基因編輯方法CRISPR-Cas9課件

CRISPR-Cas9一種新型基因編輯方法*又稱基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)，通過在某些物種基因組中進(jìn)行靶向特異性的突變，從而解答并提出更多精確的生物學(xué)問題。方法包括：鋅指核酸酶（Zinc-fingernuclease，ZFN）技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN）技術(shù)Cas9/gRNA系統(tǒng)(CRISPR-cas9技術(shù))基因組編輯技術(shù)*Cell2014157,1262-1278Figure2B不論是TALEN技術(shù)還是ZFN技術(shù)，其定向打靶都依賴于DNA序列特異性結(jié)合蛋白模塊的合成,將蛋白模塊與限制性內(nèi)切酶(FokⅠ)的DNA切割域融合而得到。由蛋白特異結(jié)合域定位，DNA切割域剪切。鋅指核酸酶（ZFN）＆轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)Cell2014157,1262-1278Figure2A*

CRISPR-Cas9技術(shù)

原理：規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPRs）CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在不斷進(jìn)化的過程中獲得一種適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，研究者根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)的特性對(duì)此系統(tǒng)進(jìn)行改造產(chǎn)生了第3代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)——CRISPR-Cas9技術(shù)。該技術(shù)通過小片段的RNA介導(dǎo)對(duì)入侵的核酸進(jìn)行靶向定位并通過Cas酶對(duì)核酸進(jìn)行酶切、降解。CRISPR-Cas9技術(shù)是一種多物種適應(yīng)性的，位點(diǎn)特異性的有效基因組編碼工具。Cell2014157,1262-1278Figure4*

CRISPR-Cas9技術(shù)

從已知的序列中通過PAM進(jìn)行定位尋找合適的靶位點(diǎn)并合成gRNA構(gòu)建gRNA與/Cas9重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行活性檢測(cè)，敲除活性的計(jì)算挑選活性較高的敲除質(zhì)粒導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞或者生物體內(nèi)進(jìn)行基因組定點(diǎn)編輯操作利用測(cè)序、RFLP等方法檢測(cè)基因組定點(diǎn)修飾結(jié)果*sgRNA的設(shè)計(jì)選擇PAM（NGG）5‘端的一段堿基序列20nt作為原間隔序列，即敲除的靶位點(diǎn)。(PAM，Protospaceradjacentmotifs原間隔序列臨近基序。一般形式為NGG，其作用是將間隔序列定位于入侵的噬菌體或質(zhì)粒的DNA序列中)原則：選擇的序列必須在全基因組中進(jìn)行比對(duì)，原間隔序列必須唯一，否則會(huì)對(duì)其他基因進(jìn)行敲除而出現(xiàn)錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。優(yōu)先選擇DSB位點(diǎn)的側(cè)翼存在重復(fù)序列（如果DSB的側(cè)翼存在重復(fù)序列，在進(jìn)行非同源末端重組時(shí)能夠精確的介導(dǎo)斷裂位點(diǎn)堿基的缺失）。PAM的5‘端盡量存在酶切位點(diǎn)。（有利于后期的活性檢測(cè)）*構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建方案：一是將gRNA與Cas9連入同一個(gè)質(zhì)粒載體中并以雙啟動(dòng)子啟動(dòng)，載體中攜帶熒光報(bào)告基因（用于流式細(xì)胞儀篩選）或抗性基因（用于藥物篩選）。二是將gRNA與Cas9分別連載不同的載體上，兩個(gè)載體攜帶有不同的熒光報(bào)告基因或抗性基因載體選擇：慢病毒載體

以HIV-1的主要功能元件為基礎(chǔ)構(gòu)建起來的轉(zhuǎn)基因和基因治療載體。區(qū)別于腺病毒載體，可實(shí)現(xiàn)外源基因在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的傳代表達(dá)。**降低sgRNA/Cas9脫靶率的方法Cas9的兩個(gè)內(nèi)切酶活性域?yàn)镽uvC和HNH,兩個(gè)亞基分別負(fù)責(zé)對(duì)一條DNA單鏈的切割。任一亞基的失活都將形成DNA單鏈斷裂（nickedDNA）。當(dāng)結(jié)合于兩條互補(bǔ)的DNA鏈上相鄰位置的一對(duì)sgRNA同時(shí)引導(dǎo)Cas9D10A識(shí)別并切割靶位點(diǎn)時(shí)才能造成DSB，從而加大了識(shí)別的長(zhǎng)度，有效的提高了Cas9-sgRNA技術(shù)的特異性。Cell2014157,1262-1278Figure6A,B*重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞/生物體C、將編碼Cas9和sgRNA的表達(dá)質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染至細(xì)胞系中。D、將純化的Cas9和體外表達(dá)的sgRNA顯微注射至受精卵，快速得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。E、將編碼CRISPR組分的高效價(jià)的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至組織或細(xì)胞，完成特定時(shí)間，組織的基因編輯。Cell2014157,1262-1278Figure6C,D,E*CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展CRISPR/Cas系統(tǒng)可以作為一種位點(diǎn)特異性基因編輯平臺(tái)Cas9-sgRNA在靶位點(diǎn)切割產(chǎn)生DSB后，細(xì)胞可以通過兩種方式對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù)，非同源末端連接（non-homologousendjoining，NHEJ）修復(fù)方式和同源重組方式（homology-directedrepair，HDR）。NHEJ往往使得核酸鏈被剪切的區(qū)域發(fā)生基因突變，導(dǎo)致編碼的基因Knockdown。而HDR往往通過供體DNA與基因組DNA之間的同源重組造成靶位點(diǎn)的糾正或者靶向插入外源基因Knockin。Cell2014157,1262-1278Figure2A*CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展通過點(diǎn)突變使Cas9蛋白的兩個(gè)核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域活性全部喪失獲得dCas9，將dCas9-sgRNA作為與DNA特異性識(shí)別的平臺(tái)，令轉(zhuǎn)錄因子或表觀調(diào)控酶與dCas9-sgRNA融合表達(dá)，即可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。Cell2014157,1262-1278Figure6G*CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

CRISPR/Cas蛋白亞型（Ⅲ型）被證明可以靶向消化RNA底物。預(yù)示著該技術(shù)的發(fā)展將會(huì)代替shRNA/siRNA等傳統(tǒng)RNAi技術(shù)成為一種新型的RNA干擾物而對(duì)不同種類的細(xì)胞及動(dòng)物模型中特定的基因的下游產(chǎn)物進(jìn)行RNA干擾。Cell2014157,1262-1278Figure4截圖

*CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

Cell2014157,1262-1278Figure6F*CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

Cell2014157,1262-1278Figure6HCas9和GFP融合表達(dá)，可動(dòng)態(tài)記錄胞內(nèi)DNA特定位點(diǎn)的染色體結(jié)構(gòu)狀態(tài)

。*CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展

Cell2014157,1262-1278Figure6I

通過化學(xué)或可控因素誘導(dǎo)Cas9肽片段的重建，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的誘導(dǎo)調(diào)控。*展望到目前為止對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)的開發(fā)尚屬初步。雖然Cas9系統(tǒng)會(huì)被sgRNA引導(dǎo)從而識(shí)別出靶序列，但脫靶效應(yīng)依然存在，特異性仍待提高。