免疫學技術-免疫細胞及其功能檢驗技術（臨床免疫檢驗課件）

淋巴細胞數(shù)量及功能檢測前言外周血白細胞主要包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞。正常情況下機體各類淋巴細胞的數(shù)量和功能保持相對穩(wěn)定，當人體感染病原微生物或發(fā)生免疫性疾病時，均可引起淋巴細胞數(shù)量和功能變化。臨床上常根據(jù)不同淋巴細胞的表面標志即分化群（CD）進行淋巴細胞及其亞群的數(shù)量檢測。淋巴細胞功能測定可分為體內試驗和體外試驗。通過對機體淋巴細胞及其亞群的數(shù)量和功能測定，可為疾病的診斷、治療、療效評估等提供重要依據(jù)淋巴細胞數(shù)量及功能檢測許多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴細胞數(shù)量和功能變化數(shù)量檢測功能測定根據(jù)淋巴細胞及其亞群的表面標志體內試驗體外試驗間接熒光免疫法T細胞數(shù)量檢測針對T細胞數(shù)量的檢測主要依據(jù)T細胞及其亞群細胞表面標志如CD3、CD4及CD8等分子間接熒光免疫法免疫組織化學法流式細胞術酶標法（ABC法、APAAP法）金標法（即IGSS法）T細胞功能檢測淋巴細胞內細胞因子檢測T細胞增殖試驗CTL介導的細胞毒試驗抗原特異性T細胞定量檢測體內試驗形態(tài)學法3H-TdR摻入法MTT比色法51Cr釋放法MHC-抗原肽四聚體技術結核菌素試驗PHA皮膚試驗流式細胞術T細胞增殖試驗——形態(tài)學法PBMCPHA5％CO2

37℃培養(yǎng)72h細胞涂片染色顯微鏡檢查未轉化淋巴細胞轉化的淋巴母細胞流式細胞術轉化率（％）＝轉化的淋巴細胞數(shù)計數(shù)的淋巴細胞總數(shù)100％×T細胞增殖試驗——3H-TdR摻入法SI＝試驗孔cpm均值對照孔cpm均值外周血T細胞PHA發(fā)生增殖MTT含藍色甲臜顆粒的T細胞有機溶劑測吸光度（A）值計算SI判定細胞增殖結果T細胞增殖試驗——MTT法SI＝試驗孔A均值對照孔A均值(SI≧2具有意義)淋巴細胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細胞腫瘤細胞破壞51Cr釋放測定γ射線CTL介導的細胞毒試驗——51Cr釋放法51Cr特異性釋放率＝試驗孔cmp均值最大釋放孔cmp均值-自發(fā)釋放孔cmp均值-自發(fā)釋放孔cmp均值100％×根據(jù)T細胞活化的雙識別原理，用生物工程技術將MHC分子在體外組裝，并結合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子復合物，結合流式細胞儀定量檢測抗原特異性T細胞抗原特異性T細胞定量檢測MHC-抗原肽四聚體技術用刺激劑體外激活淋巴細胞用蛋白轉運抑制劑阻止細胞因子分泌到細胞外，細胞內細胞因子向高爾基體積聚，用流式細胞儀測定淋巴細胞內的細胞因子種類確定Th1/Th2細胞百分率淋巴細胞內細胞因子檢測Th1和Th2分泌的細胞因子分泌的細胞因子Th1Th2IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++原理體內試驗12結核菌素試驗PHA皮膚試驗B細胞數(shù)量及功能檢測數(shù)量檢測1.mIg的檢測：免疫熒光、免疫組化2.CD分子的檢測：檢測CD19、CD20、CD21、CD22、CD5等3.IgGFc受體的檢測：EA花環(huán)試驗4.小鼠紅細胞受體的檢測：花環(huán)試驗功能檢測1.B細胞增殖試驗：3H-TdR摻入法、MTT2.B細胞抗體產生能力檢測：溶血空斑試驗、ELISPOT經(jīng)典溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗可在單細胞水平上檢測B產生抗體和T細胞分泌細胞因子NK細胞數(shù)量及功能檢測NK細胞功能檢測方法根據(jù)NK細胞表面CD分子進行檢測檢測CD3、CD56、CD16等，計數(shù)CD3-CD56+CD16+的細胞數(shù)即為NK細胞數(shù)形態(tài)學法常采用臺盼藍染色酶釋法LDH釋放法熒光法時間分辨熒光免疫分析法放射性核素釋放法51Cr釋放法125I-UdR釋放法流式細胞術采用碘化丙啶（PI）染色法數(shù)量檢測010203B細胞數(shù)量及功能檢測NK細胞數(shù)量及功能檢測

小結T細胞數(shù)量及功能檢測思考題C細胞免疫是機體重要的免疫反應之一，但細胞免疫反應過程比較復雜，參與反應的成分眾多，影響因素也多種多樣，因此，準確檢測機體細胞免疫水平及其變化具有一定的難度。1.試問目前臨床開展的細胞免疫檢測項目有哪些？如何用于評估機體的細胞免疫功能狀態(tài)？2.試討論細胞免疫檢測新技術的研究現(xiàn)狀及其發(fā)展方向。免疫細胞的分離與純化免疫細胞在人體中擔任著十分重要的角色，各種免疫細胞是完成免疫應答及其調控的基礎。因此，將免疫細胞從混合細胞群體中分離出來對于了解其在免疫應答中的作用及相互關系有著重要意義前言免疫細胞的分離純化指參與免疫應答或與免疫應答相關的細胞主要包括淋巴細胞、單核-巨噬細胞和樹突狀細胞等通過分離、純化免疫細胞及其亞群并對其數(shù)量和功能測定，可以判斷機體免疫功能狀態(tài)對指導臨床實踐和科學研究具有重要意義免疫細胞白細胞分離

自然情況下紅細胞的沉降速度快于白細胞從而達到分離白細胞的目的

某些高分子聚合物（如明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮等）可使紅細胞凝集呈串錢狀，加速紅細胞沉降使之更易與白細胞分離自然沉降法高分子聚合物沉降法外周血單個核細胞分離外周血單個核細胞（PBMC）：主要是指淋巴細胞和單核細胞常用分離液：Ficoll液和Percoll液分離人外周血中各類血細胞密度表細胞種類相對密度紅細胞1.093白細胞1.092血小板1.030~1.035淋巴細胞和單核細胞1.075~1.090Ficoll分離法注意溫度以20℃最適宜，超過25℃影響細胞得率Percoll分離法連續(xù)密度梯度分離液（Percoll液+PBS，離心）加入PBMC懸液或抗凝全血1000×g離心20min淋巴細胞的純化1.黏附法用于去除單核細胞2.羧基鐵吞噬法磁鐵吸引羧基鐵原理3.苯丙氨酸甲酯去除法苯丙氨酸甲酯具有親溶酶體性質1.多次洗滌離心法2-3次離心、洗滌去除大部分血小板2.胎牛血清梯度離心法適用于外周血中血小板異常增多的情況1.低滲裂解法不同細胞對滲透壓的滲透脆性不同2.氯化銨裂解法在PBMC懸液中加入適量0.83%氯化銨去除血小板去除單核細胞去除紅細胞淋巴細胞亞群的分離PBMC懸液與SRBC混合Ficoll法密度梯度離心收集管底細胞并低滲裂解E花環(huán)沉降法：主要用于T細胞的分離淋巴細胞亞群的分離PBMC懸液加入尼龍棉柱37℃中靜置1～2小時獲得T細胞獲得B細胞預熱的含小牛血清培養(yǎng)液洗脫冷培養(yǎng)液邊沖洗邊擠壓尼龍棉分離法可分離T細胞和B細胞淋巴細胞亞群的分離免疫磁珠分離法淋巴細胞亞群的分離流式細胞術分離法是目前比較先進的細胞分離手段和方法吞噬細胞的分離單核細胞分離巨噬細胞分離中性粒細胞分離Percoll密度梯度分離法流式細胞術分離法免疫磁珠分離法