侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導(dǎo)的急性非感染咽喉炎大鼠的保護(hù)作用研究

侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導(dǎo)的急性非感染咽喉炎大鼠的保護(hù)作用研究*

譚艷輝，張宇，龍娟，李輝，劉文杰，劉志華，吳衛(wèi)華，劉建新（1．湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，懷化418000；2．侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，懷化418000）咽喉炎是一種炎癥免疫性疾病，曾被認(rèn)為是教師的職業(yè)病。由于空氣污染、氣候環(huán)境等多方面因素的影響，咽喉炎的發(fā)病率現(xiàn)已高達(dá)30%～50%，成為臨床上的一種常見病和多發(fā)病，且仍有上升趨勢[1－2]。咽喉炎的病因復(fù)雜、病程較長、且較難徹底治愈嚴(yán)重影響了人們的日常工作和生活[3]。病理研究發(fā)現(xiàn)，咽喉炎的主要病理表現(xiàn)為黏膜充血，淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎癥性細(xì)胞的浸潤[4]。目前臨床上用于治療咽喉炎的藥物比較欠缺且不能完全治愈，停藥后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)[5]?？咕幬锉粡V泛地用于治療感染性的咽喉炎，但針對非感染性的咽喉炎，抗菌藥物則不能發(fā)揮其作用[6]。糖皮質(zhì)激素類藥物也被用于治療非感染性咽喉炎，但長期使用則容易出現(xiàn)很多全身性的不良反應(yīng)[7]。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)針對非感染性咽喉炎新的安全有效的治療藥物是當(dāng)前急需解決的難題。侗藥血馬鞭即廣東紫珠（CallicarpakwangtungensisChun）是馬鞭草科紫珠屬植物，收載入《中華人民共和國藥典》2015版[8]，主要產(chǎn)于中國湖南、湖北、江西、廣西等省。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，藥材中主要含有黃酮、苯丙素糖苷、三萜、酚酸等化學(xué)成分[9]。據(jù)民間用藥記錄，侗藥血馬鞭的根、莖、葉、花、籽均可入藥，有清熱解毒、涼血止血、消炎生肌、抗腫瘤等諸多功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，侗藥血馬鞭具有抗炎（總黃酮）、抑菌（乙醇提取物、揮發(fā)油）、鎮(zhèn)痛（總黃酮）、止血（乙醇提取物）等作用[10]，提示侗藥血馬鞭在炎癥免疫性疾病中具有很好和廣闊的應(yīng)用前景。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)藥物侗藥血馬鞭水提取物浸膏由湖南懷化正好制藥有限公司提供。制備工藝：取1倍份血馬鞭藥草莖葉切段（2～3cm），加入8倍份水，加熱至100℃煮沸后，文火保持煮沸狀態(tài)2h過濾保留濾液。濾渣加入3倍份水重復(fù)上述步驟，取第2次過濾濾渣加入2倍份水重復(fù)提取過濾。將3次過濾的濾液合并，100℃加熱濃縮至約1倍份容量，冷卻后置于4℃降低溫度，隨后置于低溫真空凍干儀中過夜凍干成干燥棕色粉末浸膏；地塞米松，片劑，安徽金太陽生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)為1605102。1.2動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016－0002。1.3試劑伊文思藍(lán)（EB），規(guī)格每瓶1g，購自美國Sigma公司；吡啶，規(guī)格每瓶500mL，購自天津市化學(xué)試劑六廠三分廠；戊巴比妥鈉，規(guī)格每瓶100g，購自美國GENEWIZ公司；甲酰胺，規(guī)格每瓶500mL，購自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1.4儀器UV－4802紫外可見分光光度計(jì)，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；AUY120分析天平，Shimadzu（島津）制作所；RM2235病理切片機(jī)，Leica（萊卡）微系統(tǒng)有限公司；AxioScopeA1顯微鏡，ZEISS（蔡司）公司；Histostar包埋機(jī)，ThermoShandonLimited（賽默飛世爾科技）有限公司。1.5方法1.5.1動(dòng)物分組、給藥及造模將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對照組（灌胃生理鹽水，咽部擦拭生理鹽水）、模型對照組（灌胃生理鹽水；咽部擦拭10%吡啶）、吡啶+侗藥血馬鞭灌胃組（灌胃低、高劑量500、1000mg/kg，咽部擦拭10%吡啶）、吡啶+地塞米松組（灌胃地塞米松4mg/kg，咽部擦拭10%吡啶）。大鼠預(yù)處理給藥連續(xù)5d，每天早晚各1次。最后1次給藥1h后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量60mg/kg，濃度2%）麻醉。約5min后，大鼠尾靜脈注射EB（劑量30mg/kg，濃度5mg/mL）。10min后，用止血鉗和鑷子打開大鼠口腔，將大鼠舌往外稍提出并拉往一邊，采用棉簽吸取130μL10%吡啶溶液，并將其深入大鼠咽部直到感受到阻力，再稍微往回拉，停留轉(zhuǎn)動(dòng)5s，連續(xù)3次。造模1h后，處死大鼠，拍照并取材。1.5.2EB－甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱取0．0525gEB固體粉末溶于7mL甲酰胺溶劑中，渦旋混勻，取1mL用等體積稀釋法將其再依次稀釋4個(gè)濃度梯度（5個(gè)濃度分別為7．5、3．25、1．8125、0．90625、0．453125μg/mL），紫外可見分光光度法（620nm）分別測定5個(gè)不同濃度的EB－甲酰胺溶液的吸光度，并根據(jù)吸光度值和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.5.3咽部組織中EB滲透含量測定取各組大鼠咽部組織，并稱質(zhì)量。加入3．5mL甲酰胺溶劑，55℃溫育24h，然后測量每個(gè)樣品在620nm處的吸光度值，根據(jù)EB－甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)樣本的EB量。1.5.4咽部組織病理檢測每組隨機(jī)取3只大鼠不行EB注射，使其咽部組織不被染料滲透，其余實(shí)驗(yàn)步驟同前。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后獲取大鼠咽部組織，用生理鹽水將其洗凈并吸干表面水分后置于4%甲醛溶液固定3d，然后將組織采用乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸入軟蠟除去二甲苯，隨后進(jìn)行包埋、切片。采用蘇木精－伊紅（HE）染色法染色，封片后鏡下觀察組織形態(tài)。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphpadPrism5．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導(dǎo)的大鼠咽部組織形態(tài)損傷的影響Fig.1EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonpyridine-inducedmorphologicaldamageofrat2結(jié)果2.1侗藥血馬鞭水提取物對吡啶誘導(dǎo)的急性咽喉炎大鼠咽喉部炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用見圖1。正常對照組大鼠咽喉組織部位藍(lán)色較淺，提示EB滲出較少、咽喉組織部位未有明顯的炎癥反應(yīng)。10%吡啶溶液涂抹大鼠咽喉部位造模后，模型對照組大鼠的咽喉組織部位藍(lán)色明顯加深，提示EB大量滲出、咽喉組織存在明顯的炎癥反應(yīng)。陽性藥物地塞米松干預(yù)組大鼠咽喉組織部位藍(lán)色深度明顯弱于模型對照組大鼠，提示地塞米松可抑制吡啶所誘導(dǎo)的咽喉部組織炎癥反應(yīng)。與地塞米松組大鼠相似，侗藥血馬鞭水提取物高、低劑量組大鼠咽喉組織部藍(lán)色也明顯弱于模型對照組大鼠，且呈劑量依賴，提示侗藥血馬鞭水提取物對吡啶誘導(dǎo)的大鼠咽喉炎具有很好的保護(hù)作用。2.2侗藥血馬鞭水提取物對吡啶誘導(dǎo)的急性咽喉炎大鼠咽喉組織EB滲出的影響以所測不同濃度EB－甲酰胺溶液的吸光度值為縱坐標(biāo)，EB濃度為橫坐標(biāo)作圖得到EB－甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。回歸方程為＝0．0528X+0．0014，該標(biāo)曲線性關(guān)系較好，R2＝0．9998。見表1，與正常對照組相比，吡啶誘導(dǎo)咽喉炎模型對照組大鼠咽部組織EB滲透量顯著升高（P＜0．01）。與模型對照組大鼠比較，地塞米松組、1000mg/kg侗藥血馬鞭水提取物高劑量組大鼠咽喉組織EB滲透量明顯減少（P＜0．01或P＜0．05），侗藥血馬鞭水提取物低劑量組大鼠咽喉組織EB滲出也有一定程度的下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。圖2伊文思藍(lán)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2StandardcurveforEvansblue表1侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導(dǎo)的大鼠咽部組織EB滲出的影響Tab.1EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonEvansBlueextractioninpyridineinducedrat表1侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導(dǎo)的大鼠咽部組織EB滲出的影響Tab.1EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonEvansBlueextractioninpyridineinducedrat注：與正常對照組比較，##P＜0．01，與模型對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。（mg/kg）動(dòng)物數(shù)EB滲出量（μg/g組織）正常對照組—50．32±0．07模型對照組—50．66±0．20##地塞米松組460．33±0．07**血馬鞭水提物高劑量組100050．42±0．06*血馬鞭水提物低劑量組50060．52±0．11組別劑量2.3侗藥血馬鞭水提取物對大鼠體質(zhì)量和各臟器的影響大鼠的體質(zhì)量分別于實(shí)驗(yàn)過程中每天稱質(zhì)量獲得。見表2，除地塞米松組大鼠外，其余各組大鼠的體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)過程中基本保持在穩(wěn)定的水平，未出現(xiàn)明顯的下降。但陽性藥物地塞米松組大鼠自實(shí)驗(yàn)開始后，大鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)逐漸的下降，到實(shí)驗(yàn)最后一次稱質(zhì)量時(shí)組內(nèi)大鼠體質(zhì)量平均下降約50g。大鼠處死后，各臟器包括心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟被分離和稱質(zhì)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組大鼠比較，地塞米松組大鼠肝臟質(zhì)量明顯增加（P＜0．05）而脾臟質(zhì)量則顯著的低于正常組大鼠（P＜0．01），見表3。而其余各組大鼠各臟器質(zhì)量與正常組無顯著差異。結(jié)果提示，侗藥血馬鞭水提物的治療安全性優(yōu)于地塞米松。2.4侗藥血馬鞭水提取物對吡啶誘導(dǎo)的急性咽喉炎大鼠咽部組織病理損傷的影響大鼠造模完成后，獲取各組大鼠咽喉組織進(jìn)行病理檢測，見圖3。正常對照組大鼠咽喉組織黏液腺細(xì)胞排列緊湊、且未觀察到明顯的炎性細(xì)胞的浸潤；而模型對照組大鼠的咽喉組織中則表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞大量的浸潤、黏液腺細(xì)胞排列分散不規(guī)則且部分肥大破裂，并伴隨出血；地塞米松和侗藥血馬鞭水提物高劑量組大鼠咽喉組織僅出現(xiàn)輕微出血、鏡下觀察不到較大的出血點(diǎn)，細(xì)胞排列相比模型對照組大鼠有相當(dāng)大的改善，僅出現(xiàn)個(gè)別的黏液腺細(xì)胞肥大的狀況；侗藥血馬鞭水提物低劑量組大鼠咽喉組織情況僅比模型組稍有改善，但仍有黏液腺細(xì)胞破裂肥大、中性粒細(xì)胞增多的表現(xiàn)。提示侗藥血馬鞭水提取物和陽性藥物地塞米松對吡啶所誘導(dǎo)的急性咽喉炎大鼠咽喉組織損傷有較好的保護(hù)作用。3討論本研究初步證明了侗藥血馬鞭水提取物對吡啶誘導(dǎo)的急性非感染性咽喉炎大鼠模型具有較好的保護(hù)作用。目前，實(shí)驗(yàn)性咽喉炎動(dòng)物模型的種類不多，其中以氨水直接噴霧大鼠咽喉組織來復(fù)制的急性咽喉炎大鼠模型較為經(jīng)典[11]，但死亡率過高，因此使用非常受限。本實(shí)驗(yàn)采用10%的吡啶溶液來建立大鼠急性咽喉炎模型來評(píng)估侗藥血馬鞭水提取物的抗咽喉炎作用。該模型于2014年被G．L．Viswanatha等[12]報(bào)道，相比氨水急性咽喉炎模型，具有低死亡率、高成功率等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該模型建立簡單，且容易控制，造模成功率高。但本模型的建立與G．L．Viswanatha課題組所建立的動(dòng)物模型還存在有一些差異，比如采用尾靜脈注射EB溶液，而他們則需要建立靜脈給藥通道，因此本實(shí)驗(yàn)的操作大大的縮短了模型建立的時(shí)間和減少了對動(dòng)物的損傷，更有利于藥物的治療評(píng)價(jià)。圖3侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導(dǎo)的大鼠咽部組織病理損傷的保護(hù)作用（×400）Fig.3ProtectiveeffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonagainstpyridine-inducedhistologicalchangesinrat(×400)表2侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導(dǎo)的大鼠體質(zhì)量的影響Tab.2EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonweightofratsinpyridine-inducedrat（x±s）表2侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導(dǎo)的大鼠體質(zhì)量的影響Tab.2EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonweightofratsinpyridine-inducedrat（x±s）組別劑量（mg/kg）動(dòng)物數(shù)體質(zhì)量（g）第1天第2天第3天第4天第5天正常對照組—5249．6±12．1245．4±9．1240．6±8．2241．2±8．2230．6±13．8模型對照組—5253．2±6．9248．1±6．5240．3±6．0237．0±4．9235．7±6．1地塞米松組46230．9±9．5228．8±9．5218．5±14．4201．1±15．7182．6±14．9血馬鞭水提物高劑量組10005243．4±8．8234．5±12．4232．4±12．6232．4±14．6223．6±15．5血馬鞭水提物低劑量組5006232．0±13．0226．7±12．6224．2±14．2227．0±13．1215．0±15．8表3侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導(dǎo)的大鼠各臟器質(zhì)量的影響Tab.3EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonweightofratdifferentorgansinpyridine-inducedrat表3侗藥血馬鞭水提物對吡啶誘導(dǎo)的大鼠各臟器質(zhì)量的影響Tab.3EffectofthewaterextractofCallicarpakwangtungensisChunonweightofratdifferentorgansinpyridine-inducedrat注：與正常對照組比較#P＜0．05，##P＜0．01。組別劑量（mg/kg）動(dòng)物數(shù)心臟（g）肝臟（g）脾臟（g）兩肺（g）雙腎（g）正常對照組—50．82±0．088．77±1．750．44±0．171．17±0．222．16±0．22模型對照組—50．90±0．1810．73±1．370．48±0．071．27±0．322．06±0．77地塞米松組460．81±0．1011．55±1．70#0．16±0．03##0．99±0．212．16±0．15血馬鞭水提物高劑量組100050．75±0．168．81±1．660．46±0．161．51±0．161．84±0．56血馬鞭水提物低劑量組50060．79±0．076．77±1．250．52±0．040．93±0．381．98±0．54咽喉組織EB滲出量的增加是吡啶誘導(dǎo)建立大鼠咽喉炎模型成功與否的判斷指標(biāo)之一，也是藥物干預(yù)治療作用的主要藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠咽喉組織EB