應(yīng)用issr指紋圖譜鑒定上海早梨3個主栽品種

應(yīng)用issr指紋圖譜鑒定上海早梨3個主栽品種

上饒早梨是薔薇科的一種植物。主要品種包括6月份的雪和黃色相思。江西省上饒縣主要分布在花廳市和田墩市等市。上饒早梨,成熟早,且表皮薄、果肉嫩、香甜可口,具有生津潤肺、清熱化痰、解熱消暑之功效,老少皆宜(周愛賢和蔣群華,2014,現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,(23):126-127)。上饒早梨營養(yǎng)豐富,據(jù)測定,100g含8g蘋果酸、8g葡萄糖、10g碳水化合物、1g蛋白質(zhì)、0.1g脂肪、5mg鈣、6mg磷。上饒早梨不但可以鮮食,還可作為中成藥“雪梨膏”的絕佳原料。近年來,上饒早梨的種植業(yè)已經(jīng)得到迅速的發(fā)展,上饒早梨的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化龍頭企業(yè)不斷增加,上饒早梨生產(chǎn)基地達2.2萬畝,產(chǎn)量達三萬多噸。但由于上饒早梨是江西早熟梨的特優(yōu)地方品種,分布范圍較窄,道地性野生資源較少(辜青青等,2010,現(xiàn)代園藝,(9):14-15),因此,大力發(fā)展上饒早梨的產(chǎn)業(yè),實現(xiàn)其規(guī)?；a(chǎn),就必須通過植物組織培養(yǎng)的手段,建立起一整套較為完善的離體快繁技術(shù)體系,培育大量的種苗,從而實現(xiàn)上饒早梨的快速推廣種植。本課題組自2014年以來,在2014年度江西省高等學(xué)?？萍悸涞赜媱澁a(chǎn)學(xué)研合作項目的大力支持下開展了上饒早梨三個主栽品種道地性野生資源的調(diào)查和收集,并對其進行了脫毒快繁的研究工作。本研究擬采用ISSR分子標記的方法,對上饒早梨3個主栽品種(“花廳六月雪”“花廳黃皮消”和“田墩六月雪”)的親緣關(guān)系以及其不同繼代次數(shù)(8~13代)試管苗的遺傳變異進行探究,并構(gòu)建上饒早梨3個主栽品種及其不同繼代次數(shù)試管苗的分子指紋圖譜,旨在為上饒早梨優(yōu)質(zhì)種苗的培育及其道地性主栽品種的鑒定提供參考。1結(jié)果與分析1.1引物的篩選及其擴增利用ISSR分子標記技術(shù)對上饒早梨3個主栽品種樣本(包括種質(zhì)圃種苗和其不同繼代次數(shù)試管苗)20個樣本(S1~S7為花廳六月雪;S8~S13為花廳黃皮消;S14~S20為田墩六月雪,下同)進行分析。引物CW32440沒有擴增出條帶,所以以后的試驗就以9條引物(CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、CW32467、CW32488、CW39119、CW39124和CW39-128)來進行ISSR試驗(圖1)。從9條引物,共獲得47條清晰可辨條帶,其中多態(tài)性條帶24條,平均多態(tài)性比率為51.06%,平均每對引物擴增出4.7條帶,其中2.4條具有多態(tài)性。其中,引物CW32438多態(tài)性最高,為100.00%,引物CW32466多態(tài)性最低,只有20.00%(表1)。上饒早梨3個主栽品種20個樣本的觀測等位基因數(shù)Na值在1.2000~1.7273之間,其均值是1.5106;上饒早梨3個主栽品種20個樣本的有效等位基因數(shù)Ne值在1.0940~2.0000之間,其均值是1.3016;上饒早梨3個主栽品種20個樣本的Nei基因多樣度He值在0.0625~0.3783,其均值是0.1828;上饒早梨3個主栽品種20個樣本的Shannon信息指數(shù)I值在0.0983~0.5607,平均值為0.2753(表1)。這個結(jié)果表明,上饒早梨3個主栽品種20個樣本的遺傳多樣性水平較低。1.2不同主栽品種dna指紋圖譜的構(gòu)建根據(jù)9條引物的ISSR-PCR擴增圖,用quantityone軟件繪制了其電泳模式圖(圖2),通過分析,上饒早梨3個主栽品種20份樣本中引物CW32447、CW32467、CW32488、CW39119和CW39128的擴增條數(shù)均無差異。為此,我們篩選出CW32447、CW32467、CW32488、CW39119和CW39128共5條核心引物,并對5條引物的擴增圖譜進行編碼組合,構(gòu)建了上饒早梨3個主栽品種的DNA分子指紋圖譜(表2)。上饒早梨“花廳六月雪”和“花廳黃皮消”的DNA分子指紋圖譜是相同的,而上饒早梨“田墩六月雪”的DNA分子指紋圖譜與“花廳六月雪”和“花廳黃皮消”相比,差異較大,上饒早梨3個主栽品種的分布具有明顯的地域特征(表2)。因此,我們可以根據(jù)DNA分子指紋圖譜可有效鑒定上饒早梨“田墩六月雪、“花廳六月雪”和“花廳黃皮消”的歸屬地,從而能真正對上饒早梨主栽品種的道地性有了一個明確的理解。1.3不同主栽品種聚類分析利用9對引物在上饒早梨3個主栽品種20個樣品獲得的47條擴增片段,在NTSYS軟件中計算樣品間的遺傳相似系數(shù)(GS值),得到供試材料遺傳相似系數(shù)矩陣(表4)。遺傳相似系數(shù)越大,表明親緣關(guān)系越近,遺傳相似系數(shù)越小,表明親緣關(guān)系越遠。上饒早梨3個主栽品種20個樣品的GS值范圍為:0.6173~1.0000,平均值為0.8066,變幅為0.3827。其中,樣本S6(即“花廳六月雪”)與樣本S8(即“花廳黃皮消”)的GS值最高,達1.000。樣本S11(即“花廳黃皮消”)與樣本S16(即“田墩六月雪”)的GS值最低,達0.5319。樣本S3(即“花廳六月雪”)和S4(即“花廳六月雪”)與樣本S16(即“田墩六月雪”)的GS值也很低,為0.5532(表4)。根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣,利用UPGMA法對上饒早梨3個主栽品種20個樣品進行聚類分析,建立聚類樹狀圖(圖3)。在GS值為0.8177處,上饒早梨3個主栽品種20個樣品可分為2個類群,類群Ⅰ主要包括樣本S1~S7(即“花廳六月雪”)和S8~S13(即“花廳黃皮消”),樣本S14~S20(即“田墩六月雪”)被聚為類群Ⅱ(圖3)。這個結(jié)果與上饒早梨3個主栽品種的DNA分子指紋圖譜相一致。1.4再生苗的擴增上饒早梨“花廳六月雪”對照組(樣本S1)中9條引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、C-W32467、CW32488、CW39119、CW39124和CW391-28的擴增條帶數(shù)為32條,繼代8~13次試管苗(依次是樣本S2~S7)中9條引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、CW32467、CW32488、CW391-19、CW39124和CW39128的擴增條帶數(shù)分別為34、33、35、34、37和35,變異率依次為6.25%、3.13%、9.38%、6.25%、15.63%和9.38%,平均變異率為8.34%(圖2)。上饒早梨“花廳黃皮消”對照組(樣本S8)中9條引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、CW32467、CW32488、CW39119、CW39124和CW39-128的擴增條帶數(shù)為37條,繼代8~12次試管苗(依次是樣本S9~S13)中9條引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、CW32467、CW32488、CW391-19、CW39124和CW39128的擴增條帶數(shù)分別為34、33、34、33和34,變異率依次為8.11%、10.81%、8.11%、10.81%和8.11%,平均變異率為9.19%。上饒早梨“田墩六月雪”對照組(樣本S14)中9條引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32466、CW32467、CW3248-8、CW39119、CW39124和CW39128的擴增條帶數(shù)為36條,繼代8~13次試管苗(依次是樣本S15~S20)中9條引物CW32437、CW32438、CW32447、CW32-466、CW32467、CW32488、CW39119、CW39124和C-W39128的擴增條帶數(shù)分別為37、36、37、36、36和34,變異率依次為2.78%、0%、2.78%、0%、0%和5.56%,平均變異率為1.85%。因此,上饒早梨3個主栽品種分別繼代8~13次,均會造成試管苗一定程度的變異,其中,“花廳黃皮消”連續(xù)繼代造成變異的可能性越大,而“田墩六月雪”連續(xù)繼代造成變異的可能性越小。樣本S1~S7的平均值為0.9438,樣本S8~S13的平均值為0.9443,樣本S14~S20的平均值為0.9529,均高于平均值0.8066(表3)。上饒早梨3個主栽品種繼代8~13次的試管苗的引物CW32447、CW32467、CW32488、CW39119和CW39128擴增位點均十分穩(wěn)定,沒有出現(xiàn)特異性條帶(圖2)。這表明在DNA分子標記層面,上饒早梨3個主栽品種雖然存在一定變異,但這種遺傳差異無顯著性,說明通過帶芽莖段對上饒早梨3個主栽品種進行離體快繁可以保證其遺傳穩(wěn)定性。2不同主栽品種分子標記的應(yīng)用及聚類分析ISSR(inter-simplesequencerepeat),即簡單重復(fù)序列間隔區(qū),是Zietkiewicz等(1994)提出,并是以SSR標記為基礎(chǔ)的一種新DNA標記方法。這種方法操作比較容易。而且實驗結(jié)果十分可靠,具有較穩(wěn)定的實驗重復(fù)性(魏青永等,2016)。傳統(tǒng)上,梨的品種鑒定主要是依靠形態(tài)學(xué)的調(diào)查來進行的。而梨品種的正確甄別是梨種苗培育和種質(zhì)保存最基本的前提。ISSR標記技術(shù)的應(yīng)用為梨品種的快速鑒定提供了一種比較有效的方法。目前,已有許多ISSR分子標記應(yīng)用梨遺傳多樣性及品種鑒定方面的報道。趙國芳(2003)利用ISSR構(gòu)建了梨屬52個栽培品種的指紋圖譜,指出新疆梨應(yīng)該是白梨系統(tǒng)與西洋梨系統(tǒng)形成的種間雜種。朱迎弟(2007)對安徽碭山酥梨自然保護區(qū)梨種質(zhì)資源26個品種進行了ISSR研究,并將26個品種分為8類。尤桂春(2009)對福建省梨種質(zhì)資源56個栽培品種進行了ISSR分析,揭示了56個梨品種之間的親緣關(guān)系。李洪果等(2009)建立了13個砂梨品種的ISSR分子識別卡。單江華等(2010)用ISSR分子標記可將48份新疆梨種質(zhì)資源分為3類。宋燕春(2013)構(gòu)建并優(yōu)化了南亞熱帶地區(qū)梨種質(zhì)資源的ISSR-PCR體系,發(fā)現(xiàn)38份梨品種的遺傳聚類與其低溫需冷的積累量具有相關(guān)性。張起和安華明(2015)通過ISSR分析,發(fā)現(xiàn)貴州59份砂梨種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性和較高遺傳分化,并指出較高遺傳分化的影響因素主要有地理隔離和人為干預(yù)等。在本研究中,應(yīng)用篩選出的10條引物對上饒早梨3個主栽品種20份樣本進行ISSR分子標記分析。UPGMA法聚類分析結(jié)果表明,在GS值為0.8177處,可將上饒早梨主栽品種分為兩類,“花廳六月雪”和“花廳黃皮消”為第Ⅰ類,“田墩六月雪”為第Ⅱ類。同時,依據(jù)其ISSR擴增模式圖進行編碼組合,構(gòu)建了上饒早梨3個主栽品種的DNA分子指紋圖譜。利用這些指紋圖譜的差異,我們可快速鑒定出上饒早梨主栽品種的歸屬地,從而有助于我們對上饒早梨主栽品種的道地性有了一個明確的理解。對梨品種完成分子標記鑒定后,如需擴大梨的種植規(guī)模,就要利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對其進行離體快繁,以獲得足夠數(shù)量的梨優(yōu)良品種的種苗。但在植物離體快繁的過程中,植物經(jīng)過多次繼代后,容易發(fā)生無性系變異。因此,有必要通過DNA分子標記對繼代多次的試管苗進行遺傳穩(wěn)定性的鑒定。李毅丹等(2009)、覃子海等(2013)和楊世鵬等(2015)通過對日本石楠、桉樹和菊芋繼代苗遺傳穩(wěn)定性的AFLP、SSR和ISSR分析,發(fā)現(xiàn)在多次繼代后,日本石楠、桉樹和菊芋的繼代苗無遺傳變異。但高素芳等(2014,中藥材,37(5):744-746)利用ISSR-PCR分子標記檢測當歸試管苗的遺傳穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)其DNA條帶的變異率僅為0.662%,保證了較高的遺傳穩(wěn)定性。利用RAPD分析滇黃芩不同繼代次數(shù)試管苗,發(fā)現(xiàn)39條隨機引物中只有1條引物的帶型發(fā)生變化。陳澤雄等(2013)在對灰氈毛忍冬遺傳穩(wěn)定性的SRAP分析中,發(fā)現(xiàn)繼代1年的試管苗無變異,繼代2年或3年的試管苗分別有2株和4株發(fā)生變異,認為在離體快繁中控制一定的繼代周期可保證其遺傳穩(wěn)定性。柴素芬等(2010)發(fā)現(xiàn)梅菜試管苗繼代4次后,部分引物帶型發(fā)生變化,但變化不顯著,仍具有較高的遺傳穩(wěn)定性,認為梅菜試管苗繼代4次之內(nèi)不會影響其穩(wěn)定遺傳。本試驗結(jié)果與其類似,在本試驗中,通過帶芽莖段對上饒早梨3個主栽品種連續(xù)繼代8~13次,均開始出現(xiàn)一定程度的變異,但這種變異無顯著性,說明上饒早梨3個主栽品種離體快繁在繼代8次或8次以上會出現(xiàn)遺傳變異,但仍可保證其遺傳穩(wěn)定性。3材料和方法3.1接種苗的選擇上饒早梨3個主栽品種“花廳六月雪”種質(zhì)圃種苗(編號S1,對照組)、“花廳黃皮消”種質(zhì)圃種苗(編號S8,對照組)、“田墩六月雪”種質(zhì)圃種苗(編號S14,對照組)、上饒早梨“花廳六月雪”繼代9~13次的試管苗(每次繼代時間為3個月,繼代9~13次試管苗依次分別編號S2~S7)、上饒早梨“花廳黃皮消”繼代9~12次的試管苗(每次繼代時間為3個月,繼代9~13次試管苗依次分別編號S9~S13)和上饒早梨“田墩六月雪”繼代9~13次的試管苗(每次繼代時間為3個月,繼代9~13次試管苗依次分別編號S15~S20)。3.2提取dna的方法采用改良CTAB方法提取方法提取DNA。3.3dntps模板ISSR-PCR擴增體系(25μL)為:DNA模板約50