第十二章 高效液相色譜

第十二章

高效液相色譜

(HPLC)概述

高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。 它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相柱色譜裝置高效液相色譜儀例：分離20種氨基酸柱長(zhǎng)：170cm柱徑：0.9cmF：30mL/ht分離:>20h經(jīng)典柱色譜HPLCt分離：1h經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜法（分析型）固定相一般規(guī)格特殊規(guī)格固定相粒度（μm）75~5003~20固定相粒度分布(RSD)20~30%<5%柱長(zhǎng)（cm）10~10010~30柱內(nèi)徑（cm）2~50.1~0.5柱入口壓強(qiáng)（kg/cm2）0.01~120~300柱效(每米理論塔片數(shù))10~100104~105樣品用量（g）1~1010-7~10-2分析所需時(shí)間（h）1~200.05~0.5裝置非儀器化儀器化高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法氣相色譜（GC）

高效液相色譜（HPLC）

應(yīng)用范圍

占有機(jī)物的20%占有機(jī)物的80%分離效果

高

更高

選

擇

性流動(dòng)相是氣體，只能選擇固定相

流動(dòng)相是液體，流動(dòng)相、固定相都可選擇。選擇性廣。

溫

度

高溫

常溫（分離效果好）

靈敏度(g/ml)10-12

10-9

液相色譜與氣相色譜的比較液相色譜與氣相色譜的比較

（l）氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。

液相色譜能完成難度較高的分離工作，因?yàn)椋孩贇庀嗌V的流動(dòng)相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過(guò)程，與樣品分子無(wú)親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中，流動(dòng)相液體也與固定相爭(zhēng)奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個(gè)因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動(dòng)相，增大分離的選擇性。②液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色譜。等，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜可選擇余地小的。③液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。（4）液相色譜中制備樣品簡(jiǎn)單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。 但液相色譜尚缺乏通用的檢測(cè)器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)充的。目前掌高效燒液相趨色譜鈴法已應(yīng)被廣輔泛應(yīng)凈用于太分析郊對(duì)生漠物學(xué)經(jīng)和醫(yī)陡藥上牛有重送大意刑義的乞大分鹿子物言質(zhì)，復(fù)例如尊蛋白身質(zhì)、煩核酸胳、氨拔基酸里、多鴿糖類脊、植碎物色爬素、殿高聚主物、煮染料爹及藥托物等泛物質(zhì)傭的分刑離和述分析協(xié)。高效白液相次色譜圈法特?zé)酎c(diǎn)①適醫(yī)用范腰圍廣夫；②分制離性問(wèn)能好昨；③分蔥析速淡度快吉；④流回動(dòng)相籌可選多擇性遮范圍跡寬；⑤靈拾敏度理較高帶；⑥色稈譜柱巷可反脹復(fù)使頌用；⑦流足出組拒分容正易收裹集；⑧安絹全。高速高效高靈蝕敏度類型主要分離機(jī)理主要分析對(duì)象或應(yīng)用領(lǐng)域吸附色譜吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜疏水分配作用各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備凝膠色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測(cè)定離子交換色譜庫(kù)侖力無(wú)機(jī)離子、有機(jī)離子分析離子排斥色譜Donnan膜平衡有機(jī)酸、氨基酸、醇、醛分析離子對(duì)色譜疏水分配作用離子性物質(zhì)分析疏水作用色譜疏水分配作用蛋白質(zhì)分離與純化手性色譜立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析液相臂色譜盜的分詞類應(yīng)用由于HP它LC分離版分析熄的高旨靈敏夠度、腥定量這的準(zhǔn)捏確性采、適磨于非賠揮發(fā)告性和歷熱不射穩(wěn)定友組分不的分均析，初因此彈，在崖工業(yè)抽、科障學(xué)研沿究，磚尤其既是在伙生物共學(xué)和渾醫(yī)學(xué)欲等方革面應(yīng)閘用極射為廣凱泛。珍如氨率基酸座、蛋世白質(zhì)進(jìn)、核愉酸、倆烴、脫碳水立化合揮物、碧藥品打、多擊糖、安高聚平物、唐農(nóng)藥目、抗坦生素割、膽最固醇滋、金光屬有時(shí)機(jī)物僻等分貴析，躬大多盞是通搭過(guò)HP姓LC來(lái)完將成的紋。右圖饒是各拼種HP智LC方法土的應(yīng)塘用范黎圍及港對(duì)象極性餃增加不溶舊于水溶于聰水非極軌性離子非離音子極植性吸附反向懷分配分配正向潔分配離子熟交換尺寸銹排阻凝膠盜滲透凝膠贈(zèng)過(guò)濾分子量第一睜節(jié)液相松色譜蔽柱效一煎液相關(guān)色譜潑速率加理論可忽略Ⅰ渦流擴(kuò)散項(xiàng)Ⅱ流動(dòng)相傳質(zhì)阻力Ⅲ分子擴(kuò)散項(xiàng)Ⅳ固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)Ⅵ流動(dòng)相傳質(zhì)阻力流動(dòng)舟相流炮速對(duì)頂板高斃的影阿響小顆逮粒填蹦料，康填充譽(yù)均勻捎；選擇較較低拔的流險(xiǎn)動(dòng)相趙流速菌；選擇慚粘度擺小的攪溶劑隊(duì)作流抓動(dòng)相糟，改愈善傳保質(zhì)。修正跟的速儲(chǔ)率方叛程：提高蜓柱效石途徑二朋液相憂色譜羞中的方柱外碰譜帶稈展寬柱外伴譜帶勁展寬司又稱洪“柱是外效介應(yīng)”即，系爛指從香進(jìn)樣隆點(diǎn)到寬檢測(cè)舞池之拌間除橡柱子躲本身嚷以外閑的所玻有死碼體積申所引延起的第色譜噴峰展盤(pán)寬，憂柱效揪下降?？煞謾M為：柱前臟展寬主要泰由進(jìn)雙樣引險(xiǎn)起，窗減小凈進(jìn)樣孫器的碼死體殿積，盾用閥單門(mén)進(jìn)壩樣可驚減少異柱前蒙譜帶船展寬赴，提閃高柱壯效。可分寒為：柱后紛展寬主要謝由接蘋(píng)管、項(xiàng)檢測(cè)行器流色通池膜體積釀及檢鞋測(cè)器閥響應(yīng)駛時(shí)間命等因硬素所砌引起乞。因裹此，銷盡可乏能用吊短而賺內(nèi)徑弄細(xì)的掘接管脅，減綿少流鐘通池返體積存，改暖進(jìn)檢水測(cè)器教和記孩錄系葡統(tǒng)的督響應(yīng)傲速度敗等都沖是克射服柱點(diǎn)后展買寬的斃途徑第二四節(jié)童高效液相途色譜臨儀一、炕高效感液相環(huán)色譜銜儀流籌程圖1．貯儀液罐(濾棒例，可湯濾去販顆粒稿狀物視質(zhì))2．高教壓泵劈燕（輸混液泵播）3．進(jìn)僑樣裝爐置4．色寇譜柱——分離5．檢園測(cè)器——分析6．廢碌液出怨口或爺組分林收集丘器7．記陰錄裝秘置高壓懲泵流動(dòng)必相溶納劑廢液色譜藝柱進(jìn)樣陳口檢測(cè)教器高效漆液相弟色譜密儀流萬(wàn)程圖一泛高壓勢(shì)輸液挪系統(tǒng)要求輸出雙壓力破高平穩(wěn)亡、脈饑沖小流量艙穩(wěn)定妻可調(diào)耐腐棋蝕注射讓泵1高壓泵

恒流泵特點(diǎn)是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無(wú)關(guān)，如往復(fù)式柱塞泵、注射式螺旋泵；

恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差，如氣動(dòng)泵。往復(fù)蠻式柱鄉(xiāng)豐塞泵注射醫(yī)式螺極旋泵駁；2梯度攤洗脫節(jié)裝置通過(guò)壩改變萌流動(dòng)梯相的乞組成價(jià)來(lái)調(diào)訪整組貧分的k值，辭改變牛分離姐因子α值，搜以達(dá)搬到最橫短時(shí)螞間內(nèi)接得到們最佳禽分離褲的目俗的。梯度儉洗脫適合轉(zhuǎn)于二暑元梯扯度適合紙于多懂元梯湊度等度語(yǔ)洗脫旱與梯德度洗滑脫梯度藥洗脫潤(rùn)的特蝕點(diǎn)改善泛分離厚,灣加快閘分析逼速度恰；改善愛(ài)峰形奴,騾減少稀拖尾鏟;可能剛引起基線外漂移分配刮比變傻化范鑄圍寬誤的復(fù)雜來(lái)樣品春應(yīng)采橫取梯度部洗脫你方式叉分離3貯液者瓶及奪流動(dòng)閣相1)冤對(duì)扭樣品旅有一百定的辦溶解絨度，穗以防浮在柱求頭產(chǎn)臉生沉散淀。2)島適喉用于駛所選刮擇的挪檢測(cè)貫器。3)擁化臟學(xué)惰早性好膀，以歷免破鉤壞固拒定相役。4)務(wù)低跌粘度像，增離加樣殊品的答擴(kuò)散贈(zèng)系數(shù)丘，提洽高柱櫻效。5)拍純?cè)憾雀啉潯Ｈ軐?duì)劑不響純會(huì)魄增加職檢測(cè)拘器噪艙聲，濫產(chǎn)生逐偽峰布。對(duì)流俘動(dòng)相貢溶劑育的一甚般要名求二進(jìn)樣添系統(tǒng)取樣哈和進(jìn)丟樣功愛(ài)能手動(dòng)廢和自犁動(dòng)要求獎(jiǎng)：密封臣性好死體媽積小重復(fù)福性好進(jìn)樣振時(shí)對(duì)晨色譜餡系統(tǒng)援的壓其力和天流量敵波動(dòng)使小二進(jìn)樣針系統(tǒng)

準(zhǔn)備狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)六通滲閥進(jìn)相樣裝置自動(dòng)爪進(jìn)樣戶器三色譜萬(wàn)柱內(nèi)徑唇：4～懂5mm，柱長(zhǎng)摔：10勤～5奇0cm午；柱填樸料粒衫徑3～10μm分離冤柱干法填料癢粒度測(cè)＞2控0μm時(shí)濕法顆粒點(diǎn)＜2獵0μm時(shí)色譜魄柱的乞填充勻漿杠法裝川柱示潛意圖四檢測(cè)騙系統(tǒng)溶質(zhì)予型檢測(cè)佩器總體檢測(cè)貴器示差折光檢測(cè)器介電常數(shù)檢測(cè)器紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器1紫外肚吸收緣瑞檢測(cè)充器(a)可變善波長(zhǎng)建紫外帶檢測(cè)泥器(b)二極勞管陣粱列檢使測(cè)器氘燈光柵流通懂池測(cè)量柔光電己二極膀管參比心光電別二極匪管2角二極駛管陣燥列檢剪測(cè)器兩種從檢測(cè)陣器的燈色譜有圖(a)抄：可變勻波長(zhǎng)旺紫外姐檢測(cè)削器；(b)日：二極盈管陣桂列檢澡測(cè)器(b)(a)紫外沾檢測(cè)包器靈敏痛度高鳥(niǎo)，精密對(duì)度及抗線性寒范圍游較好叢，敘可用維于梯旁度洗樂(lè)脫。頸流偏動(dòng)相抬選擇鋪有限嘉制。一些載常用巾溶劑驅(qū)的紫標(biāo)外截政止波冠長(zhǎng)溶劑CS2氯仿四氫呋喃苯乙睛甲醇水紫外截止波長(zhǎng)/nm3802452122101902051873熒光織檢測(cè)獸器靈敏廉度高護(hù)，選蒙擇性盞好，飾可用它于梯她度洗街脫。4示差炮折光隙檢測(cè)賢器利用崇組分侮與流潤(rùn)動(dòng)相嶺的折趙射率股之差改進(jìn)行貧檢測(cè)溜。通用訪性好贏，靈弦敏度躺較低損，不糖適用捕于梯澤度洗耐脫。5洞化學(xué)功發(fā)光蓬檢測(cè)味器6電化階學(xué)檢壟測(cè)器電導(dǎo)歐檢測(cè)啊器安培諒檢測(cè)尊器7質(zhì)譜墓檢測(cè)餓器五檢測(cè)敵系統(tǒng)脫氣頭裝置箏梯度竹洗脫陵再容循環(huán)藥恒情溫漢餾分鑄收集謊及處移理第三怖節(jié)筑分配喜色譜分離摘原理K不僅烤與固襯定相越的種陳類有權(quán)關(guān)，淘也與杯流動(dòng)懲相的各種類輔有關(guān)液液徐分配掙色譜液液饑色譜鍵和揀相色都譜通過(guò)踏物理網(wǎng)吸附揪的方深法將店液相洽固定話液涂獻(xiàn)在載釋體的哀表面通過(guò)急化學(xué)燦鍵合眉方法載將液排相固榜定液犧涂在朽載體害的表毀面固定幣相非臉常穩(wěn)末定，榜在使緞?dòng)弥屑埐灰仔恿魇y(cè)。由鴉于可讓將各昏種極顧性的素官能廟團(tuán)鍵伙合到網(wǎng)載體視表面治，因逗此它阿適用襪于種忙類繁晴多樣浪品的穿分離既。缺點(diǎn)特點(diǎn)固定液溶液流失一、交化學(xué)澇鍵合刪固定泰相化學(xué)漆鍵合倦固定熊相:申目唇前應(yīng)麻用最粉廣、凍性能瓦最佳嘆的固費(fèi)定相錫；硅膠為基策體，利用秩硅膠歇表面永的硅屈醇基缸(Si一OH敏)與有廊機(jī)分稱子之降間成與鍵,沫即可窄得到宴各種挎性能上的固鐮定相雁。一逆般可趁分三鎮(zhèn)類（1典）疏水液基團(tuán)如不趙同鏈議長(zhǎng)的輪烷烴往（C8和C18）和苯府基等士；（2幸）極性晌基團(tuán)如氨飄丙基島，氰浩乙基股、醚蘋(píng)和醇斬等；（3臨）離子倚交換波基團(tuán)如陰園離子積交換攤基團(tuán)螺：胺佳基，殺季銨狐鹽；份陽(yáng)離陡子交叮換基刷團(tuán)：廉磺酸糞等。鍵和類型鍵合攜方法（l）硅酸脆酯型管（≡Si一OR揭）鍵合炮相，適用遇于不蒼含水腔或醇禍的流脹動(dòng)相匆；（2）硅軌氮型覺(jué)（暢≡Si一N=）鍵太合相站，可用錢于非沾極性戲或強(qiáng)外極性課的溶星劑作腦流動(dòng)鎮(zhèn)相，亞當(dāng)使真用水瞞溶液多時(shí)，逮必須倍限制pH在4限8范圍惜內(nèi)；（3）硅嬌碳型丟（≡Si一C≡）鍵合導(dǎo)相，麗同硅經(jīng)氮型孩；（4）硅憐氧烷逝型（≡Si一O一Si一C≡）鍵合還相，具有宵熱穩(wěn)膚定性綠好，投不易跨吸水還，耐珍有機(jī)母溶劑萍，能延在70夸C以下王，pH在2睛8范圍鮮內(nèi)正鼠常工謝作。2.竄鍵斗合相豆色譜看法分恒類反相京鍵合婆相色幻玉譜:常用杏固定借相：C18分離墊對(duì)象非極匪性中等鑼極性桶化合掩物常用濁流動(dòng)本相甲醇等-水乙腈涂-水反相擋鍵合賴相色伶譜疏溶援劑分掩離機(jī)嚼制固定粥相極叨性<百流動(dòng)棄相極吐性正相情鍵合孫相色撤譜固定捏相極繼性窯>墳流動(dòng)蘇相極爆性離子俱性鍵糟合相窗色譜將各營(yíng)種離塵子交掘換基某團(tuán)化帽學(xué)鍵典合到另硅膠千基質(zhì)賠表面謀上，蹄就形尤成了匪離子襯性鍵押合相祝色譜朽的固干定相悠。其迫分離逼原理植與離篇子交油換色鄰譜類饑同。3.絲式化學(xué)暫鍵合庸固定躍相的辰特點(diǎn)（1班）傳質(zhì)需快（2們）壽命磁長(zhǎng)（4瓶）選擇剩性好（5淘）有利阿于梯嫁度洗豪脫；存在顛著雙重預(yù)分離六機(jī)制：(鍵大合基能團(tuán)的徐覆蓋饅率決挺定分收離機(jī)翻理)高覆秋蓋率拋：分鑼配為店主；低覆叉蓋率補(bǔ)：吸膀附為撐主；二、聰固定尚相流肢動(dòng)相散的選摧擇第二饞，流頌動(dòng)相傲的極策性與套分析泳物質(zhì)鍵的極問(wèn)性相互匹配烏，用極性牽明顯葡不同型固定苗相。第三扭，固浴定相爽的極魂性與狼分析擊物質(zhì)孕的極拜性相鈴匹配運(yùn)，僅有買流動(dòng)疑相的鹽差異宅使分惜析物穴質(zhì)沿錢柱移滿動(dòng)。柱子損的選翁擇第一，固定相的極性與分析物質(zhì)的極性粗配，用極性明顯不同的流動(dòng)相洗脫。反相毫鍵合盈相色障譜:常用烤流動(dòng)冰相甲醇賊-水乙睛霸-水分離題對(duì)象非極疾性中等編極性腎化合緩物通過(guò)核調(diào)節(jié)緩水的遮含量繼，可使山保留橋因子k迅速拉變化通過(guò)腳改變睛流動(dòng)縫相的邊化學(xué)翠性質(zhì)年，可使夠選擇倍因子α迅速遼變化反相編色譜暗四溶企劑系蒙統(tǒng)甲醇易、乙趁腈、伏四氫憶呋喃陡、水正相攤色譜菠四溶某劑系劃統(tǒng)乙醚產(chǎn)、氯某仿、局三氯泳甲烷怖、正狼己烷調(diào)節(jié)k調(diào)節(jié)α三、緩洗脫北物的起流出鄰順序反相躁鍵合塌相色蠻譜:極性尖大的獎(jiǎng)先流鋪出，毯極性遇小的笨后流劑出正相拴鍵合氏相色裁譜:極性阿小的艘先流櫻出，朱極性陜大的饑后流陶出四、襯分配皇色譜悶的應(yīng)釀?dòng)猛ㄟ^(guò)堤改變能流動(dòng)哪相的帽組成驚，容忙易調(diào)霜節(jié)kα反相鍵和相色譜的優(yōu)點(diǎn)用單此柱和代流動(dòng)進(jìn)相就谷能分抽離非報(bào)離子慚化合維物、離子裙化合易物、簡(jiǎn)可電存離化其合物用便霧宜的喪水作謠為流之動(dòng)相受的主押體，嘉以價(jià)仇格適齊宜且易傾純化棒的甲無(wú)醇為就有機(jī)隊(duì)改性飼劑可以府預(yù)言顛洗脫滲順序色譜乓柱平墻衡快轉(zhuǎn)，適濁宜梯嚴(yán)度洗倆脫反相島色譜節(jié)法是費(fèi)應(yīng)用旱最廣淡的色這譜法桑，主甘要用罩于分詳離非幸極性圾至中束等極哨性的頃各類腦分子優(yōu)型化情合物戴，因樓為鍵修合相報(bào)表面券的官菊能團(tuán)煌不流協(xié)失，創(chuàng)溶劑箱的極壤性可鴨以在綢很大貞范圍厲內(nèi)調(diào)巷整，錦因此窗應(yīng)用晶范圍災(zāi)很寬罵。由扮它派摸生的沿反相旅離子漂對(duì)色怎譜法在與離毀子抑季制色鏟譜法妖，可晨以分捉離有圖機(jī)酸固、堿玩、鹽風(fēng)等離課子型塘化合棗物。用反愁相液若相色痰譜法聚，可泄以解宴決8睡0%寄左右孝的液次相色煎譜課探題。因此衡，必焦須給新予反獸相色藥譜法斑足夠嗓的重?zé)嵋暋Ｋ詫?duì)于煤結(jié)構(gòu)端異構(gòu)冒體等削難分崗離物歷質(zhì)的隨分離籌，則更應(yīng)選傷用吸降附色任譜法擇。具體員看表噴21濤-3第四么節(jié)課液固逮吸附寨色譜一宴吸附芳色譜槽法1分離費(fèi)原理Kad值越趨大，晉保留戀時(shí)間躬越長(zhǎng)滋。2固定穿相硅膠－強(qiáng)極性氧化鋁－弱極性活性炭－非極性分子篩－強(qiáng)極性高分子多孔微球(GDX)固體吸附劑3流動(dòng)?xùn)|相(洗脫窮劑)越大，表明流動(dòng)相溶劑分子對(duì)吸附劑的親和能力越強(qiáng)，則越易從吸附劑上將被吸附的溶質(zhì)洗脫下來(lái)。溶劑鏟分子饞在單成位吸鉆附劑狀表面糾上的脅吸附鎖自由縣能溶劑決強(qiáng)度購(gòu)參數(shù)硅膠聾固定播相分公離苯怪，甲壘苯，牲乙苯筋，丙嘗苯，換丁苯流動(dòng)倘相：干燥刺正庚裂烷1份穴水飽建和的喝正庚片烷2份緣瑞干燥笨正庚攪烷水飽帝和的懶正庚券烷改變惡流動(dòng)慨相的組成植可改都變分范離的選陷擇性4應(yīng)用具有不同踩官能啦團(tuán)的氧化合伯物具有膊相同松官能婦團(tuán)，蜓但數(shù)即量不碌同的沒(méi)化合董物異構(gòu)淹體例：肉幾種粒取代業(yè)位置娘不同刺的硝純基苯仰胺的拴分離曉。在昏硅膠秒吸附柜劑上抬的滯獻(xiàn)留順季序：鄰位<間財(cái)位<貨對(duì)位鄰硝基苯胺間硝基苯胺對(duì)硝基苯胺適合鍬分離管的物起質(zhì)第五傭節(jié)個(gè)其他洞色譜奸分析一天離子備交換殊色譜坑法陽(yáng)離談子交板換樹(shù)生脂陽(yáng)離宰子交你換陰離接子交印換1分離亭原理2固定碌相陽(yáng)離揚(yáng)子：－SO3H(強(qiáng))－CO2H(弱)陰離暖子