細胞因子課件

細胞因子

（cytokines）細胞因子

第一節(jié)細胞因子概述

一、概念

細胞因子(cytokine，CK)是由細胞（免疫細胞、非免疫細胞）經(jīng)刺激而合成、分泌的具有廣泛生物活性的小分子蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。

細胞因子免疫細胞：單核－吞噬細胞、T細胞、B細胞和NK細胞非免疫細胞：血管內(nèi)皮細胞、表皮細胞、成纖維細胞、上皮細胞也可以產(chǎn)生細胞因子目前已發(fā)現(xiàn)200余種人類CK細胞因子細胞因子

二、細胞因子的共同特性

1多數(shù)為低分子量的多肽或糖蛋白（1）分子量8～80KD,<200aa

（2）組成單體大多數(shù)，如IL（interleukin）-2、IFN-α二聚體同二聚體：IFN(interferon)-

、IL-10

異二聚體：IL-12(35KD/40KD)；三聚體

TNF(tumornecrosisfactor)(3)多數(shù)為單拷貝的基因(IFN-α除外)

細胞因子2

多細胞來源性一種CK可由不同類型的細胞產(chǎn)生如IL-1可由單核-吞噬細胞、內(nèi)皮細胞、B細胞、成纖維細胞、表皮細胞合成和分泌一種細胞可產(chǎn)生多種CK活化的T細胞可產(chǎn)生IL2～6、IL9、10、14；IFN-γ

細胞因子3短暫的自限性分泌Ck一般無前體狀態(tài)的儲存當CK產(chǎn)生細胞受到刺激后，啟動CK基因轉(zhuǎn)錄，該過程通常十分短暫，且Ck的mRNA極易降解，故CK合成具有自限性。細胞因子(作用方面特性)4高效性10-12mol/L5主要以自分泌（autocrine）、旁分泌（paracrine）形式發(fā)揮效應某些細胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）也可以內(nèi)分泌（endocrine）形式作用于遠端靶細胞,介導全身性反應。某些ck還可以通過細胞內(nèi)分泌（intracrine），直接與細胞內(nèi)受體結(jié)合。細胞因子細胞因子6多效性和重疊性一種ck可以作用不同類型的靶細胞，產(chǎn)生多種生物效應

IFN-α除具有抗病毒作用外，還可以抑制成纖維細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞的增殖；另外還可以活化NK細胞。幾種不同的ck可作用于同一類靶細胞，產(chǎn)生相同或者相似的生物學效應。

IL-4、IL-5、IL-6等均可促進B細胞增殖和分化。細胞因子Swiss小鼠胚胎成纖維細胞細胞因子7拮抗性和協(xié)同性不同的CK對同一靶細胞功能的影響可相互拮抗.

例如IFN-γ可活化巨噬細胞，而IL-4則抑制巨噬細胞功能。協(xié)同性：一種CK可強化另一CK的功能.

例如，低濃度IFN-γ或TNF單獨應用均不能激活巨噬細胞，但聯(lián)合使用則有顯著激活作用。細胞因子8網(wǎng)絡(luò)效應CK的產(chǎn)生、生物學作用、受體表達、相互調(diào)節(jié)等均具有網(wǎng)絡(luò)性。細胞因子細胞因子9CK與激素、神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)共同組成細胞間信號分子系統(tǒng)細胞因子

三、細胞因子的種類

白細胞介素interleukins，ILs干擾素interferon，IFN腫瘤壞死因子tumornecrosisfactor，TNF集落刺激因子colonystimulatingfactor，CSF趨化因子chemokines生長因子growthfactor，GF---六大類（按功能分類）細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子－β家族轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β2、轉(zhuǎn)化生長因子β3骨形成蛋白，生長分化因子激活素與抑制素其它：Nodal蛋白細胞因子按照產(chǎn)生CK的細胞種類進行分類：淋巴因子（lymphokine）主要由淋巴細胞產(chǎn)生；如IL-2、IL-3、IL-4單核因子（monokine）主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生；如TNF-γ、G-CSF和M-CSF其它主要由血管內(nèi)皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞等產(chǎn)生；如EPO、SCF等細胞因子stemcellfactor（SCF）干細胞因子

即：肥大細胞生長因子mastcellgrowthfactor/MGF促進IL-3依賴的早期造血前體細胞的增殖和分化促進肥大細胞增殖促進黑素母細胞的增殖細胞因子第二節(jié)干擾素(IFN)細胞因子干擾素（interferon,IFN）干擾素：是由多種細胞（如單核細胞、淋巴細胞）產(chǎn)生的具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的可溶性糖蛋白。其活性發(fā)揮受細胞基因組的調(diào)節(jié)和控制。細胞因子一、分型(根據(jù)其來源、結(jié)構(gòu)及生物學性質(zhì))1.I型（抗病毒干擾素）IFN-α、IFN-β（1）分類

IFN-α白細胞（主要為單核吞噬細胞）產(chǎn)生分子量19KD多基因產(chǎn)物

IFN-β

成纖維細胞及白細胞以外的細胞產(chǎn)生分子量20KD

單基因產(chǎn)物（2）主要誘生劑：病毒，polyI-C(人工合成雙鏈RNA)細胞因子（3）受體IFN-α、IFN-β的受體為同一種分子，該基因位于21號染色體，幾乎能夠在所有有核細胞表面。

（4）穩(wěn)定性對酸穩(wěn)定，在pH2.0時不被破壞細胞因子2.II型（免疫干擾素）IFN-（1）主要細胞來源

T細胞分子量18kD

單基因產(chǎn)物（2）主要誘生劑

抗原或有絲分裂原

(3)受體

基因位于6號染色體;表達在多數(shù)有核細胞表面

（4）穩(wěn)定性

對酸不穩(wěn)定，在pH值2.0時極易破壞細胞因子同一型IFN按照氨基酸序列和組成差異可分為不同的亞型

23種α：如IFN-α1、IFN-α2、IFN-α31種β:IFN-

β;1種γ:IFN-γ同一亞型又因氨基酸的差異而分為多個亞亞型如：IFN-α1有：IFN-α1a、IFN-α1bIFN-α2有：IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-α2c干擾素的型別細胞因子二干擾素的生物學特性廣譜性種屬特異性差異性相對穩(wěn)定性相對安全性細胞因子IFN的相對穩(wěn)定性IFN-α、IFN-β對pH和溫度比較穩(wěn)定

pH=2的溶液中或60℃放置1h均不失活I(lǐng)FN-γ對pH和溫度的穩(wěn)定性較差

pH<5時不穩(wěn)定

60℃放置1h失活細胞因子IFN的毒副作用流感樣綜合征造血系統(tǒng)改變消化系統(tǒng)反應皮膚反應內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響腎臟損害細胞因子三、主要生物學活性

1.Ⅰ型干擾素（1）抗病毒和抗腫瘤

1）誘導宿主細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，干擾病毒復制；

2）增強NK細胞對病毒感染細胞和腫瘤細胞的殺傷；

3）促進細胞表面MHC（majorhistocopatibilitycomplex）-Ⅰ類分子表達，有助于向CTL(cytotoxicTlymphocyte)細胞提呈抗原，從而實現(xiàn)對病毒感染細胞和腫瘤等靶細胞的殺傷。（2）免疫調(diào)節(jié)：與Ⅱ型干擾素類似。細胞因子靜止的CTL被靶細胞表面抗原肽-MHCI類分子復合物所活化后，就活化為抗原特異性CTL效應細胞，發(fā)揮特異性殺傷靶細胞的功能。主要機制有：分泌穿孔素，穿入靶細胞膜，改變細胞滲透壓，導致細胞溶解分泌多種顆粒酶，介導靶細胞凋亡分泌淋巴毒素，直接殺傷靶細胞細胞因子抗原提呈：是指抗原提呈細胞(antigen-presentingcell，

APC)攝取抗原并將其處理成免疫原性多肽，以抗原肽-MHC分子復合物的形式表達于APC表面，供T細胞識別，從而產(chǎn)生免疫應答的過程。抗原提呈？細胞因子細胞因子2.Ⅱ型干擾素（1）主要起免疫調(diào)節(jié)作用

1）活化巨噬細胞；

2）促進表達MHC-Ⅱ類分子，提高抗原遞呈能力；

3）促進MHC-Ⅰ類分子表達和增強CTL細胞的殺傷活性;4)增強NK細胞的殺傷活性；

5）促進B細胞分化、增殖；（2）抗病毒和抗腫瘤作用(與Ⅰ型干擾素類似)。細胞因子名稱氨基酸數(shù)受體產(chǎn)生細胞功能IFN-α166CD118白細胞抗病毒，抗腫瘤，促進MHCI類分子的表達IFN-β166CD118成纖維細胞抗病毒，抗腫瘤，促進MHCI類分子的表達IFN-143CD119T細胞、NK細胞激活巨噬細胞，促進MHCⅡ分子表達和抗原提呈，抑制Th2細胞干擾素

細胞因子摘自MicrobiologyandImmunologyon-line細胞因子四干擾素的作用分子機制IFN與IFN受體結(jié)合IFN信號傳導途徑，以激活細胞核內(nèi)IFN相關(guān)基因效應蛋白的產(chǎn)生細胞因子JAK（Janusproteintyrosinekinase）-STAT（signaltransducerandactivatoroftranscription）信號通路為IFN誘導基因表達的主要信號通路IFN的信號轉(zhuǎn)導途徑細胞因子干擾素誘導JAK-STAT復合體核內(nèi)轉(zhuǎn)移及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄機制STAT：信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子

細胞因子IFN與受體結(jié)合后引起受體分子的二聚化與受體偶聯(lián)的JAK激酶通過交互的Tyr磷酸化作用而活化活化的JAK激酶催化受體Tyr殘基磷酸化，并形成STAT分子的“停泊位點”細胞因子STAT在JAK激酶的作用下實現(xiàn)其C端Tyr殘基的磷酸化，并形成同/異聚合體，并離開受體STAT與另外一種DNA結(jié)合蛋白形成復合體，進入細胞核，與IFN激活基因的增強子區(qū)段相結(jié)合，去除抗病毒蛋白基因的轉(zhuǎn)錄抑制，相關(guān)蛋白得以轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而使靶細胞處于抗病毒狀態(tài)。細胞因子PKRPathwaysforIFNmediatedantiviralaction干擾素效應分子細胞因子細胞因子五干擾素（抗病毒）生物活性的研究方法

原理：用干擾素樣品處理易感細胞，使細胞建立抗病毒狀態(tài)，然后用適當?shù)亩坎《竟艏毎?，通過病毒復制的量或病毒引起的細胞病變程度可判斷樣品中干擾素的生物活性。細胞因子常用細胞株WISH（人羊膜細胞）、MDBK（牛腎細胞）、L929（小鼠肺纖維瘤）、Hep2/c（人喉癌細胞）要求：易培養(yǎng),對病毒敏感性高,易于誘導抗病毒狀態(tài),對人體無害細胞因子常用病毒濾泡口炎病毒（vesicularstomatitisvirus,VSV）鼠腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis,EMCV）要求:盡可能對人體無害，對靶細胞感染性強，能引起明顯的細胞病變。

常用體系WISH－VSV體系細胞因子What’sthemeaningofthecellline?

Howtosubculturethecellline?細胞因子細胞因子細胞因子細胞因子細胞因子微孔板法測定IFN抑制細胞病變的活性棄培養(yǎng)液,加入待測樣品,使細胞建立抗病毒狀態(tài)接種對數(shù)生長期細胞于細胞培養(yǎng)板倍比稀釋樣品（干擾素）加入病毒液,培養(yǎng)24-48h中性紅染色,550nm測定OD值細胞因子六干擾素的誘生病毒誘生劑dsRNA誘生劑代謝物誘生劑其它細胞因子無菌接取血液置肝素管中低速離心棄血漿，并補入細胞培養(yǎng)液加入少量IFN-α37℃溫浴，以啟動誘導加入病毒，溫浴37℃

離心棄上清液加入細胞培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)18-24hIFN-α的誘生細胞因子離心，取上清液上清液中加入6mol/LHCl，調(diào)pH到2.04℃酸化處理用6mol/LNaOH調(diào)pH到7.2-7.4離心去沉淀，得粗制干擾素細胞因子七干擾素類藥物按制作方法不同，可分為利用基因工程生產(chǎn)的重組干擾素和自然干擾素兩大類。自然干擾素類人體淋巴母細胞多亞型天然干擾素（IFN-N1），葛蘭素威康公司（英國）生產(chǎn)，商品名為惠福仁。細胞因子典型臨床藥物IFN-α1b針劑溶液劑(滴眼液)IFN-α2a針劑栓劑IFN-α2b針劑IFN-γ

針劑細胞因子IFN-α1b人體白細胞重組干擾素IFNα1b：世界上第一個采用中國人干擾素基因克隆和表達的IFNα1b型干擾素。商品名為賽若金。深圳科興生物制品有限公司生產(chǎn)，有300萬U/支和500萬U/支兩種劑量細胞因子特點及理化性質(zhì)基因位于9號染色體分子量19KD166個氨基酸殘基組成白色薄殼狀疏松體等電點4.0-6.5最大吸收峰波長278±3nm由含有高效表達人IFNα1b基因的大腸桿菌,經(jīng)發(fā)酵、分離、純化后制得。細胞因子穩(wěn)定性及保存耐酸（pH=2下穩(wěn)定）熱穩(wěn)定性較好對各種蛋白酶敏感2-8℃避光保存和運輸細胞因子核苷酸序列氨基酸序列(189,23個信號肽)細胞因子IFN-α2a基因位于9號染色體165個氨基酸分子量19.2±1.92KD等電點5.5-6.8最大吸收峰波長278nm±3nm白色薄殼狀疏松體由含有高效表達的人IFNα1b基因的大腸桿菌、釀酒酵母,經(jīng)發(fā)發(fā)酵、分離、純化后制得。細胞因子如何獲得各種蛋白的核酸和蛋白序列？細胞因子細胞因子細胞因子細胞因子細胞因子細胞因子13829二硫鍵198二硫鍵IFN-α2a165個氨基酸細胞因子臨床上常用的IFN-α2a羅氏公司（瑞士）生產(chǎn)的羅擾素，有300萬U/支和450萬U/支兩種劑量，粉劑和水劑兩種劑型；沈陽三生公司生產(chǎn)的因特芬，每支300萬U遼寧衛(wèi)星生物研究所生產(chǎn)的迪恩安，每支300萬U和500萬U兩種劑型，均為粉劑，但備有專用溶解液。細胞因子IFN-α2b基因位于9號染色體165個氨基酸分子量19.2±1.92KD等電點4.0-6.7最大吸收峰波長278nm±3nm白色薄殼狀疏松體，加入標示量注射用水后應迅速復溶為澄明液體由含有高效表達人IFNα2b基因的大腸桿菌、腐生型假單孢菌,經(jīng)發(fā)酵、分離、純化后制得。細胞因子重組人IFN-α2b

165個aaIFN-α2a23位為Lys；IFN-α2b23位為精氨酸IFN-α2b

77位天冬氨酸為糖基化位點細胞因子先靈葆雅（美國）公司生產(chǎn)的干擾素（商品名佩樂能）300萬U/支和500萬U/支，均為粉劑天津華立達公司生產(chǎn)的安福隆，30