第六章檸檬酸發(fā)酵過程無菌空氣制備及染菌分析和防治培訓課件

第六章檸檬酸發(fā)酵過程無菌空氣制備及染菌分析和防治優(yōu)選第六章檸檬酸發(fā)酵過程無菌空氣制備及染菌分析和防治（一）滅菌與消毒

滅菌是指采用強烈的理化因素使被處理的物體內(nèi)、外部的一切微生物永遠喪失其生長、繁殖能力的措施。

消毒是指用理化方法消滅致病菌，即采用一定措施殺死被處理物體表面或內(nèi)部存在的對人體有害的病原菌，而并不一定是殺死一切微生物，它允許對人體無害的微生物存在。（二）滅菌方法1、火焰灼燒滅菌

接種針、鑷子等金屬小工具和玻璃棒、試管口、三角瓶口等可直接用火焰灼燒而殺死其中各種微生物。此法簡單有效，但局限性大。2、干熱滅菌

培養(yǎng)皿、吸管等玻璃器皿，可用烘箱進行干熱滅菌。100℃，1h可殺死營養(yǎng)體細胞，而殺死芽孢則需要160℃，2h。3、濕熱滅菌常壓間歇蒸汽滅菌產(chǎn)壓下蒸汽溫度只能達到100℃，1次滅菌難以殺死各種芽孢，故可采用間歇多次滅菌法。

具體操作用蒸汽蒸煮培養(yǎng)基3060min，殺死微生物的營養(yǎng)體細胞，冷卻后置37℃烘箱培養(yǎng)，使未被殺死的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體。次日再蒸煮一次，37℃培養(yǎng)24h，如此反復處理3次，即可完全殺死培養(yǎng)基中的各種雜菌。加壓蒸汽滅菌

斜面、麩曲、搖瓶培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基等都采用加壓蒸汽滅菌。

小件物品的滅菌是在加壓鍋內(nèi)進行，鍋內(nèi)蒸汽壓力為0.1MPa，溫度120℃，以溫度為準維持15~30min,能殺死各種微生物及其芽孢。

4、輻射滅菌紫外輻射滅菌

此法常用于無菌室的滅菌。波長265~266nm的紫外光對細胞有極強的殺傷作用。照射15~30min，可殺死大部分細菌，但紫外線穿透力極差，一層紙就能完全阻擋其輻射作用。電離輻射滅菌

60Co、X射線等電離輻射有較強的殺菌能力，且穿透力強，能殺死包裝內(nèi)各種微生物。（三）常用消毒劑

除了巴斯德或蒸汽消毒等方法外，更多的是使用化學消毒劑，在廠區(qū)周圍環(huán)境、車間地面、接種室以及皮膚表面進行消毒。幾種常用的表面消毒劑類型名稱常用濃度/%應用范圍作用機理醇類乙醇70~75皮膚，器皿蛋白質(zhì)變性，損傷細胞膜，脫水，溶解脂類醛類甲醛戊二醛0.5~1.02接種箱、物品、曲房接種室、精密儀器破壞蛋白質(zhì)氫鍵或氨基同上氧化劑高錳酸鉀過氧乙酸0.10.2~0.5皮膚、水果、蔬菜皮膚、器皿、玻璃電極氧化蛋白質(zhì)活性基團同上鹵素類漂白粉碘酒10~202.5廠房、廁所、飲水、空氣、皮膚皮膚酶失活、破壞蛋白質(zhì)或細胞膜同上表面活性劑新潔爾滅杜滅酚0.05~0.10.05~0.1皮膚、器皿、桌面皮膚、金屬蛋白質(zhì)變性，損傷細胞膜同上酚類石碳酸來蘇兒3~52地面、桌面、器皿皮膚、器皿蛋白質(zhì)變性，損傷細胞膜同上酸類醋酸5~10ml/m3房間消毒（防呼吸道傳染）破壞蛋白質(zhì)與細胞膜重金屬類升汞紅汞0.05~0.12器皿皮膚作用蛋白質(zhì)巰基同上二、檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基滅菌可分為實消和連消兩種。分批滅菌（實消）將培養(yǎng)基置于反應器中用蒸汽加熱，達到預定滅菌溫度后維持一定時間，再冷卻到發(fā)酵溫度的過程稱為分批滅菌。特點無需專一滅菌設備，操作簡單，大容量發(fā)酵罐升降溫時間長，營養(yǎng)成分易遭到破壞，高峰蒸汽負荷大，發(fā)酵罐利用率低，耗熱量大。適用于固體培養(yǎng)基、小型發(fā)酵罐的液體培養(yǎng)基、容易產(chǎn)生泡沫的培養(yǎng)基的消毒滅菌。四、介質(zhì)過濾空氣除塵原理空氣凈化處理的目的是除菌，然而目前使用的過濾介質(zhì)必須在干燥條件下工作才能保證除菌效率，因此空氣需要預處理以除去油污、水和較大的顆粒。目前檸檬酸發(fā)酵采用介質(zhì)過濾制備無菌空氣。接種箱、物品、曲房接種室、精密儀器酵母、曲霉、青霉污染，可用米曲汁或麥芽汁瓊脂平板劃線檢出。超細玻璃纖維紙過濾器，多作為分過濾器使用?！盁o菌空氣”是指通過凈化處理使空氣中含菌量降低到一定極限，因而能控制發(fā)酵污染至極小機率的空氣。1、高空采風；因為一般細菌繁殖一代只需20～30min，若有一個細菌進入發(fā)酵罐，15h后可繁殖109個/ml,這足以使發(fā)酵受到嚴重影響。此法原理是利用微粒對光線的散射作用來測量空氣中粒子大小和數(shù)量。根據(jù)氣候情況有一次冷卻一次析水流程（圖二）和二次冷卻二次析水流程（圖三）。培養(yǎng)基滅菌可分為實消和連消兩種。連續(xù)滅菌（連消）：將培養(yǎng)基在罐外連續(xù)進行加熱、維持和冷卻，最后進入到反應器的滅菌方法稱為連續(xù)滅菌。特點：

需要專門的滅菌設備，高溫瞬間滅菌，能使培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的破壞減小到最低程度，高峰蒸汽負荷低且均衡，發(fā)酵罐利用率高，耗熱量小、滅菌質(zhì)量好。

適用于大容量發(fā)酵罐和連續(xù)自控操作。具體操作可參考噴射液化工藝，連消之前要進行空罐滅菌。

連續(xù)滅菌工藝流程第二節(jié)無菌空氣的制備

檸檬酸深層發(fā)酵時利用溶解于溶液中的氧，其來源則是通過壓縮機提供的壓縮空氣。

自然界的空氣是帶塵和細菌的空氣，且通過壓縮機壓縮和管道疏通，增加了水、油污、金屬屑等雜物，因此進入發(fā)酵罐的空氣，必須是通過適當方法處理后的干凈、無菌空氣。目前檸檬酸發(fā)酵采用介質(zhì)過濾制備無菌空氣。3、利用壓縮后的熱空氣與冷卻后的冷空氣進行熱交換，使冷卻空氣溫度升高，降低相對濕度（圖四）。存在于空氣中的微生物主要有細菌、細菌芽孢、霉菌孢子、霉菌、酵母和病毒粒子。5、貯氣罐；1、嚴格無菌操作制度所有從事發(fā)酵工作者，必須經(jīng)過嚴格的無菌操作培訓和始終貫徹無菌操作制度；因為一般細菌繁殖一代只需20～30min，若有一個細菌進入發(fā)酵罐，15h后可繁殖109個/ml,這足以使發(fā)酵受到嚴重影響。照射15~30min，可殺死大部分細菌，但紫外線穿透力極差，一層紙就能完全阻擋其輻射作用。各種纖維介質(zhì)過濾器和金屬、塑料、石墨、陶瓷等粉末燒結而成的微孔過濾器?？諝鈨艋幚淼哪康氖浅欢壳笆褂玫倪^濾介質(zhì)必須在干燥條件下工作才能保證除菌效率，因此空氣需要預處理以除去油污、水和較大的顆粒。60Co、X射線等電離輻射有較強的殺菌能力，且穿透力強，能殺死包裝內(nèi)各種微生物。這兩種流程適用于空氣中濕含量較大的南方沿海地區(qū)。一、空氣中微生物的分布情況

存在于空氣中的微生物主要有細菌、細菌芽孢、霉菌孢子、霉菌、酵母和病毒粒子。微生物一般是附著在空氣中的塵粒上。因此除去空氣中的塵埃和水、汽等，也即除去空氣中存在的各種微生物。

空氣中微生物的數(shù)量隨環(huán)境、氣候諸因子而變化。一般認為空氣中微生物含量約在103~104個/m3。

二、檸檬酸發(fā)酵對無菌空氣的質(zhì)量要求“無菌空氣”是指通過凈化處理使空氣中含菌量降低到一定極限，因而能控制發(fā)酵污染至極小機率的空氣。

發(fā)酵的生產(chǎn)菌種和產(chǎn)品不同，對無菌空氣的質(zhì)量要求也稍有差異。檸檬酸發(fā)酵可以不考慮噬菌體的危害問題。深層發(fā)酵對培養(yǎng)基滅菌和無菌空氣的除菌要求，都是按照染菌機率為103的依據(jù)來設計。因為一般細菌繁殖一代只需20～30min，若有一個細菌進入發(fā)酵罐，15h后可繁殖109個/ml,這足以使發(fā)酵受到嚴重影響。黑曲霉生長迅速，正常條件下很快進入產(chǎn)酸期，使培養(yǎng)基pH下降，增強了抗污染能力，按上述常規(guī)要求設計所得到的無菌空氣，可以滿足檸檬酸發(fā)酵要求。三、空氣預處理流程

空氣凈化處理的目的是除菌，然而目前使用的過濾介質(zhì)必須在干燥條件下工作才能保證除菌效率，因此空氣需要預處理以除去油污、水和較大的顆粒。空氣凈化流程的選擇應環(huán)繞著提高除菌效率進行。提高除菌效率的主要措施減少進口空氣的含菌數(shù)，其方法為加強衛(wèi)生場地的衛(wèi)生管理，減少生產(chǎn)環(huán)境中含菌數(shù)；正確選擇進風口，一般空壓站應在生產(chǎn)車間的上風向；提高進口空氣位置；加強壓縮前預處理。設計和安裝合理的空氣過濾器，選用除菌效率高的過濾介質(zhì)。設計合理的空氣與處理設備。降低進入空氣過濾器的空氣的相對濕度，保證過濾介質(zhì)在干燥狀態(tài)下工作，其方法是采用無油空壓機；加強空氣冷卻和去油、水；提高進入過濾器的空氣溫度，降低相對濕度。以上措施的具體做法應根據(jù)具體情況而定1、將壓縮空氣冷卻至露點以上，使其相對濕度為60~70%以下，然后進入過濾器（圖一）。這種流程適用于北方和內(nèi)陸氣候干燥地區(qū)。此流程簡單，但要求進口空氣的絕對濕含量不能太高，否則冷卻后的壓縮空氣相對濕度為60%時的溫度就會很高。（圖一）將空氣冷卻至露點以上的流程1、高空采風；2、粗過濾器；3、空壓機；4、冷卻器；5、貯氣罐；6、空氣總過濾器；7、空氣分過濾器2、將壓縮空氣冷卻至露點以下，析出部分水分，然后升溫使相對濕度下降至60%左右，再進入空氣過濾器。

根據(jù)氣候情況有一次冷卻一次析水流程（圖二）和二次冷卻二次析水流程（圖三）。這兩種流程適用于空氣中濕含量較大的南方沿海地區(qū)。(圖二)一次冷卻一次析水的的空氣凈化流程1、高空采風；2、粗過濾器；3、空壓機；4、冷卻器；5.6、析水器7、貯氣罐；8、加熱器；9、總過濾器；10、分過濾器

（圖三）二次冷卻二次析水的空氣預處理流程1、高空采風；2、粗過濾器；3、空壓機；4.6、冷卻器；5.7、析水器8、貯氣罐；9、加熱器；10、空氣總過濾器；11、空氣分過濾器3、利用壓縮后的熱空氣與冷卻后的冷空氣進行熱交換，使冷卻空氣溫度升高，降低相對濕度（圖四）。此流程對熱能利用較合理，熱交換器還兼做貯氣罐，但由于氣氣換熱的傳熱系數(shù)很小，加熱面積要足夠大。

（圖四）利用熱空氣加熱冷空氣的流程1、高空采風；2、粗過濾器；3、空壓機；4、熱交換器；5、冷卻器；6.7、析水器；8、總過濾器；9、分過濾器4、將壓縮后的空氣部分冷卻析水，另一部分的熱空氣直接與冷卻析水后的空氣混合，然后進入空氣過濾器（圖五）。

此流程適用于空氣的濕含量中等的地區(qū)。其對熱能的利用合理，但操作要求高，要根據(jù)不同氣候調(diào)節(jié)兩部分空氣的混合比。

（圖五）冷熱空氣直接混合的空氣凈化流程1、高空采風；2、粗過濾器；3、空壓機；4、冷卻器；5.6、析水器；7、貯氣罐；8、總過濾器；9、分過濾器四、介質(zhì)過濾空氣除塵原理

用介質(zhì)從空氣中除菌的方法可分為兩大類同從液相中除去固相顆粒一樣，所用過濾介質(zhì)的孔徑小于微粒的直徑，此法過濾效果可達100%的完全除菌程度，但很不經(jīng)濟，不適用于處理發(fā)酵工業(yè)用的大量無菌空氣。各種纖維介質(zhì)過濾器和金屬、塑料、石墨、陶瓷等粉末燒結而成的微孔過濾器。理論上纖維介質(zhì)過濾不能達到絕對除菌效果，因為纖維形成的網(wǎng)格空隙遠大于空氣中塵埃的粒徑。但是纖維介質(zhì)是由許許多多的纖維充填在一起，組成了一個有一定厚度而又孔道曲折的多層截留結構。因此，當塵粒穿過介質(zhì)層時經(jīng)多次阻擋而被截留，從而達到發(fā)酵工業(yè)所需無菌空氣的質(zhì)量標準。優(yōu)點結構簡單、體積小、壓力降小和運轉費用低等。五、檸檬酸發(fā)酵常用空氣過濾器發(fā)酵工業(yè)用的空氣過濾器有兩種組合一種是由一臺總過濾器與多臺發(fā)酵罐的分過濾器組合；另一種是各發(fā)酵罐單獨設置預過濾器和精過濾器的組合。顯然后者優(yōu)于前者，特別在空氣系統(tǒng)發(fā)生污染事故時，可分別處理而不影響生產(chǎn)。

棉花過濾器常稱為總過濾器。過濾介質(zhì)通常采用未脫脂的棉花和棒狀活性炭。超細玻璃纖維紙過濾器，多作為分過濾器使用。一般采用質(zhì)量較好的無堿玻璃纖維制成的紙。維尼綸纖維過濾器結構簡單，過濾效果好，機械強度高，壓力降小，使用壽命長，操作方便。但不耐熱，故不能滅菌。使用前先用40℃的熱空氣對濾層吹10h以上。六、無菌空氣制備系統(tǒng)流程和要求空氣凈化系統(tǒng)的設備功能，在過濾器之前是脫油、除濕，保證潔凈干燥的空氣進入過濾器濾層之后除去了空氣的雜菌。只有保持濾層的干燥和完好，才能達到除菌的目的，因此除濕、脫油設備是不可缺少的。兩級冷卻、加熱除菌流程示意圖1.粗過濾器2.壓縮機3.貯罐4、6.冷卻罐

5.旋風分離器7.絲網(wǎng)分離器8.加熱器9.過濾器七、無菌空氣的檢查肉湯培養(yǎng)基檢查法在分過濾器空氣出口端的管道支管的小考克上用橡皮管與一只裝有250ml肉湯培養(yǎng)基的三角瓶連接，少許打開小考克使空氣進入肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，連續(xù)數(shù)小時或十幾小時，小心卸下橡皮管，用無菌紙包扎好管的末端，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，若出現(xiàn)渾濁，表明空氣中有雜菌。此法所測定的空氣體積與進入發(fā)酵罐空氣體積之比懸殊太大，兼之生物測定操作繁瑣，測定結果較難反映出真實情況。檢查無菌空氣裝置示意圖光學檢查法此法原理是利用微粒對光線的散射作用來測量空氣中粒子大小和數(shù)量。常用的檢測儀器為Y091型粒子計數(shù)器。測量時以一定速度將試樣空氣通過檢測區(qū)，同時用聚光透鏡將光源來的光線聚成強烈光束射入檢測區(qū)，由于空氣受到光線強烈照射，空氣中的微粒把光線散射出去，由聚光透鏡將散射光聚集投入光電倍增管，將光轉換成電訊號，經(jīng)自動計數(shù)器計算出粒子的大小與數(shù)量。第三節(jié)、檸檬酸深層發(fā)酵染菌分析及防治（一）檸檬酸發(fā)酵常見的污染菌

檸檬酸發(fā)酵初期，即發(fā)酵液pH>3.0時，常見的污染菌有細菌、酵母、曲霉及青霉菌等，隨著發(fā)酵液pH的下降，大多數(shù)細菌和曲霉菌被抑制或自溶，而耐酸性的酵母和青霉菌等則繼續(xù)繁殖，重者導致發(fā)酵倒罐，輕者產(chǎn)酸很低且粘度增加，提取困難。常見的污染菌有以下幾種A、細菌產(chǎn)氣桿菌、琥珀酸菌、熒光桿菌等；B、酵母釀酒醭酵母、葡萄酒醭酵母、清酒酵母等；C、霉菌米曲霉、泡盛酒曲霉、皺褐青霉等。（二）污染菌的檢查1、感官檢查大部分被污染的發(fā)酵液可以從發(fā)酵液的異常情況來檢查，如色度、異味、變稠或稀、生產(chǎn)菌球體散開。菌絲變形、產(chǎn)酸不正常、而糖卻大量消耗等。

借助顯微鏡可以檢出細菌、酵母菌、曲霉、青霉的菌體形態(tài)。2、平板劃線檢查凡是認為染菌罐，或發(fā)酵不正常而未確準的染菌罐，都必須做平板劃線檢查，以便最終確認是否染菌，染什么菌，作為生產(chǎn)者采取搶救、補救以及消除隱患等措施的依據(jù)。如細菌污染可用肉汁瓊脂平板或肉湯培養(yǎng)檢出。酵母、曲霉、青霉污染，可用米曲汁或麥芽汁瓊脂平板劃線檢出。