高中生物選修1專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課件

課題1DNA的粗提取與鑒定一.基礎(chǔ)知識DNA粗提取的基本思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。1.提取生物大分子的基本思路：選用一定的物理或化學方法分離具有不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。課題1DNA的粗提取與鑒定一.基礎(chǔ)知識DNA粗提取的基本思12.DNA的理化特性1)DNA的溶解性在NaCl溶液濃度在0.14mol/L時,DNA溶解度最?。坏陀?或高于)0.14mol/L時，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的降低(或增加)而逐漸增大。DNA的不溶于酒精，某些蛋白質(zhì)溶于酒精2.DNA的理化特性1)DNA的溶解性在NaCl溶液濃度在022)DNA的其它特性①蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對DNA沒有影響②大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60－80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會變性③洗滌劑可以瓦解細胞的細胞膜，但對DNA沒有影響3.DNA的鑒定原理1)DNA＋二苯胺試劑沸水浴溶液變藍色2)DNA可被甲基綠染成綠色2)DNA的其它特性①蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對DNA沒有影3一)實驗原理二.實驗設(shè)計1.破碎細胞，釋放核物質(zhì)動物細胞加蒸餾水讓細胞吸水脹破,過濾得濾液植物細胞加洗滌劑和食鹽,充分研磨蒸餾水對于雞血細胞來說是低滲溶液,水分可大量進入雞血細胞,是細胞脹裂,從而釋放DNA攪拌可加速細胞破裂討論：為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？一)實驗原理二.實驗設(shè)計1.破碎細胞，釋放核物質(zhì)動物細胞加蒸4二)實驗材料的選取選DNA含量較高的生物組織作為材料,成功可能性更大材料：可選魚卵、豬肝、雞血2.除去雜質(zhì)，分離出DNA用濃度為2mol/L的NaCl溶液溶解DNA,逐漸加水稀釋,當降至0.14mol／L時(溶解度最低)可以使DNA析出向DNA的鹽溶液，逐漸加酒精，可析出DNA二)實驗材料的選取選DNA含量較高的生物組織作為材料,成功可5三)實驗步驟1.0.1g/ml的檸檬酸鈉溶液,按1:2的比例與新鮮雞血混合攪拌均勻，將血液置于冰箱中24小時,棄上部澄清液雞血加入檸檬酸鈉溶液液，是為了防止血液凝固。三)實驗步驟1.0.1g/ml的檸檬酸鈉溶液,按1:2的比6三)實驗步驟2.取燒杯中的血細胞液約5~10ml加入到100ml燒杯中，向燒杯中加入20ml蒸餾水，用玻棒沿一個方向快速攪拌5分鐘，加速血細胞在低滲溶液中的破裂3.將2mol/L的氯化鈉溶液50ml緩緩倒入燒杯中，用玻棒沿一個方向攪拌，使DNA溶解于氯化鈉溶液中，過濾取濾液三)實驗步驟2.取燒杯中的血細胞液約5~10ml加入到107三)實驗步驟4.將雞血細胞DNA提取液置于較大的燒杯中，沿燒杯內(nèi)壁緩緩倒入蒸餾水，并不斷攪拌，直到粘稠狀DNA不再析出為止。用玻棒攪拌，使析出的DNA纏繞于玻棒末端。5.將析出的DNA再溶解于2mol/L的氯化鈉溶液中。6.在DNA的氯化鈉溶液中倒入95%的酒精50ml（冷卻過的酒精效果較好)，使DNA再次析出，用玻棒攪拌，使DNA再次纏繞于玻棒末端。2mol/LNaCl溶液冷酒精三)實驗步驟4.將雞血細胞DNA提取液置于較大的燒杯中，沿8三)實驗步驟7.DNA的鑒定：取兩支試管，各加入2ml0.015氯化鈉溶液，將DNA溶解于其中一支試管中，另一支做為對照組。然后，在兩支試管內(nèi)加等量的二苯胺試劑，水浴加熱10min左右，冷卻，觀察實驗現(xiàn)象。三)實驗步驟7.DNA的鑒定：取兩支試管，各加入2ml0.9例1.下列關(guān)于DNA的敘述正確的是(）A.隨著氯化鈉溶液濃度增大，DNA在氯化鈉溶液中的溶解度也增大B.隨著氯化鈉溶液濃度的減小，DNA在氯化鈉溶液中的溶解度也減小C.DNA不溶于酒精，也不溶于0.14mol/L的氯化鈉溶液D.DNA與二苯胺試劑在沸水中加熱，溶液變藍色D例1.下列關(guān)于DNA的敘述正確的是(）D10例2.雞血中含大量紅細胞，實驗室常用雞血提取DNA。根據(jù)DNA提取實驗，完成下列各題。1.為了防止雞血凝血需加入的試劑是。2.將雞血離心，取下層，除去上清的目的是3.向DNA的氯化鈉溶液緩緩加蒸餾水，直至析出DNA不再增加，此時氯化鈉溶液的濃度約為

.檸檬酸鈉去雜質(zhì)0.14mol/L4.若沒雞血，能否用牛羊血代替？為什么？5.若用菜花進行提取,需加入,并充分研磨洗滌劑和食鹽例2.雞血中含大量紅細胞，實驗室常用雞血提取DNA。根據(jù)DN11課題2

多聚酶鏈式反應擴增DNA片段

（PCR）課題2

多聚酶鏈式反應擴增DNA片段

（PCR）12一、基礎(chǔ)知識一)PCR原理PCR是一種在體外快速擴增特定基因或DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。1.PCR的反應條件一定的緩沖溶液--維持pH；DNA模板；分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；四種脫氧核苷酸；耐熱的DNA聚合酶；控制溫度一、基礎(chǔ)知識一)PCR原理PCR是一種在體外快速擴增13因此，DNA復制方向：只能從子鏈的5’端到3’端延伸2.DNA復制的方向DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能將核苷酸連接到DNA片段的3’端。引物能與母鏈的一段堿基序列互補配對的一小段單鏈DNA片段或RNA且需要引物(20～30個核苷酸)因此，DNA復制方向：只能從子鏈的5’端到3’端延伸2.DN14PCR技術(shù)通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合DNA在80～100℃時雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體,雙鏈分開;當溫度降低后雙鏈又能重新結(jié)合成雙螺旋結(jié)構(gòu)因此,PCR過程無需解旋酶,但需耐高溫的DNA聚合酶3.DNA的熱變性原理PCR技術(shù)通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合DNA在15二)PCR的反應過程1.變性：2.復性：3.延伸：循環(huán)升高溫度到900C以上DNA解聚為單鏈溫度降到500C左右兩種引物與兩條單鏈DNA結(jié)合升溫度升到700C左右在DNA聚合酶的作用下用溶液中的脫氧核苷酸根據(jù)堿基互補配對原則合成新DNA鏈二)PCR的反應過程1.變性：2.復性：3.延伸：循環(huán)升高溫16一)實驗操作步驟準備好PCR反應體系的配方用微量移液器按配方在往微量離心管中加入各組分蓋嚴蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合反應液離心10S將離心管放入PCR儀上,設(shè)置好循環(huán)程序進行反應二、實驗操作一)實驗操作步驟準備好PCR反應體系的配方用微量移液器按配方17二)操作提示PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓蒸汽滅菌；②所用試劑在-20℃保存，使用時，放在冰塊上慢慢融化。③分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭。二)操作提示PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污18三、結(jié)果分析與評價---DNA含量的測定1、測定的原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。2、過程①稀釋：2uLPCR反應液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋。②對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③比色三、結(jié)果分析與評價---DNA含量的測定1、測定的原理19④計算DNA含量(g/mL)＝50x(260nm的讀數(shù))x稀釋倍數(shù)50：1g/mL的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02④計算DNA含量(g/mL)＝50x(260nm的讀數(shù))x20課題3血紅蛋白的提取和分離課題3血紅蛋白的提取和分離21課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識一)凝膠色譜法根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，來進行分離。1.概念：思路利用不同蛋白質(zhì)分子的特性(形狀、大小、帶電情況等)差異，分離不同種類的蛋白質(zhì)課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識一)凝膠色譜法根22課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識一)凝膠色譜法2.原理：2）①當相對分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢;②而相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。1)凝膠是由多糖類化合物(如葡聚糖)構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識一)凝膠色譜法2.原理：23課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識二)緩沖液1.概念:在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強酸或強堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識二)緩沖液1.概念:24課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離步驟：1.樣品處理2.粗分離3.純化4.純度鑒定課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離步25課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作1.樣品處理:1)紅細胞的洗滌:目的:去除雜蛋白b低速短時間離心操作:a采集血樣d鹽水洗滌c吸取血漿上層透明的黃色血漿重復bcd步驟三次用五倍體積的質(zhì)量分數(shù)為0.9％的NaCl溶液洗滌加抗凝劑－－檸檬酸鈉課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作1.樣品處理:1)紅細26課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作1.樣品處理:2)血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積,再加40％體積的甲苯,置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘(加速細胞破裂)細胞破裂釋放出血紅蛋白。3)分離血紅蛋白溶液：課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作1.樣品處理:2)血紅27課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作1.樣品處理:3)分離血紅蛋白溶液：過程：離心(以2000r/min,10min)過濾(用濾紙,除去脂溶性沉淀層)分離(用分液漏斗,分出下層的紅色透明液體)課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作1.樣品處理:3)分離28課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作2.粗分離－－透析③過程：①透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)②原理：利用透析袋的半透性某些雜質(zhì)分子比血紅蛋白分子小，可透過透析袋課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作2.粗分離－－透析③過程29課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作3.純化1)凝膠色譜柱的制作：①玻璃管②底塞的制作③頂塞的制作④組裝⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)原理用凝膠色譜法將分子量較大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)除去步驟課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作3.純化1)凝膠色譜柱30課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作3.純化步驟2)凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇②凝膠的前處理③凝膠色譜柱的裝填方法注意:a凝膠裝填時盡量緊密,以降低凝膠顆粒之間的空隙b裝填凝膠柱時不得有氣泡存在課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作3.純化步驟2)凝膠色31課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作3.純化步驟2)凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇②凝膠的前處理③凝膠色譜柱的裝填方法注意:a凝膠裝填時盡量緊密,以降低凝膠顆粒之間的空隙b裝填凝膠柱時不得有氣泡存在④洗滌平衡注意：a液面不要低于凝膠表面，b不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作3.純化步驟2)凝膠色323.樣品的加入和洗脫

1.調(diào)液面2.加樣3.再調(diào)液面

4.洗脫5.收集緩沖液凝膠3.樣品的加入和洗脫1.調(diào)液面2.加樣33課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作3.純化步驟3)樣品加入與洗脫

注意：a不要觸及并破壞凝膠面。b貼壁加樣。c使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作3.純化步驟3)樣品加34課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作4.純度鑒定SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳2.試劑的配制：鑒定血紅蛋白純度。1.目的：3.電泳方法步驟略課題3血紅蛋白的提取和分離實驗操作4.純度鑒定SDS—聚35課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識三)電泳1.概念:帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程2.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳課題3血紅蛋白的提取和分離基礎(chǔ)知識三)電泳1.概念:帶電36課題3血紅蛋白的提取和分離SDS--聚丙稀酰胺凝膠電泳法SDS十二烷基硫酸鈉作用:能使蛋白質(zhì)變性(解聚);