分子生物學(xué)基本技術(shù)課件

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

基本技術(shù)

金光輝、李煒、鄭紅花、宋剛、石松林、劉迎福章喻軍、林筱醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

基本技術(shù)金光輝、李煒、鄭紅花、宋1MolecularBiologyTimelineDNAdiscoveredbyF.Meischer18691910Genesonchromosomes;T.H.Morgan1941Onegene-oneenzyme,Beadle&Tatum1944DNAisgeneticmaterial;Avery,Mcleod&McCarty1953StructureofDNA;Watson,Crick,Franklin,Wilkins1961DiscoveryofmRNA;Brenner,Jacob&Meseleson1966Finishedunravelingthecode;Nirenberg&Khorana1972RecombinantDNAmadeinvitro;P.Berg1973DNAclonedonaplasmid;H.Boyer&S.CohenDiscoveryofreversetranscriptase;H.Temin19731977RapidDNAsequencing;F.Sanger&W.Gilbert1977Discoveryofsplitgenes;Sharp,Robertsetal.1982Discoveryofribozymes;T.Cech&S.Altman20011986CreationofPCR;K.Mullisetal.HumanGenomeProject;Venter,CollinsandmanyothersMolecularBiologyTimelineDNA2目的和要求通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，掌握該領(lǐng)域的基本知識(shí)、基本技能和基本方法;了解分子生物學(xué)這一新興基礎(chǔ)學(xué)科的研究發(fā)展、技術(shù)革新和最新成果;對(duì)分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域、研究方法、臨床應(yīng)用等有完整的認(rèn)識(shí);為今后從事科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)工作奠定基礎(chǔ)。掌握實(shí)驗(yàn)操作中常用儀器的使用和工作原理；學(xué)會(huì)研究中實(shí)驗(yàn)方法的選擇、原理和操作；學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)資料的收集、整理和；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理；學(xué)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析、整理和實(shí)驗(yàn)報(bào)告的正確書寫；了解最新研究動(dòng)向和技術(shù)。通過實(shí)驗(yàn)課程的學(xué)習(xí)加深對(duì)分子生物學(xué)理論知識(shí)的理解，提高科學(xué)思維能力和分析問題、動(dòng)手解決問題的能力，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)扎實(shí)的科研作風(fēng)。目的和要求通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，3實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1．實(shí)驗(yàn)前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，熟悉實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、操作步驟以及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)。2．遵守課堂紀(jì)律，實(shí)驗(yàn)中認(rèn)真操作，保持室內(nèi)安靜。3．保持實(shí)驗(yàn)室和儀器整齊清潔。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，要及時(shí)清掃地板和整理臺(tái)面物品。實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)禁吸煙、隨地吐痰、亂扔紙屑、雜物。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后值日生搞好實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生。實(shí)驗(yàn)室清出的垃圾和試劑要分別倒（放）到指定的位置。離開實(shí)驗(yàn)室前必須切斷電源和關(guān)閉其他應(yīng)關(guān)閉的儀器設(shè)備。注意防火、防盜、防災(zāi)。注意清除安全隱患，提高安全意識(shí)，注意關(guān)水、關(guān)燈、關(guān)電、鎖門。4．實(shí)驗(yàn)室有毒、易燃、易爆、腐蝕和貴重材料應(yīng)謹(jǐn)慎操作、定點(diǎn)存放，領(lǐng)用要登記，使用要記錄。嚴(yán)格按照說明規(guī)范操作各種儀器和使用各種材料和試劑。對(duì)于儀器、重要或危險(xiǎn)物品的操作，必須經(jīng)他人指導(dǎo)、操作熟練后才允許獨(dú)自操作。對(duì)氫氣等易燃?xì)怏w和藥品應(yīng)遠(yuǎn)離火源。5．實(shí)驗(yàn)室物品為實(shí)驗(yàn)專用，不得挪作它用或占為私有。任何人未經(jīng)批準(zhǔn)，不得擅自將實(shí)驗(yàn)室的器材、藥品等拿回宿舍使用或存放。6.愛護(hù)實(shí)驗(yàn)器材。損壞實(shí)驗(yàn)物品按規(guī)定進(jìn)行賠償。7．實(shí)驗(yàn)室內(nèi)必須穿實(shí)驗(yàn)工作服進(jìn)行操作。8．實(shí)驗(yàn)物品和試劑等使用后必須放回原來位置。實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1．實(shí)驗(yàn)前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，熟悉實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、操4實(shí)驗(yàn)操作及實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求一、實(shí)驗(yàn)操作要求1．實(shí)驗(yàn)課前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，熟悉實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、操作步驟以及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)。2．實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)謹(jǐn)操作、仔細(xì)觀察、認(rèn)真實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄。3．準(zhǔn)確認(rèn)真完整清楚記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)記錄需使用專用記錄本，不可使用單片紙或草稿記錄。4．必須掌握操作步驟和實(shí)驗(yàn)流程后才能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)操作及實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求一、實(shí)驗(yàn)操作要求5二、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1．實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求語言準(zhǔn)確精煉、表述流暢。2．實(shí)驗(yàn)報(bào)告嚴(yán)格按照如下格式和內(nèi)容書寫。實(shí)驗(yàn)編號(hào)實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)人、學(xué)號(hào)、實(shí)驗(yàn)組員、實(shí)驗(yàn)日期實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料方法和步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果討論和結(jié)論

實(shí)驗(yàn)思考題3．在寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)，實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮響?yīng)按照該次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)步驟寫出，要明確具體、有針對(duì)性。實(shí)驗(yàn)材料包括實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞或組織、重要的實(shí)驗(yàn)試劑和儀器設(shè)備。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中應(yīng)包括全部實(shí)驗(yàn)過程中觀察到的現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的圖表要有圖名和表名，圖名位于圖下方，表名位于表格上方。圖表需大小合適、標(biāo)注清楚。圖表內(nèi)容和所包含的信息必須在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中使用流暢簡潔語言表達(dá)出來。結(jié)果討論和結(jié)論是對(duì)實(shí)驗(yàn)過程、實(shí)驗(yàn)方法步驟的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的認(rèn)識(shí)體會(huì)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、實(shí)驗(yàn)異?，F(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)思考題的分析和對(duì)該次實(shí)驗(yàn)作出的總結(jié)和結(jié)論。二、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求6分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程實(shí)驗(yàn)一真核細(xì)胞染色體DNA的分離制備DNA樣品的純化、定量和電泳檢測(cè)實(shí)驗(yàn)二大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)三堿變性法小量制備質(zhì)粒DNA的限制性酶切實(shí)驗(yàn)四瓊脂糖凝膠中DNA片段的分離和回收質(zhì)粒DNA的連接和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)五真核細(xì)胞RNA的制備和逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)六Western印跡（上）實(shí)驗(yàn)七Western印跡（下）實(shí)驗(yàn)八外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)九多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)實(shí)驗(yàn)十Northern印跡實(shí)驗(yàn)十一Southern印跡考試分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程實(shí)驗(yàn)一真核細(xì)胞染色體DNA的分離制備7生物技術(shù)（biotechnology):

基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程和酶工程，新生物技術(shù)的核心是基因工程技術(shù)。新技術(shù)：基因操作技術(shù)、生物治療技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物技術(shù)、人類和其他生命體基因組工程、基因治療技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)、生物信息技術(shù)、生物芯片技術(shù)等。生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)：基因藥物、重組疫苗、生物芯片、生物反應(yīng)器、基因工程抗體、基因治療與細(xì)胞治療、組織工程、轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物、獸用生物制品、生物技術(shù)飼料、胚胎移植工程、基因工程微生物農(nóng)藥、環(huán)保、海洋生物技術(shù)，以及現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)發(fā)酵、制藥、輕工食品等傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的改造等領(lǐng)域。生物技術(shù)在世界各國已經(jīng)或正在成為新的產(chǎn)業(yè)生長點(diǎn)。生物技術(shù)（biotechnology):基因工程、細(xì)胞工程8基因工程技術(shù)上游技術(shù)（upstream）——基因工程下游技術(shù)（downstream）——蛋白質(zhì)工程基因工程技術(shù)上游技術(shù)（upstream）——基因工程9上游技術(shù)（upstream）——基因工程重組子的構(gòu)建工程菌的構(gòu)建及高效表達(dá)上游技術(shù)（upstream）——基因工程10基因工程上游技術(shù)基本過程

選擇載體獲得目的基因目的基因與載體的重組重組載體的轉(zhuǎn)化重組子的篩選與鑒定基因工程上游技術(shù)基本過程選擇載體11基因工程技術(shù)下游技術(shù)（downstream）——蛋白質(zhì)工程工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確定新型生物反應(yīng)器的研制高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)分離純化的優(yōu)化控制生物反應(yīng)器等一系列儀器、儀表的設(shè)計(jì)制造超濾、反滲透技術(shù)的應(yīng)用基因工程技術(shù)下游技術(shù)（downstream）——蛋白質(zhì)工程12克?。╟lone）:是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體?；蚩寺。╣enecloning）:指把一個(gè)生物體中的遺傳信息（基因片段）通過無性繁殖轉(zhuǎn)人另一個(gè)生物體內(nèi)的過程。通過基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也稱其為DNA克隆?；蚩寺〖夹g(shù):

包括基因的獲取、基因的重組、基因的克隆化和基因的表達(dá)等。DNA嵌合體（DNAchimera）：內(nèi)、外源DNA插入載體分子所形成的雜合分子（嵌合DNA）。重組（recombination）：構(gòu)建DNA嵌合體分子（重組子）的過程?；蛑亟M（generecombination）:是將不同基因片段連接起來構(gòu)成一個(gè)新的DNA分子的過程?？寺。╟lone）:是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相13分子克隆（molecularcloning）：重組體分子的無性繁殖過程?；蚬こ蹋╣eneticengineering）、又稱為DNA重組技術(shù)（recombinantDNAtechnique）或分子克隆（molecularcloning）:特定基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)技術(shù)。基因操作（genemanipulating）:指所有涉及到DNA或者RNA操作的技術(shù)，或者指所有基因工程和基因工程相關(guān)技術(shù)。分子克?。╩olecularcloning）：重組體分子的14分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)核酸純化技術(shù)離心分離技術(shù)凝膠電泳技術(shù)核酸定量技術(shù)分子雜交技術(shù)序列分析技術(shù)蛋白表達(dá)檢測(cè)純化技術(shù)………………分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)核酸純化技術(shù)15一、核酸純化技術(shù)一、核酸純化技術(shù)16原理

1.

核酸混合物成分:

結(jié)構(gòu)類：細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、其他大分子：DNA、RNA、Protein、糖類、脂類等小分子：氨基酸、小分子糖類和脂類、水、無機(jī)物等

2.關(guān)鍵:DNA、RNA、Protein3.方案:Protein變性

苯酚：強(qiáng)變性25

氯仿：弱變性24

異戊醇：消泡分層1原理1.核酸混合物成分:17方法樣品＋等體積飽和苯酚10kb以上輕柔混勻；10kb以下振蕩離心（12000×g）取上清方法樣品＋等體積飽和苯酚18核酸相Protein變性相有機(jī)相分子生物學(xué)基本技術(shù)課件

4.苯酚的處理：重蒸-飽和-pH

重蒸：去除醌類氧化物飽和：防止核酸損耗

pH：pH7.0-8.0-核酸最適合方法：蒸餾（183℃）0.1%8-羥基喹啉-收集（棕色瓶）-飽和與調(diào)pH≥7.8（Tris-HClpH8.0）-0.2%β-ME,4℃或-20℃保存

8-羥基喹啉的作用：減少酚氧化、提供顏色（黃色）指示、抑制RNA酶活力、螯合金屬離子抑制DNA

酶活性、提取RNA時(shí)與VRC作用使酚由黃變黑。4.苯酚的處理：重蒸-飽和-pH20二、離心技術(shù)二、離心技術(shù)21原理離心力：

F=ω2r

RCF=F/g=ω2r/g=（2π×N）2r/g=1.119×10-5(N)2rg:重力常數(shù)（980cm/s2）

N:轉(zhuǎn)速（rpm，revolationperminute)N=1000（RCF/11.19r）1/2浮力：K=m-mρ0/ρ(M:物質(zhì)質(zhì)量，ρ：物體密度，ρ0：介質(zhì)密度）沉降阻力：f·(dx/dt)（f:摩擦系數(shù)，x：沉降速度，t：沉降時(shí)間）RCF=k+f·(dx/dt)差速離心—密度梯度離心原理離心力：22分子生物學(xué)基本技術(shù)課件23操作離心機(jī)分類：普通6000rpm

高速10000-25000rpm

超速30000-80000rpm平衡溫度-離心力-轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)頭：角轉(zhuǎn)、平轉(zhuǎn)、垂直轉(zhuǎn)操作離心機(jī)分類：普通6000rpm24三、凝膠電泳技術(shù)三、凝膠電泳技術(shù)25

概論

帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳.1937年首創(chuàng)紙電泳技術(shù)后，電泳的種類和應(yīng)用在深度和廣度兩方面均迅速發(fā)展，已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。其中，凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，使它成為分離、鑒定和提純核酸的首選的標(biāo)準(zhǔn)方法。概論帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中26原理電泳法：指帶電荷的樣品（蛋白質(zhì)、核酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。

電泳法可分為自由電泳（無支持體）及區(qū)帶電泳（有支持體）兩大類。前者包括Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。區(qū)帶電泳則包括濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）等。原理電泳法：指帶電荷的樣品（蛋白質(zhì)、核酸等）在惰性支持介27凝膠電泳以淀粉膠、瓊脂或瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大，對(duì)一般蛋白質(zhì)不起分子篩作用，但適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等。應(yīng)用較廣，介紹如下：凝膠電泳28

等電點(diǎn)：DNApI=6.0-7.0

支持介質(zhì)：瓊脂糖、PA

分離范圍：agarose：100bp～60kbPA：5～500bpF=q×EF’=6πrηνF=F’,ν=q?E/(6πrη)

泳動(dòng)率（電泳遷移率）：單位電場(chǎng)強(qiáng)度的泳動(dòng)速度

U=ν/E=q/(6πrη)=(d/t)/(V/L)（cm2/V?S）遷移率單位：10-5（cm2/V?S）球形質(zhì)點(diǎn)的遷移率，首先取決于自身狀態(tài)，即與所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。除了自身狀態(tài)的因素外，電泳體系中其它因素也影響質(zhì)點(diǎn)的電泳遷移率。等電點(diǎn)：DNApI=6.0-7.029電泳影響因素1.樣品DNA物理性質(zhì)

質(zhì)粒構(gòu)象：CC＞L＞OC

線形：㏒10M正比1/U(U:泳動(dòng)率）

2.介質(zhì)性質(zhì)

㏒10U=㏒10U0-KrTU：泳動(dòng)率；U0：自由泳動(dòng)率；Kr：介質(zhì)阻滯系數(shù)；

T：凝膠濃度。

3.電壓：5v/cm,電場(chǎng)強(qiáng)度：V/L4.緩沖液離子強(qiáng)度：0.02～0.2(I＝(ΣCZn)/2）

C：溶液mol濃度；Z：化合價(jià)；n：原子數(shù)目。

TAE、TBE、TPE電泳影響因素1.樣品DNA物理性質(zhì)305.電滲

在電場(chǎng)作用下液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲（electro-osmosis）。其產(chǎn)生的原因是固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學(xué)基團(tuán)，因此常吸附溶液中的正離子或負(fù)離子，使溶液相對(duì)帶負(fù)電或正電。如以濾紙作支持物時(shí)，紙上纖維素吸附OH-帶負(fù)電荷，與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+，帶正電荷移向負(fù)極，若質(zhì)點(diǎn)原來在電場(chǎng)中移向負(fù)極，結(jié)果質(zhì)點(diǎn)的表現(xiàn)速度比其固有速度要快，若質(zhì)點(diǎn)原來移向正極，表現(xiàn)速度比其固有速度要慢，可見應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。5.電滲31瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍

瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的最佳分辨范圍（bp）0.5%1,000～30,0000.7%800～12,0001.0%500～10,0001.2%400～7,0001.5%200～3,0002.0%50～2,000瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度線形32DNA片段長度Agarose濃度使用Marker種類200bp以下3%以上DNAMarkerDL2,000

DNAMarkerDL2,000+15,000

100bpDNALadderMarker200bp～700bp2%～3%DNAMarkerDL2,000

DNAMarkerDL2,000+15,000

100bpDNALadderMarker700bp～1,500bp1%～2%λ-EcoT14Idigest

DNAMarkerDL2,000

DNAMarkerDL2,000+15,000

100bpDNALadderMarker1,500bp～5,000bp0.7%～1%λ-EcoT14Idigest

λHindIIIdigest

DNAMarkerDL15,000

DNAMarkerDL2,000+15,0005,000bp以上0.7%以下λ-EcoT14Idigest

λHindIIIdigest

DNAMarkerDL15,000

DNAMarkerDL2,000+15,000DNA片段長度Agarose濃度使用Marker種類20033分子生物學(xué)基本技術(shù)課件34四、核酸定量技術(shù)四、核酸定量技術(shù)35原理A=㏒10（1/T）=-log(I/I