⅣ的致-1移碼活性的抑制需要RecA，UmuD和RecA可能通過限制PolⅣ的相對開放的活性位點(diǎn)抑制其對錯(cuò)位（凸起）的模板/引物接頭的延伸；UmuD和RecA可顯著抑制PolⅣ延伸錯(cuò)配模板/引物接頭的能力，但可大幅（>20倍）提升PolⅣ延伸正確配對的模板/引物接頭的能力。（110）（五）UmuD缺失對野生型E.coli的PolⅣ依賴性NFZ抗性沒有影響；因突變不能通過N2-furfuryl-dG的PolⅣ（DinB(F13V)）仍能有效促進(jìn)-1移碼突變的發(fā)生。（110）（六）PolⅣ可通過與UmuD2的相互作用，抑制由RecA*催化的UmuD2的自裂解，進(jìn)而抑制PolV的形成。（110）（七）PolⅣ的過量合成可顯著抑制PolV的致變性。這可能是因?yàn)椤癙olⅣ會(huì)與PolV競爭模板/引物接頭”，或者是因?yàn)椤癙olⅣ會(huì)通過與UmuD2的相互作用，抑制PolV的形成”。（110）（八）在30℃生長條件下，UmuD和UmuC的細(xì)胞含量的提高可在不影響蛋白質(zhì)合成的情況下抑制DNA復(fù)制（111）（112）；在受紫外照射的E.coli細(xì)胞中，UmuD和UmuC可遲滯DNA復(fù)制的重啟（111）。（九）UmuD2'C可通過與RecA*的相互作用抑制同源重組（113）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合表明：（一）在對數(shù)期和靜止期細(xì)胞中，UmuD2和RecA可通過與PolⅣ的直接相互作用顯著抑制其致-1移碼活性；（二）PolⅣ的致-1移碼活性和它通過某些N2-鳥嘌呤加合物的能力在遺傳上相互獨(dú)立且可彼此分離。（三）UmuD和UmuC可能發(fā)揮著DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)的作用，即：在DNA損傷發(fā)生時(shí)調(diào)控DNA復(fù)制，以避免DNA損傷在復(fù)制過程中進(jìn)一步惡化，并在DNA復(fù)制重啟前為高保真度的DNA損傷處理機(jī)制（如核苷酸切除修復(fù)）提供更多的運(yùn)作時(shí)間，從而提高細(xì)胞的生存率（111）（114）。（四）UmuD可抑制突變的發(fā)生，而UmuD'可促進(jìn)突變的發(fā)生，UmuD'的出現(xiàn)則表示細(xì)胞從依憑高保真度DNA損傷處理機(jī)制向選擇低保真度DNA損傷處理機(jī)制（即：PolV的TLS）過渡以及從低突變狀態(tài)向高突變狀態(tài)轉(zhuǎn)變（115）。最后，值得注意的是，如果有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明“RecA和UmuD可在不影響PolⅣ的TLS能力的情況下，抑制PolⅣ的致堿基置換活性”，那么根據(jù)上述（一）-（五）中描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及思羅爾等人取得的有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（即：在經(jīng)呋嗎唑酮[NFZ]處理的E.coli細(xì)胞中，PolⅣ的活動(dòng)不集中于復(fù)制叉，且其募集不依賴于β滑動(dòng)夾，而可能需要RecA。）（48），關(guān)于PolⅣ和PolV參與的后復(fù)制缺口修復(fù)，至少在某些情況下，似乎存在以下兩種（不同于福克斯等人之觀點(diǎn)的）可能：（一）在包含小溝損傷的后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，PolⅣ隨機(jī)結(jié)合至空置模板/引物接頭后，存在于模板/引物接頭下游的RecA*可通過其3'末端與PolⅣ的相互作用，為PolⅣ與模板-引物接頭的結(jié)合提供額外的穩(wěn)定性，從而顯著提高PolⅣ與（在模板/引物接頭上游的dsDNA上自由滑動(dòng)的）β滑動(dòng)夾隨機(jī)結(jié)合的概率，進(jìn)而使得PolⅣ能夠（比福克斯等人設(shè)想的）更加高效的進(jìn)行TLS，并可在TLS前、后參與后復(fù)制缺口修復(fù)。這非常類似于?？怂沟热嗣枋龅腜olV參與的包含大溝損傷的后復(fù)制缺口修復(fù)過程，可能的不同之處在于：（1）在TLS前、后，即使不與β滑動(dòng)夾結(jié)合，PolⅣ也可在RecA和UmuD的輔助下功能性的結(jié)合至模板/引物接頭，從而參與后復(fù)制缺口修復(fù)；（2）生理?xiàng)l件下，由于RecA和UmuD對PolⅣ的致變活性的抑制，相較由PolV復(fù)制的DNA片段，在由PolⅣ復(fù)制的DNA片段中，非定標(biāo)突變的發(fā)生頻率明顯偏低。（二）在包含大溝損傷的后復(fù)制缺口修復(fù)過程中，PolⅣ可導(dǎo)致（或參與導(dǎo)致）TLS補(bǔ)丁下游的低突變區(qū)的形成。本文摘編自：“適應(yīng)性突變的四種主要模型及本質(zhì)（2023版）——曲競超著”作者聯(lián)系方式：“生物進(jìn)化與適應(yīng)”（微信公眾號）chaoranzhai@（郵箱）

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