免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)組織化學(xué)術(shù)語01概述常用染色方法標(biāo)本的制備目錄0302基本信息免疫細(xì)胞化學(xué)，又稱免疫組織化學(xué)，其主要原理是用標(biāo)記的抗體或抗原對細(xì)胞相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測，經(jīng)過化學(xué)的呈色反應(yīng)后，用顯微鏡或電子顯微鏡觀察。該技術(shù)是免疫熒光技術(shù)與形態(tài)學(xué)技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。概述抗原和抗體的要求抗體（antibody,Ab）抗原（antigen,Ag）概述抗原和抗體的要求·具有特異性高和親和力強(qiáng)的抗體是實(shí)驗(yàn)成功的首要條件。–對抗體的要求：純度高、比活性強(qiáng)；·高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。–對抗原的要求：純度高，免疫原性強(qiáng)，穩(wěn)定無變化?？乖╝ntigen,Ag）·抗原的概念：凡是在機(jī)體內(nèi)引起體液免疫和（或）細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)，稱為抗原?？乖哂袃蓚€(gè)方面的特性：–免疫原性：引起機(jī)體產(chǎn)生抗體和（或）致敏淋細(xì)胞的特性；–免疫反應(yīng)性：抗原能與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異的結(jié)合或反應(yīng)的特性?！じ鶕?jù)抗原是否顯示免疫原性分為：–完全抗原：分子量較大，一般在10kDa以上，并具有較復(fù)雜的化學(xué)組成?！っ庖咴宰顝?qiáng)的是蛋白質(zhì)抗原，多糖次之；脂類和核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。–半抗原：又稱為不完全抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類脂和藥物等。·半抗原必需與載體結(jié)合，才能獲得免疫原性。載體·通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原能力。抗體（antibody,Ab）免疫球蛋白1、抗體的概念：·機(jī)體受到抗原刺激后，由漿細(xì)胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，被稱為抗體。–抗體主要存在于血清內(nèi)；–抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗體。–免疫球蛋白根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種，既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。2、免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體：單克隆抗體和多克隆抗體?！慰寺】贵w：是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，是應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備的。–特異性強(qiáng)、抗體產(chǎn)量高。·多克隆抗體：是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。–特異性低，會(huì)產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng)。標(biāo)本的制備石蠟切片冰凍切片組織印片細(xì)胞培養(yǎng)片（細(xì)胞爬片）細(xì)胞涂片細(xì)胞涂片（續(xù)）010302040506標(biāo)本的制備石蠟切片·石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法–最大優(yōu)點(diǎn)是組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；–石蠟塊還能長期存檔，供回顧研究?！な炃衅谱鬟^程對組織內(nèi)抗原顯現(xiàn)有一定的影響，但可通過某些措施予以改善，因而它是大多數(shù)免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事項(xiàng)·標(biāo)本新鮮：一般在2h以內(nèi)進(jìn)行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴(yán)重彌散?！と〔牟课唬撼〔≡罨蚝龣z抗原部位外，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時(shí)應(yīng)有抗原陽性和陰性區(qū)，以形成自身對照。–細(xì)胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時(shí)應(yīng)盡可能避開壞死區(qū)。冰凍切片·冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接切片?！ぴ谇衅敖M織不經(jīng)過任何化學(xué)藥品處理或加熱過程。–縮短了制片時(shí)間–抗原性不受損失·對穩(wěn)定性差的抗原，如淋巴細(xì)胞表面抗原尤其適合?！そM織凍結(jié)過程中，細(xì)胞內(nèi)、外的水分會(huì)形成冰晶，凍結(jié)的速度愈慢，冰晶顆粒愈大，可嚴(yán)重影響組織、細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。因此制備凍塊時(shí)要求低溫、速凍。1、冰凍組織塊的常用方法·液氮中冰凍：組織投入液氮中（一196C）中10～20sec；·干冰中加入丙酮（或異戊烷），液體立即氣化起泡，溫度降至一70C，將組織投入，若在干冰丙酮中置一盛有異戊烷的容器，組織投入該容器內(nèi)結(jié)凍則更好；–上述組織在速凍時(shí)應(yīng)浸埋于OCT包埋劑或甲基纖維素糊狀液內(nèi)，以保護(hù)組織。組織印片·將潔凈載玻片輕壓于已暴露病灶的新鮮組織切面，細(xì)胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。細(xì)胞培養(yǎng)片（細(xì)胞爬片）·貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，置蓋片于培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞在蓋片上生長，達(dá)適當(dāng)密度后取出固定（丙酮-20C固定10～20min），再進(jìn)行免疫染色。–蓋片的處理方法同載玻片的處理，但泡酸時(shí)間2h即可。–為了防止細(xì)胞脫片，可用多聚賴氨酸處理。細(xì)胞涂片·大多數(shù)細(xì)胞涂片由細(xì)胞懸液制成，包括：–血液、尿液、腦脊液；–體腔積液；–組織穿刺吸取，如骨髓、淋巴結(jié)或其他實(shí)質(zhì)性組織–懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或貼壁細(xì)胞經(jīng)消化后形成的懸液。細(xì)胞涂片（續(xù)）·細(xì)胞涂片的方法：–手涂法·將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到106/ml左右，可直接涂于載玻片上，但要均勻、不重疊?！D片范圍應(yīng)小于1cm直徑，以節(jié)約試劑。–涂片機(jī)涂片法·將細(xì)胞樣品制成2×105～6/ml細(xì)胞懸液，吸取50～100l(1～2×104～5cells)加入涂片機(jī)內(nèi)，1000rpm離心2min后細(xì)胞就均勻分布于玻片上。常用染色方法免疫熒光法親和組織化學(xué)法免疫酶酶標(biāo)法常用染色方法免疫熒光法【原理】免疫熒光技術(shù)·用于免疫熒光的標(biāo)記物是小分子的熒光素，可標(biāo)記抗體或抗原；·熒光素經(jīng)某種特定波長的光照射激發(fā)后，能發(fā)射出一種比激發(fā)光波波長更長而且能量較低的熒光，籍此可作定位觀察或示蹤；·借助于熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。1、常用的熒光素·(1)異硫氰酸熒光素（FluoresceinIsothiocyanate,FITC）·(2)四甲基異硫氰酸羅丹明（TetramethylRhodamineIsothiocyanate,TRITC）·(3)四乙基羅丹明（RB200）·(4)碘化丙啶（propidiumiodide,PI）(1)異硫氰酸熒光素（FITC）免疫酶酶標(biāo)法【原理】·以酶作為標(biāo)記物與外加底物作用后產(chǎn)生不溶性色素，沉積于抗原和抗體反應(yīng)的部位；·酶降解底物的量與色澤濃度成正比。可反映被測定的抗原或抗體的量。1、常用的標(biāo)記酶及其顯色底物·辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）及底物·堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP）及底物(1)辣根過氧化物酶（HRP）及底物·HRP是應(yīng)用最廣的一種酶，來源于植物辣根，由無色的酶蛋白和深棕色的鐵葉琳結(jié)合而成，分子量約40kDa，穩(wěn)定性好；·底物為過氧化物和供氫體（DH2）–過氧化物：常用過氧化氫和過氧化氫尿素。親和組織化學(xué)法·是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)。·這種方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗體）在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位。生物素—抗生物素染色法【原理】·生物素（biotin）又稱維生素H，是一種小分子維生素，分子量為244，是轉(zhuǎn)氨甲酰基化過程中的輔酶?！た股锼兀╝vidin），又稱卵白素或親和素，是一種分子量為的堿性蛋白，對生物素具有很強(qiáng)的親和力，比抗原抗體間的親和力要高出100萬倍。它由4個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基都有生物素的結(jié)合位點(diǎn)?！烧呔?/p>