免疫學(xué)應(yīng)用-分子生物學(xué)與臨床-課件

PCR技術(shù)及其應(yīng)用分子生物學(xué)與臨床1ppt課件目錄PCR的概念

PCR技術(shù)的創(chuàng)建PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法PCR的類型和應(yīng)用2ppt課件

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:

DNA聚合酶

3ppt課件基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴(kuò)增4ppt課件PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。5ppt課件KaryB.Mullis（1944－）6ppt課件三篇重要論文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91

)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)

7ppt課件生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類學(xué)研究……PCR技術(shù)誕生所依賴的社會需求和研究需要8ppt課件基因組DNA獲取特定DNA片段擴(kuò)增特定DNA片段9ppt課件限制性內(nèi)切酶裂解基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝基因組DNA文庫DNA文庫20kBfragments插入噬菌體載體細(xì)菌擴(kuò)增10ppt課件裂解變性顯影從基因組文庫中篩選目的基因probe放射性核素標(biāo)記轉(zhuǎn)印11ppt課件DNA克隆目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子12ppt課件DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物DNA聚合酶1977年13ppt課件引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年14ppt課件94℃變性50-65℃退火XX℃延伸15ppt課件94℃55℃37℃16ppt課件Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)17ppt課件72℃94℃55℃PCR循環(huán)18ppt課件PCR技術(shù)的原理1PCR技術(shù)的基本原理

無細(xì)胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNA帶。

19ppt課件

體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶

dNTP解旋酶類引物復(fù)習(xí)5’

3’20ppt課件加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

21ppt課件PCR擴(kuò)增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火22ppt課件2PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍23ppt課件2）特異性引物引物

引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴(kuò)增。24ppt課件引物設(shè)計：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。25ppt課件3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標(biāo)記26ppt課件3）操作簡便易行PCR擴(kuò)增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。通常的DNA擴(kuò)增法是分子克隆法,首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體,然后將它導(dǎo)入細(xì)胞后進(jìn)行擴(kuò)增,還要用同位索探針進(jìn)行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復(fù)雜,一般需要數(shù)周時間。27ppt課件目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子28ppt課件4）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)29ppt課件PCR的反應(yīng)體系和方法PCR管加熱使模板變性,退火使引物與模板DNA互補,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點,合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的DNA帶。

30ppt課件

總體積50-100lBuffer

緩沖液

dNTP

原料

Primer引物

DNA分子模板

Taq酶DNA聚合酶

1反應(yīng)體系31ppt課件PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP

引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP

引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本過程32ppt課件PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP

引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP

引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次33ppt課件瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)34ppt課件1）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3PCR反應(yīng)條件35ppt課件（2）引物濃度

0.1-0.5mol/L

濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。36ppt課件（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量

dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。37ppt課件（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。38ppt課件2）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94oC20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。39ppt課件（3）延伸

70-75℃,一般為72℃

延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯誤摻入率增加40ppt課件經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever41ppt課件1）不對稱PCR

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針

基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究PCR的類型42ppt課件

高濃度引物低濃度引物43ppt課件2)反向PCR(reversePCR)

是用反向的互補引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增?？蓪ξ粗蛄袛U(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列44ppt課件已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶45ppt課件3）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。46ppt課件電泳引物1234123447ppt課件DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對應(yīng)條帶,說明病人外顯子8～19缺失B：病人A中未擴(kuò)增外顯子帶的強度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴(kuò)增形式多重PCR檢測DMD基因缺失48ppt課件49ppt課件4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記,用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時檢測多種基因成分病毒1病毒2病毒3病毒450ppt課件標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物51ppt課件5）錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段兩測的序列

對于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？（固定化PCR）52ppt課件VHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCL53ppt課件cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點polydC)一起作PCR擴(kuò)增54ppt課件6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號可用于基因芯片的制作55ppt課件7）原位ＰＣＲ

原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列56ppt課件

原位PCR的作用

既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH）,但在每個細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下,該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列,敏感度很高,但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。

ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來,成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。57ppt課件操作步驟1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進(jìn)入2.PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達(dá)58ppt課件8）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增59ppt課件基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈60ppt課件9)熒光定量PCR（real-timePCR)

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析,計算待測樣品的初始模板量。熒光定量PCR儀光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。61ppt課件熒光標(biāo)記62ppt課件熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針

Taqman

MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)63ppt課件5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

64ppt課件5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

65ppt課件Taqman探針3′端Q熒光分子能夠吸收5′端R熒光分子發(fā)出的熒光,因此,正常情況下該探針檢測不到5′端熒光分子發(fā)出的熒光,只能檢測到3′端熒光分子的熒光信號,但當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物(模板)時,探針與模板退火,即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物,從而激活Taq

酶的5′外切酶活性,將探針5′端連接的R熒光分子從探針上切割下來,破壞了兩個熒光分子間的FRET,從而發(fā)出熒光,切割的R熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量熒光能量傳遞技術(shù)(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)66ppt課件Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRETProbe）67ppt課件RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）68ppt課件RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)（MolecularBeaconProbe）69ppt課件引物特異性探針（AmplisenorProbe）70ppt課件5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQR引物特異性探針（AmplifluorProbe）71ppt課件熒光定量實時PCR與普通PCR的比較實時在線監(jiān)控對樣品擴(kuò)增的整個過程進(jìn)行實時監(jiān)控,能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加,直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期降低反應(yīng)的非特異性使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合,提高了PCR反應(yīng)的特異性增加定量的精確性全程監(jiān)控,準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量結(jié)果分析更加快捷方便,無需跑膠

72ppt課件全新4通道實時熒光定量PCR儀

普通梯度PCR儀73ppt課件PCR技術(shù)的應(yīng)用1)基因克隆重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段74ppt課件大腸桿菌胰島素重組體+胰島素基因基因工程產(chǎn)品75ppt課件5’5’BamHIBamHIBamHIBamHI76ppt課件GTCCGGACCCTGCAGGGTCCGGACCCTGCAGGCCTGGGACGTCCCAGG質(zhì)粒DNA目的基因限制性核酸內(nèi)切酶77ppt課件2)基因檢