多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增第1頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月★分子生物學(xué)研究中最強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一★其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過程美國(guó)科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎(jiǎng)第2頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月一.基礎(chǔ)知識(shí):溫故知新:DNA是如何復(fù)制?復(fù)制:模板DNA----解旋酶解旋----DNA聚合酶(堿基互補(bǔ)配對(duì)原則)----合成子鏈條件:模板、4種脫氧核糖核苷酸、酶、ATP第3頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月復(fù)習(xí)填空:DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)⑴.DNA分子是由

的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的規(guī)則

結(jié)構(gòu)。⑵.

與

交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在鏈的內(nèi)側(cè)。⑶.兩條鏈上的堿基通過

連結(jié)起來，形成堿基對(duì)。堿基對(duì)的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與

配對(duì)，

一定同胞嘧啶配對(duì)。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤第4頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月12345－脫氧核苷酸第5頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月3.多脫氧核苷酸鏈的形成第6頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA分子的平面結(jié)構(gòu)ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端3'端

識(shí)別：

DNA分子的3′

端與5′

端-OH端為3′;磷酸基團(tuán)的末端為5′。第7頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月閱讀P58-59PCR原理并討論？1、體內(nèi)DNA復(fù)制為何需要引物？2、體內(nèi)DNA復(fù)制的方向有何特點(diǎn)？3、PCR原理的本質(zhì)是什么？第8頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈提供DNA復(fù)制的________4種脫氧核苷酸合成子鏈的________DNA聚合酶

引物使DNA聚合酶能夠從______________開始連接_________**二.PCR原理?___________________________DNA酶特異性決定：不能從子鏈的5`端合成DNA，只能從引物的3`端延伸DNA1、細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制條件：打開DNA雙鏈模板原料催化合成DNA子鏈3′

端脫氧核苷酸引物的DNA的復(fù)制、DNA熱變性原理第9頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月3`端5`端3`端5`端1、DNA的方向：羥基末端----3`端磷酸基團(tuán)末端----5`端2、合成方向：從引物的3`端延伸DNA

子鏈的

_________________2、DNA的復(fù)制方向5`----3`延伸)第10頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月80—100度55度3.DNA體外的復(fù)制過程DNA模板4種脫氧核糖核苷酸耐熱的DNA聚合酶？引物？放于緩沖液中4.體外復(fù)制的條件?第11頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月判斷正確的是:A.向右為加熱(80—100度)變性過程B.向左是DNA雙鏈迅速致冷復(fù)性的過程C.變性與在生物體內(nèi)解旋過程的條件、實(shí)質(zhì)都相同D.圖中DNA片段具有4個(gè)游離的磷酸基、4個(gè)3`端體內(nèi)復(fù)制DNA與PCR有何異同?第12頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋引物DNA聚合酶復(fù)制特點(diǎn)復(fù)制的方向解旋酶、ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶一小段RNA一般用DNA片段細(xì)胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）耐熱的DNA聚合酶半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，子鏈的5’端向3’端延伸子鏈的5’端向3’端延伸第13頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月三、PCR的反應(yīng)過程讀圖P60，合作探究？1、討論:PCR過程經(jīng)歷幾個(gè)步驟？每輪PCR過程的聯(lián)系？2、循環(huán)若干次后，如果以引物為標(biāo)記，你能寫出幾種

DNA？第14頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月小結(jié)：二、PCR的反應(yīng)過程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/第15頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月5引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制555555模板DNA5555555525～30次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬（220）倍以上。復(fù)制若干代后，以引物為標(biāo)記---共有3種DNA第16頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月鞏固練習(xí):請(qǐng)寫出下列DNA分子的引物？將引物放于正確位置?寫出一次循環(huán)后生成的DNA?5`-G-G…….T-C-3`3`-C-C……..A-G-5`95度5`-G-G……T-C-3`3`-C-C……A-G-5`55度

5`-G-G-OH5`-G-G……T-C-3`3`-C-C……..A-G-5`72度___________________;____________________5`-G-G-OH:引物15`-G-A-OH:引物2HO-A-G-5`3`-C-C……A-G-5`5`-G-G……T-C-3`5`-G-G……..T-C-3`3`-C-C……...A-G-5`第17頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)藥品和儀器第18頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR儀第19頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月微量離心管第21頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月四、實(shí)驗(yàn)步驟見書p62了解內(nèi)容：準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方用微量移液器按配方在往微量離心管中加入各組分蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合反應(yīng)液離心10S將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序進(jìn)行反應(yīng)第22頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月操作提示：

操作提示

1．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。

2．PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊？上緩慢融化。

3．在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。目的：避免外源性DNA大量擴(kuò)增造成假陽性反應(yīng)。第23頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月五、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（1）、原理：DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰(圖5-11)?？梢岳肈NA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)定。第24頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA含量測(cè)定:紫外線分光光度計(jì)第25頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月⑵.對(duì)照調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值⑶.測(cè)定⑷.計(jì)算DNA含量(g)＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)第26頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA)**原理?1.方向:從引物的3`端延伸2.原理:DNA復(fù)制和DNA熱變性原理雙鏈DNA

DNA的單鏈實(shí)驗(yàn)操作DNA含量的測(cè)定**反應(yīng)過程知識(shí)網(wǎng)絡(luò):>80度變性

緩慢降低復(fù)性條件:緩沖液\模板\引物\原料\耐熱DNA聚合酶過程:變性---氫鍵斷裂復(fù)性:引物與單鏈DNA結(jié)合延伸:引物3`端延伸

(DNA從子鏈5`---3`延伸)1.紫外線吸收光譜2.電泳法PCR反應(yīng)體系---移入離心管---PCR儀---設(shè)置反應(yīng)參數(shù)----DNA擴(kuò)增第27頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月練習(xí)(課堂檢測(cè))1、DNA單鏈的______末端為3′端,________末端為5′端,在DNA復(fù)制時(shí),引物從模板鏈的______端配對(duì)結(jié)合.在______________酶的作用下,從引物的____端,使子鏈向下延伸.2每次循環(huán)可以分為______________________這三個(gè)過程,對(duì)應(yīng)溫度分別為__________________.磷酸基團(tuán)羥基羥基耐熱的DNA聚合3/變性、復(fù)性、延伸95℃、55℃、72℃90℃以上、50℃左右、72℃左右第28頁，課件共30頁，創(chuàng)作于2023年2月練習(xí)(教材P63)1、一個(gè)DNA片段經(jīng)過30次循環(huán)后能形成________個(gè)這樣的片段.2、依據(jù)DNA吸收紫外光的情況