質(zhì)粒不穩(wěn)定性

質(zhì)粒不穩(wěn)定性第1頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒載體不穩(wěn)定的現(xiàn)象克隆有外源基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移到大腸桿菌受體細(xì)胞之后，會(huì)產(chǎn)生一系列的生理效應(yīng)，影響到自身的穩(wěn)定性、可能引起形態(tài)學(xué)上的變化：絲狀現(xiàn)象和脆性增加。產(chǎn)生無質(zhì)粒的突變體或拷貝數(shù)低的突變體。結(jié)構(gòu)重排導(dǎo)致無法正常表達(dá)的突變體。第2頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型分離不穩(wěn)定性指在細(xì)胞分裂的過程中，有一個(gè)子細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒DNA拷貝，并最終增殖為無質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體機(jī)構(gòu)不穩(wěn)定性由轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DNA的重排和丟失。第3頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性原因：DNA的丟失，插入和重排。人工構(gòu)建的多個(gè)串聯(lián)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體容易發(fā)生丟失作用。寄主染色體及質(zhì)粒載體的IS因子或轉(zhuǎn)位因子，同樣也會(huì)引起結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。共同特征：同向重復(fù)序列之間的同源重組（shortdirectrepeat).例如：用含有酪氨酸操縱子的多拷貝質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)換大腸桿菌tryR菌株時(shí)，由于IS1因子的插入效應(yīng)，結(jié)果產(chǎn)生出具有插入或者缺失的修飾型的質(zhì)粒載體。第4頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月分離的不穩(wěn)定性原因：細(xì)胞分裂過程中的質(zhì)粒的不平均分配。由于缺陷性分配（defectivepartitioning）所造成的質(zhì)粒的丟失現(xiàn)象叫做質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳的兩個(gè)必要條件：一、平均每個(gè)時(shí)代每個(gè)質(zhì)粒至少發(fā)生一次復(fù)制；二、細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制產(chǎn)生的質(zhì)粒拷貝必須分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去。第5頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)?？截惙峙涞阶蛹?xì)胞的途徑可分為主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種不同的方式。主動(dòng)分配的方式有兩種:平均分配--每個(gè)子細(xì)胞剛好獲得一半數(shù)目的質(zhì)?？截惻鋵?duì)位點(diǎn)分配—只有一對(duì)質(zhì)粒呈主動(dòng)分配，其他的隨機(jī)分配。由于主動(dòng)分配存在著有效的質(zhì)粒拷貝數(shù)控制系統(tǒng)，從而保證了質(zhì)粒的高度穩(wěn)定。第6頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月第7頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月隨機(jī)分配在細(xì)胞分裂過程中質(zhì)?？截悢?shù)在兩個(gè)子細(xì)胞中隨機(jī)分配。第8頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素新陳代謝符合對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)拷貝數(shù)差異對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)第9頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月新陳代謝符合對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)質(zhì)粒載體增加給宿主細(xì)胞DNA復(fù)制效應(yīng)曲線。即宿主細(xì)胞生長(zhǎng)速片度與質(zhì)粒載體的分子量的大小成正比，克隆的外源DNA段越大，寄主細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢的時(shí)間就越長(zhǎng)。第10頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月拷貝數(shù)差異對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響差異：同樣的大腸桿菌培養(yǎng)物中，每個(gè)細(xì)胞所擁有的質(zhì)粒載體拷貝數(shù)是不盡相同的，這種不同的細(xì)胞個(gè)體之間的質(zhì)粒載體拷貝數(shù)差異程度，簡(jiǎn)稱差度。無質(zhì)粒載體細(xì)胞的速度是由分裂細(xì)胞中的質(zhì)粒載體拷貝平均值數(shù)決定的。（實(shí)際質(zhì)粒載體拷貝數(shù)是實(shí)驗(yàn)測(cè)定大量細(xì)胞的）差度是影響質(zhì)粒載體丟失的速率，也是造成質(zhì)粒載體不穩(wěn)定的原因之一。第11頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月具低差度分布特性的質(zhì)粒載體相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定，具有高差度分布特性的質(zhì)粒載體穩(wěn)定性較差。位于后者的這種分布的低拷貝數(shù)的一段產(chǎn)生無質(zhì)粒載體細(xì)胞的頻率相當(dāng)高。第12頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)質(zhì)粒寡聚體同樣是造成質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重要原因之一。寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆載體。實(shí)驗(yàn)證明，pBR322派生載體中，寡聚化程度與插入片段大小存在相關(guān)性。決定大腸桿菌培養(yǎng)物中含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞的比例有兩種主要的因素：一、質(zhì)粒DNA分子間的重組頻率；二、含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞生長(zhǎng)速率。第13頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月影響質(zhì)粒重組的突變同樣也會(huì)影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)觀察表明，在重組缺陷(rec-)的大腸桿菌寄主細(xì)胞中，基因工程常用載體pBR322和pUC當(dāng)以單體形式存在時(shí)最穩(wěn)定。隨著質(zhì)粒寡聚體比例的逐漸上升，其穩(wěn)定性就相應(yīng)的下降。第14頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月一般情況下,質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性可以通過宿主菌株的謹(jǐn)慎和恰當(dāng)?shù)倪x用來消除。因此在質(zhì)粒不穩(wěn)定性的研究過程中,人們關(guān)注最多的,通常是質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性。第15頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)腈水合酶重組大腸桿菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性研究本文對(duì)成功構(gòu)建的腈水合酶(nitrilehydratase,NHase)高表達(dá)的重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr)的重組質(zhì)粒pETNHM在重組菌株中的質(zhì)粒穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。第16頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒pETNHM的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性質(zhì)粒pETNHM是將α亞基起始密碼子突變的諾卡氏菌腈水合酶基因插入商品化的pET28a(+)(Novagen公司)質(zhì)粒載體而得到的,插入位點(diǎn)為NcoI和BamHI第17頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月在LB培養(yǎng)基中對(duì)重組E.coliBL21(DE3)/pETNHM每隔6h進(jìn)行反復(fù)的傳代培養(yǎng),約60代后收獲細(xì)胞提取質(zhì)粒,并對(duì)初始構(gòu)建的質(zhì)粒和傳代培養(yǎng)后的質(zhì)粒分別以EcoT22I單酶切及NcoI和BamHI雙酶切，然后瓊脂糖凝膠電泳。第19頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月由圖可見,連續(xù)傳代60代后收獲的質(zhì)粒樣品采用EcoT22I單酶切及NcoI和BamHI雙酶切后,分別獲得了與初始質(zhì)粒完全相同的預(yù)期長(zhǎng)度基因片段(EcoT22I單酶切:4.1kb、2.2kb和0.3kb,其中0.3kb的片斷因?yàn)樘《诃傊悄z電泳中檢測(cè)不到;NcoI和BamHI雙酶切:5.3kb和1.3kb)。第21頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月進(jìn)一步將連續(xù)復(fù)制60代后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主E.coliBL21(DE3),并對(duì)重組菌進(jìn)行腈水合酶的誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果表明腈水合酶能夠正常表達(dá)。證明質(zhì)粒pETNHM確實(shí)具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,即使經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)復(fù)制,也沒有產(chǎn)生DNA序列的明顯自發(fā)突變。第22頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性是質(zhì)粒不穩(wěn)定性的主要因素,歷來受到學(xué)者們的高度重視。大量研究表明,宿主的新陳代謝負(fù)荷、質(zhì)粒的寡聚化效應(yīng)及在缺陷性分配過程中造成的拷貝數(shù)差度等,均是產(chǎn)生無質(zhì)粒細(xì)胞的重要因素,而不利的環(huán)境條件及無質(zhì)粒細(xì)胞的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)等則是進(jìn)一步擴(kuò)大質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性的重要原因。第23頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒pETNHM的分離不穩(wěn)定性及抗生素選擇壓力的影響抗生素的選擇壓力是保證質(zhì)粒分離穩(wěn)定性的重要因素。分別在LB和LBK培養(yǎng)基中對(duì)重組菌BL21(DE3)/pETNHM進(jìn)行反復(fù)的傳代培養(yǎng),以考察重組菌株的分離不穩(wěn)定性及宿主細(xì)胞連續(xù)分裂時(shí)Kan的添加對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響。為了保證所有的細(xì)胞均具有分裂能力,確定傳代時(shí)間為6h,即當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期時(shí)進(jìn)行傳代。第24頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月在沒有抗生素選擇壓力的LB培養(yǎng)基中,當(dāng)重組菌細(xì)胞連續(xù)分裂約48次左右時(shí),質(zhì)粒就開始丟失,含質(zhì)粒細(xì)胞(P+)的百分率逐漸下降;當(dāng)世代數(shù)增大到約66代時(shí),質(zhì)粒丟失率接近90%,說明質(zhì)粒pETNHM具有分離不穩(wěn)定性,宿主細(xì)胞的連續(xù)高速分裂將導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失。而在LBK培養(yǎng)基中,由于Kan選擇壓力的存在,P+菌的百分率在傳代過程中一直保持恒定。第26頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒特性對(duì)pETNHM分離不穩(wěn)定的影響在重組菌細(xì)胞中,質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)是影響質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性的重要因素。對(duì)于松弛型質(zhì)粒載體,一般情況下,伴隨著細(xì)胞的分裂,質(zhì)粒以隨機(jī)方式分配到子細(xì)胞中,質(zhì)?？截悢?shù)越高,出現(xiàn)無質(zhì)粒載體細(xì)胞的概率就越低,質(zhì)粒也就越穩(wěn)定。而質(zhì)粒載體的寡聚化效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)大大降低,從而通常會(huì)加重質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性。第27頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月分別收獲在LB培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)30代、60代及經(jīng)過誘導(dǎo)大量表達(dá)腈水合酶的BL21(DE3)/pETNHM細(xì)胞,利用試劑盒提取質(zhì)粒,進(jìn)行0.7%的瓊脂糖凝膠電泳,并以原質(zhì)粒為對(duì)照,電泳第28頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月第29頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月重組質(zhì)粒pETNHM除了在4.8kb處(理論長(zhǎng)度6.6kb,由于環(huán)狀質(zhì)粒形成超螺旋,所以出現(xiàn)在4.8kb位置)出現(xiàn)條帶以外,還在10kb左右出現(xiàn)了強(qiáng)條帶。回收純化10kb左右的質(zhì)粒DNA,分別采用NcoI和BamHI對(duì)其進(jìn)行單酶切,酶切后電泳第30頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月酶切后僅得到一條長(zhǎng)度均為6.6kb的線性質(zhì)粒條帶,是重組質(zhì)粒pETNHM長(zhǎng)度的理論值,說明酶切前的樣品為pETNHM的二聚體。就是說,重組質(zhì)粒pETNHM在宿主L21(DE3)中,主要以單體和二聚體2種形式同時(shí)存在,且由TotalLab軟件的定量分析可知,這2種形式的質(zhì)粒比為12。由于質(zhì)粒的寡聚化效應(yīng)會(huì)降低重組質(zhì)粒的拷貝數(shù),故而大量形成的重組質(zhì)粒pETNHM的二聚體不利于質(zhì)粒的分離穩(wěn)定性。第31頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月連續(xù)傳代及誘導(dǎo)產(chǎn)酶對(duì)質(zhì)粒pETNHM的拷貝數(shù)的影響第32頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒pETNHM屬于松弛型,應(yīng)該具有較高的拷貝數(shù)。分別取2.4ml在LB培養(yǎng)基中傳10代、30代以及經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)酶的BL21(DE3)/pETNHM菌液(細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分別為2.16×109個(gè)/ml、1.92×109個(gè)/ml及1.87×109個(gè)/ml),小心提取質(zhì)粒,分別獲得100μl質(zhì)粒樣品。各加樣3μl進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳,同時(shí)加入3μl(150ng)DNAMarker作參照。采用TotalLab軟件計(jì)算可知,3條泳道中質(zhì)粒的質(zhì)量分別為77.6,46.2和21.8ng。則3種菌液收獲的質(zhì)粒的理論產(chǎn)量分別為0.92μg/ml、0.55μg/ml和0.26μg/ml。第33頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月第34頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月因pETNHM單體的分子大小為6600bp,每單位堿基對(duì)的平均質(zhì)量為1.059×10-15μg,因此pETNHM單體的分子質(zhì)量為:6.989×10-12μg(即4.21×103kDa)。計(jì)算表明,3種菌液中重組質(zhì)粒pETNHM的拷貝數(shù)(以單體計(jì))分別為61、41和20。第35頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月該結(jié)果說明,在不同的傳代培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)條件下,重組質(zhì)粒pETNHM在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)差異很大。首先,長(zhǎng)時(shí)間的傳代培養(yǎng)會(huì)使質(zhì)粒的復(fù)制能力有所降低,從而使拷貝數(shù)減少。其次,菌體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)酶后,由于蛋白表達(dá)過程需要占用較多的能量、營(yíng)養(yǎng)和前體物質(zhì),所以也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒拷貝數(shù)的下降,從而影響質(zhì)粒的分離穩(wěn)定性。此外,由于以二聚體形式存在的重組質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中約占總量的2/3,而二聚體質(zhì)粒的拷貝數(shù)僅為單體質(zhì)粒拷貝數(shù)的1/2,因此,質(zhì)粒的二聚化現(xiàn)象也必然會(huì)影響到質(zhì)粒載體的分離穩(wěn)定性。第36頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒引入對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的影響理論上講,質(zhì)粒pETNHM在E.coliBL21(DE3)中的引入,將對(duì)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)造成一定的生理負(fù)擔(dān),從而影響質(zhì)粒的分離穩(wěn)定性。將重組菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM和宿主菌E.coliBL21(DE3)在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行平行培養(yǎng),測(cè)定OD600值隨時(shí)間的變化曲線,并計(jì)算其比生長(zhǎng)速率。第37頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月第38頁，課件共40頁，創(chuàng)作于2023年2月由圖可見,重組菌和宿主菌的最大比生長(zhǎng)速率分別為0.732h-1和0.689h-1,重組菌略高于宿主菌。也就是說,重組菌BL21(DE3)/pETNHM并沒有由于攜帶質(zhì)粒而表現(xiàn)出嚴(yán)重的生理負(fù)擔(dān)。重組菌和宿主菌的這一生長(zhǎng)特性將有利于避免質(zhì)粒丟失后