菌種保藏技術-菌種保藏原理與方法

一、斜面低溫保藏法規(guī)程

1.材料和工具(1)待保藏菌種細菌、酵母菌、放線菌和霉菌斜面菌種。(2)無菌培養(yǎng)基試管斜面牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏細菌)，麥芽汁培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏酵母),高氏1號培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏放線菌)。(3)工具接種環(huán)、冰箱、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱等。2.操作(1)貼標簽取裝有各種培養(yǎng)基的無菌試管斜面各3支，將寫有菌株名稱、接種人和接種日期的標簽貼在試管斜面的正上方，距試管口2-3cm處。(2)接種在無菌條件下，用接種環(huán)挑取待保藏的斜面菌種，以無菌操作法移接至相應的無菌培養(yǎng)基試管斜面上(在培養(yǎng)基斜面上劃線移接)。(3)培養(yǎng)將移接好的細菌斜面置于37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)18~24h,酵母菌斜面置于28~30℃培養(yǎng)36~60h,放線菌和絲狀真菌斜面置于28℃培養(yǎng)4~7天。(4)保藏試管斜面長好后，可直接放人4℃冰箱保藏。為防止棉塞受潮長雜菌，管口棉花應用牛皮紙包扎，或換上無菌膠塞，亦可用熔化的固體石蠟熔封棉塞或膠塞。3.注意事項(1)細菌和酵母菌宜采用對數(shù)生長期的細胞，而放線菌和絲狀真菌宜采用成熟的孢子。(2)挑菌時只需用接種環(huán)前端在菌苔上部刮取少量菌體，接種時用含菌的前端在待接斜面培養(yǎng)基表面輕輕摩擦，線條流暢，切不可亂劃、劃破培養(yǎng)基。(3)接種過程中，接種工具、試管、試管塞不能放到臺面上，一直拿在手中。接種環(huán)自菌種管轉(zhuǎn)移至斜面過程中，切勿通過火焰或接觸其他物品，以防接種失敗或污染雜菌。隨時進行接種器具的灼燒滅菌。(4)保藏溫度不宜過低，否則斜面培養(yǎng)基因結(jié)冰、脫水而加速菌種的死亡。

酵母菌、霉菌、放線菌及有芽孢的細菌可保存2-6個月，不產(chǎn)芽孢的細菌最好每月移種一次。二、液體石蠟保藏法1.材料和工具(1)待保藏菌種細菌、酵母菌、放線菌和霉菌斜面菌種。(2)無菌培養(yǎng)基試管斜面牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏細)、麥芽汁培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏酵母)，高氏1號培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏放線菌)。(3)試劑和器材液體石蠟、250ml三角瓶、接種環(huán)、冰箱、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、無菌滴管、高壓蒸汽滅菌鍋。2.操作(1)液體石蠟滅菌

在250ml三角燒瓶中裝人100ml液體石蠟，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，121℃濕熱滅菌30min,連續(xù)滅2次，然后于40℃溫箱中放置14天(或量于105-110℃烘箱中1h),以除去石蠟中的水分，備用。(2)接種培養(yǎng)同斜面保藏法接種操作。(3)加液體石蜻用無菌滴管吸取液體石蠟以無菌操作加到已長好的菌種斜面上，加入量以高出斜面頂端約lcm為宜。

(4)保藏棉塞外包牛皮紙，將試管直立放置于4℃冰箱中保存。(5)恢復培養(yǎng)用接種環(huán)從液體石蠟下挑取少量菌種，在試管壁上輕靠幾下，盡量使油滴凈，再接種于新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由于菌體表面粘有液體石蠟，生長較慢且有粘性，故一般須轉(zhuǎn)接2次才能獲得良好菌種。3.注意事項（1）從液體石蠟封藏的菌種管中挑菌后，接種環(huán)上帶有油和菌，故接種環(huán)在火焰上滅菌時先在火焰邊烤干再直接灼燒，以免菌液四濺，引起污染。（2）利用這種保藏方法，霉菌、放線菌、有芽孢細菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1-2年，一般無芽孢的細菌也可保藏1年左右。

三、沙土管保藏

1.材料和工具(1)菌種產(chǎn)芽孢細菌、形成孢子的放線菌和霉菌斜面菌種。(2)培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。(3)試劑和器材液體石蠟、P205或CaCl2、10%HCI、無菌水、甘油、河沙、瘦黃土(有機物含量少的黃土)。無菌試管10支、5ml無菌吸管、1ml無菌吸管、接種環(huán)、40目及100目篩子、干燥器、冰箱、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋。2.操作（1）沙土處理①沙處理取河沙經(jīng)40目過篩，去除大顆粒，加10%HC浸泡(用量以浸沒砂面為宜)2-4h(或煮沸30min)，以除去有機雜質(zhì)，然后倒去鹽酸，用清水沖洗至中性，烘干或曬干，備用。②土處理取非耕作層瘦黃土(不含有機質(zhì))，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性，然后烘干粉碎，用100目過篩，去除粗顆粒后備用。（2）裝沙土管將沙與土按2:1、3:1或4：1

(W/W)比例混合均勻裝人試管中后干燥（3）無菌試驗任取一支試管中少許沙土放入牛肉膏蛋白胨或麥芽計培養(yǎng)液中，在最適的溫下培養(yǎng)2~4天，確定無菌生長時才可使用。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，經(jīng)從新滅菌后，再做無菌試驗，直到合格。（4）制備菌液用5ml無菌吸管分別吸取3ml無菌水至待保藏的菌種斜面上，用接種環(huán)輕輕攪動，制成懸液。（5）加樣用1ml吸管吸取上述菌懸液0.1-0.5ml加入沙土管中，用接種環(huán)拌勻。加入菌液量以濕潤沙土達2/3高度為宜。

（6）將含菌的沙土管放入真空干燥器中，干燥器內(nèi)用培養(yǎng)皿盛p2o5作為干燥劑，可再用真空泵連續(xù)抽氣3-4h，加速干燥。將沙土管輕輕一拍，沙土呈分散狀即達到充分干燥。（7）保藏沙土管可選擇下列方法之一來保藏。①保存于干燥器中；②用石蠟封住棉花塞后放人冰箱保存；③將沙土管取出，管口用火焰熔封后入冰箱保存；④將沙土管裝入有Cacl2等干燥劑的大試管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蠟封口，放人冰箱中或室溫下保存。（8）恢復培養(yǎng)使用時挑少量混有抱子的沙土，接種于斜面培養(yǎng)基上，或液養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)即可，原沙土管仍可繼續(xù)保藏。謝謝

一、菌種保藏的目的和原理

微生物菌種資源是自然資源的重要組成部分，是生物多樣性的重要體現(xiàn)，也是微生物科學研究、教學及生物技術產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的基礎，在國民經(jīng)濟建設中發(fā)揮重要作用。微生物菌種收集、整理、保藏是一項基礎性、公益性工作，微生物資源的收集和保藏具有重要意義，可以為科技工作者從事科研活動提供物質(zhì)基礎，為政府決策提供依據(jù)。微生物純培養(yǎng)的收集、分類和管理，兼具活標本館、基因庫的作用。1、菌種保藏的目的

廣泛收集在科學研究與生產(chǎn)中有價值的菌種；研究它們的生物學特性；研究和采取妥善的保藏方法，使菌種不死、不污染并盡可能少發(fā)生變異；編制菌種目錄，為掌握和利用微生物資源提供依據(jù)。

2、菌種保藏的原理

選擇適宜的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和菌齡，以便得到健壯的細胞或孢子；保藏于低溫、隔氧、干燥、避光的環(huán)境中，盡量降低或停止微生物的代謝活動，減慢或停止生長繁殖；不被雜菌污染，在較長時期內(nèi)保持著活力。3、菌種保藏的要求

應針對保藏菌株確定適宜的保藏方法；同一菌株應選用兩種或兩種以上方法進行保藏；只能采用一種保藏方法的菌株或細胞株必須備份并存放于兩個以上的保藏設備中；菌種保藏方法參照相應的標準操作規(guī)程；菌種的入庫和出庫應記錄入檔，實行雙人負責制管理；重要菌種應異地保藏備份；高致病性病原微生物和專利菌種應由國家指定的保藏機構(gòu)保藏；菌種保藏設施應確保正常運行，設專人負責管理，定期檢修維護；菌種保藏設施應有備用電源，防止斷電事故發(fā)生；保藏機構(gòu)要定期檢查菌種保藏效果，有污染或退化跡象時，要及時分離純化復壯；每次檢查要有詳細記錄。二、菌種保藏的方法及特點1、斜面低溫保藏法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。此法廣泛適用于細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。放線菌、霉菌和有芽孢的細菌一般可保存6個月左右，無芽孢的細菌可保存1個月左右，酵母菌可保存3個月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蠟封口，置于4℃冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發(fā)、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。這一改進可使菌種的保藏期延長。此法由于采用低溫保藏，大大減緩了微生物的代謝繁殖速度，降低突變頻率；同時也減少了培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，使其不至于干裂。該法的優(yōu)點是簡便易行，容易推廣，存活率高，故科研和生產(chǎn)上對經(jīng)常使用的菌種大多采用這種保藏方法。其缺點是菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。2、石蠟油封藏法此法是在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。使用的液體石蠟要求優(yōu)質(zhì)無毒，化學純規(guī)格，其滅菌條件是：150～170℃烘箱內(nèi)滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置于80℃的烘箱內(nèi)烘干除去水分。由于液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處于缺氧狀態(tài)下，而且又防止了水分揮發(fā)，使培養(yǎng)物不會干裂，因而能使保藏期達1～2年，或更長。這種方法操作簡單，它適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細菌等，對霉菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長達10年。但對很多厭氧性細菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。有試驗指出，此法用于保藏紅曲霉很合適，保藏1～2年后存活率為100％；也有報道顯示，某些蕈菌菌絲用石蠟油保藏法，在3～6℃保藏時菌絲易于死亡，而在室溫下反而較理想，這是值得注意的。3、砂土管保藏法這是一種常用的長期保藏菌種的方法，適用于產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌及形成芽孢的細菌，對于一些對干燥敏感的細菌如奈氏球菌、弧菌和假單胞桿菌及酵母則不適用。其制作方法是，先將砂與土分別洗凈、烘干、過篩(一般砂用60目篩，土用120目篩)，按砂與土的比例為(1～2)﹕1混勻，分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，以121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。也有只用砂或土作載體進行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培養(yǎng)基充分培養(yǎng)，再以無菌水制成108～1010個/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口(或用石蠟封口)，置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏，后者效果更好。砂土管法兼具低溫、干燥、隔氧和無營養(yǎng)物等諸條件，故保藏期較長、效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟簡便。它比石蠟油封藏法的保藏期長，約1～10年。4、麩皮保藏法麩皮保藏法亦稱曲法保藏。即以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。其制作方法是按照不同菌種對水分要求的不同將麩皮與水以一定的比例1﹕(0.8～1.5)拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。因操作簡單，經(jīng)濟實惠，工廠較多采用。霉等，其保藏期可達數(shù)年至數(shù)十年。6、冷凍真空干燥保藏法冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護劑制備擬保藏菌種的細胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。常用的保護劑有脫脂牛乳、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。由于此法同時具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長，一般達5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數(shù)微生物如病毒、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。但該法操作比較煩瑣，技術要求較高，且需要凍干機等設備。7、液氮超低溫保藏法液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護劑，在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細胞內(nèi)的自由水通過細胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細胞損傷。美國ATCC菌種保藏中心采用該法時，把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經(jīng)控制致冷速度，以1℃/min的下降速度從0℃直降到-35℃，然后保藏在-150