第二講基因與基因工程

本文檔共71頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\12點15分第一節(jié)遺傳學(xué)基本定律第二節(jié)基因是什么？第三節(jié)遺傳密碼與蛋白質(zhì)合成第四節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控和DNA損傷的修復(fù)第五節(jié)基因工程第二講基因與基因工程本文檔共71頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\12點15分生命通過繁殖而延續(xù)，繁殖是生命最基本的特征之一。通過繁殖，生物的基本特征信息由父方和母方傳遞給下一代，這種信息傳遞稱為遺傳。1953年，Watson和Crick確立了DNA雙螺旋模型，開創(chuàng)了遺傳學(xué)乃至生命科學(xué)的新紀(jì)元。遺傳學(xué)真是一塊神秘的領(lǐng)地本文檔共71頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\12點15分第一節(jié)遺傳學(xué)基本定律第一節(jié)一、Mendel的遺傳學(xué)定律1822年出生于奧地利鄉(xiāng)村21歲修道院進(jìn)修 中學(xué)代課教師1851-1853維也納大學(xué)大學(xué)畢業(yè) 在修道院的花園里，Mendel進(jìn)行豌豆的遺傳育種研究獲得了重要的成果。本文檔共71頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\12點15分第一節(jié)豌豆單因子雜交實驗本文檔共71頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\12點15分第一節(jié)豌豆6組相對性狀分別雜交實驗結(jié)果本文檔共71頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\12點15分用等位基因分離定律解釋豌豆雜交實驗出現(xiàn)的3∶1現(xiàn)象第一節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\12點15分第一節(jié)測交實驗方法，驗證了推斷的正確性。本文檔共71頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\12點15分根據(jù)上述實驗和分析，Mendel建立了遺傳學(xué)第一定律，即“分離定律”：一對等位基因在形成配子時完全獨立地分離到不同的配子中去，相互不影響。

本文檔共71頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\12點15分第一節(jié)多對基因的獨立分配和自由組合本文檔共71頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\12點15分Mendel由此推論得出第二定律——“多對等位基因的獨立分配和自由組合定律”。這個規(guī)律表明，當(dāng)兩對或更多對基因處于異質(zhì)接合狀態(tài)時，它們在形成配子時的分離是彼此獨立不相牽連的，受精時不同配子相互間進(jìn)行自由組合。

本文檔共71頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\12點15分第一節(jié)20世紀(jì)初，遺傳的染色體學(xué)說的建立，使人們重新認(rèn)識到Mendel遺傳學(xué)定律的重要意義。即：基因位于染色體上，成對的染色體及其位于染色體上的等位基因在細(xì)胞減數(shù)分裂時分離，獨立分配到配子中，經(jīng)過有性生殖過程中雌雄配子的結(jié)合，它們重新組合配對。20世紀(jì)初，美國著名的遺傳學(xué)家Morgan及其同事通過果蠅的雜交試驗，確立了基因在染色體上的連鎖和交換規(guī)律，被后人稱為遺傳學(xué)第三定律。二、Morgan的基因連鎖與交換本文檔共71頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\12點15分第一節(jié)在染色體上灰身基因(G)與長翅基因(L)始終連鎖在一起，黑身基因(g)與短翅基因(l)始終連鎖在一起。F1代雜合子在形成配子時，這兩對基因不能自由組合，原來兩個位于同一染色體上的基因只能共同遺傳而不能被拆開?；疑黹L翅和黑身短翅兩親本性狀占測交后代的大多數(shù)且比例為1∶1?；蜻B鎖本文檔共71頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\12點15分第一節(jié)染色體上的連鎖基因還可以發(fā)生交換?；疑砗烷L翅基因（G和L）雖然原來定位在同一染色體上，但在減數(shù)分裂和配子形成過程中，同源染色體在配對時會發(fā)生同源染色體片段之間的相互交換，導(dǎo)致其上基因的重組。

基因互換本文檔共71頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\12點15分第二節(jié)基因是什么？第二節(jié)一、基因是由什么物質(zhì)組成的在20世紀(jì)的前40年，困擾科學(xué)家的兩個最基本的問題依然沒有解決：①基因是由什么物質(zhì)組成的？②基因是如何工作的？在對細(xì)菌和病毒這些極其簡單的生命形式的研究中，科學(xué)家才發(fā)現(xiàn)了遺傳物質(zhì)的蛛絲馬跡。事實再一次證明，從簡單到復(fù)雜是科學(xué)的研究方法。本文檔共71頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\12點15分第二節(jié)返回豌豆和果蠅是復(fù)雜的多細(xì)胞生物，而細(xì)菌和病毒是極其簡單的生命形式，在對細(xì)菌和病毒的生命形式的研究中，科學(xué)家才發(fā)現(xiàn)了遺傳物質(zhì)的蛛絲馬跡。本文檔共71頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\12點15分第二節(jié)1928年，GriffithS型肺炎鏈球菌： 有莢膜，菌落表面光滑R型肺炎鏈球菌： 沒有莢膜，菌落表面粗糙結(jié)果說明——？著名的肺炎鏈球菌實驗本文檔共71頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\12點15分第二節(jié)結(jié)果說明，加熱殺死的S型肺炎鏈球菌中一定有某種特殊的生物分子或遺傳物質(zhì)，可以使無害的R型肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化為有害的S型肺炎鏈球菌。這種生物分子或遺傳物質(zhì)是什么呢？美國紐約洛克菲勒研究所的Avery。從加熱殺死的S型肺炎鏈球菌中將各種生物化學(xué)成分如蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類等分離出來，分別加入到無害的R型肺炎鏈球菌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，唯獨只有核酸可以使無害的R型肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化為有害的S型肺炎鏈球菌。1944年Avery等正式得出了結(jié)論：DNA是生命的遺傳物質(zhì)，蛋白質(zhì)不是生命的遺傳物質(zhì)。本文檔共71頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\12點15分第二節(jié)更有說服力的噬菌體實驗1952年Hershey和Chase用專門感染細(xì)菌的病毒（噬菌體）為實驗材料，利用放射性同位素標(biāo)記完成了噬菌體實驗。本文檔共71頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\12點15分第二節(jié)Watson和Crick的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論奠定了生命遺傳的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，標(biāo)志著現(xiàn)代遺傳學(xué)的開始。DNA分子是由兩條脫氧核糖核酸長鏈互以堿基配對相連而成的螺旋狀雙鏈分子，連接的原則是A與T配對，G與C配對，兩條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的。由于堿基互補(bǔ)配對的高度精確性，在細(xì)胞分裂前DNA復(fù)制的時候，可以使貯藏在DNA分子中以4種核酸堿基編碼的遺傳信息得以穩(wěn)定地向下一代傳遞。二、DNA分子本文檔共71頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\12點15分第二節(jié)證明DNA半保留復(fù)制的同位素示蹤實驗。本文檔共71頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\12點15分DNA的復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞周期的S期，在解旋酶的作用下，首先雙螺旋的DNA可以同時在許多DNA復(fù)制的起始位點局部解螺旋并拆開為兩條單鏈，如此在一條雙鏈上可形成許多“復(fù)制泡”，解鏈的叉口處稱為復(fù)制叉。DNA的復(fù)制總是由5′向3′方向進(jìn)行。在親代DNA解螺旋后的復(fù)制叉處，按照由5′向3′方向復(fù)制的原則，一條子鏈可以連續(xù)向著分叉處進(jìn)行復(fù)制和延伸，而另一條子鏈則不能連續(xù)向著分叉處復(fù)制和延伸。因此，在DNA聚合酶的作用下，隨著復(fù)制叉不斷打開，先合成一段新的RNA短鏈，稱為引物。在引物后再仍按5′向3′方向使游離的核苷酸加到新鏈的3′端，這時的DNA的復(fù)制和延伸不是連續(xù)的，而是分段進(jìn)行的，每合成的一小段片段稱為岡崎片段。以后岡崎片段前的RNA引物被DNA短鏈取代，DNA連接酶又使岡崎片段連接成為連續(xù)的新鏈。第二節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\12點15分第二節(jié)返回DNA復(fù)制叉本文檔共71頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\12點15分第二節(jié)返回DNA復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制。本文檔共71頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\12點15分RNA是核糖核酸的縮寫，它與脫氧核糖核酸（DNA）的主要差別在于：（1）RNA大多是單鏈分子；（2）含核糖而不是脫氧核糖；（3）4種核苷酸中，不含胸腺嘧啶（T），而是由尿嘧啶（U）代替了胸腺嘧啶（T）。細(xì)胞中主要有3種RNA，即信使RNA（mRNA）、核糖體RNA、（rRNA）和轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）。在真核生物中由DNA遺傳信息控制的蛋白質(zhì)合成涉及兩個基本過程：第一步，DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)錄到mRNA中，發(fā)生在細(xì)胞核中，轉(zhuǎn)錄與DNA的復(fù)制過程大致相同；第二步，將mRNA的信息翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列，在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行。第二節(jié)三、RNA分子

本文檔共71頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\12點15分mRNA是遺傳信息的攜帶者。它在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄了DNA上的遺傳信息，再進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，作為蛋白質(zhì)合成的模板。原核細(xì)胞與真核細(xì)胞mRNA的主要區(qū)別：①5’端有無帽子結(jié)構(gòu)。②3’端有多聚腺苷酸結(jié)構(gòu)。tRNA局部成為雙鏈，在其3′、5′端的相反一端的環(huán)上具有由3個核苷酸組成的反密碼子。tRNA的反密碼子在蛋白質(zhì)合成時與mRNA上互補(bǔ)的密碼子相結(jié)合。tRNA起識別密碼子和攜帶相應(yīng)氨基酸的作用。tRNA的二級結(jié)構(gòu)都呈三葉草形。rRNA和蛋白質(zhì)共同組成的復(fù)合體就是核糖體，是細(xì)胞中最豐富的一類RNA。rRNA在核糖體中既具有結(jié)構(gòu)上的功能，又參與翻譯過程的起始等反應(yīng)。在核糖體上具有附著mRNA模板鏈的位置，還有兩個tRNA附著的位置，分別稱為A位和P位。A位供攜帶一個新氨基酸的tRNA進(jìn)入并停留，P位供攜帶待延長的多肽鏈的tRNA停留。第二節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\12點15分第二節(jié)返回tRNA和反密碼子本文檔共71頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\12點15分rRNA和蛋白質(zhì)共同組成的復(fù)合體就是核糖體，核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所。核糖體由大小不同的兩個亞基組成，這兩個亞基只有在行使翻譯功能即肽鏈合成時才聚合成整體，為蛋白質(zhì)的合成提供場所。返回本文檔共71頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\12點15分遺傳密碼的問題，即遺傳信息是如何貯藏在只有簡單的堿基差別的4種核苷酸中的？第三節(jié)遺傳密碼與蛋白質(zhì)合成第三節(jié)一、遺傳密碼的破譯

本文檔共71頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\12點15分發(fā)現(xiàn)工具酶：1955年，紐約大學(xué)的Grunberg-Manago發(fā)現(xiàn)并分離獲得了一種可以將核苷酸連接起來的酶，用這種酶，可以將核苷酸連接成RNA聚合體。例如：可以把腺嘌呤核苷酸（A）連接成多聚A（polyA，A-A-A-A-A-A-A），還可以制備polyC,polyG,polyU,polyAU等?！獑栴}：什么樣的核苷酸組合可以被翻譯成多肽片段？第三節(jié)合成多肽：1960年，31歲的Matthei到國家健康研究所，與Nirenberg合作研究在試管中合成多肽的工作。他們在試管中將ATP和游離的氨基酸加入到從細(xì)胞中提取的核糖體、核酸和酶的混合物中，其他學(xué)者已經(jīng)用這種方法將氨基酸連接到一段肽鏈上去，但是人們不知道應(yīng)該在試管中加入什么遺傳信息來合成特定的多肽。——問題：哪一種RNA可以促進(jìn)多肽的合成？本文檔共71頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\12點15分尋找信息提供者：他們建立和優(yōu)化了一種對RNA高度敏感并可以及時檢測多肽合成的試管實驗系統(tǒng)。首先在試管中加入了ATP、游離的氨基酸、酶和核糖體及核糖體RNA，這時試管中并沒有蛋白質(zhì)的合成，實驗說明，僅有核糖體及核糖體RNA是不夠的?！獑栴}：可能還需要帶有遺傳信息的RNA？第三節(jié)信息RNA如何工作：選擇煙草花葉病毒RNA，大量的氨基酸在他們的試管系統(tǒng)中被合成為一些神秘的蛋白質(zhì)。接下來，在一組試管中加入不同的酶、核糖體、ATP、16種手頭已有的氨基酸，然后在其中分別加入Grunberg-Manago方法人工合成的polyU、polyA、polyAU。在polyU試管中產(chǎn)生了許多蛋白質(zhì)?！獑栴}：polyU主要利用了哪些氨基酸呢？本文檔共71頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\12點15分世界上破譯第一個遺傳密碼的人：Matthei他將不同的氨基酸分別加入到polyU試管系統(tǒng)中。通過連續(xù)5天通宵達(dá)旦的工作，星期六早晨，熬紅了眼的Matthei終于得到了答案：polyU合成的肽鏈全部是苯丙氨酸（Phe）?！獑栴}：幾個U可以在肽鏈上決定一個苯丙氨酸的合成？第三節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\12點15分Nirenberg全力組織其他遺傳密碼的破譯，Matthei回到德國獨自進(jìn)行研究。Nirenberg與其他科學(xué)家合作，發(fā)現(xiàn)3個核苷酸為一個密碼子并決定一個氨基酸的翻譯。Khorana發(fā)明了一種利用重復(fù)序列按設(shè)計需要連接任意核苷酸的方法，他發(fā)現(xiàn)ACACACACACACAC鏈合成的是Thr-His-Thr-His（蘇氨酸-組氨酸-蘇氨酸－組氨酸）鏈，證明ACA是決定蘇氨酸的密碼子，CAC是決定組氨酸的密碼子等。第三節(jié)到1966年，Nirenberg和Khorana等人完成了對全部遺傳密碼的破譯。本文檔共71頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\12點15分第三節(jié)在全部64個密碼子中，61個密碼子負(fù)責(zé)20種氨基酸的翻譯，1個是起始密碼子，3個是終止信號（終止密碼子）。

本文檔共71頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\12點15分轉(zhuǎn)錄第三節(jié)二、遺傳信息的傳遞——中心法則本文檔共71頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\12點15分真核生物細(xì)胞核中，前體mRNA需要經(jīng)過剪接除去內(nèi)含子、拼接、5‘端加一個7-甲基鳥苷酸“帽子”和在3’端加上一個多聚腺苷酸尾等加工過程。形成成熟的mRNA，才能穿過核孔，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中。第三節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\12點15分蛋白質(zhì)的合成是一個嚴(yán)格按照mRNA上密碼子的信息指導(dǎo)氨基酸單體合成為多肽鏈的過程，這一過程稱為mRNA的翻譯。mRNA的翻譯需要有mRNA、tRNA、核糖體、多種氨基酸和多種酶等的共同參與。翻譯過程(即多肽鏈的合成)包括起始、多肽鏈延長和翻譯終止3個基本階段。在細(xì)胞質(zhì)中，翻譯是一個快速過程，一段mRNA可以相繼與多個核糖體結(jié)合，同時進(jìn)行多條同一種肽鏈的合成。蛋白質(zhì)合成以后還要經(jīng)歷各種修飾和加工。真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)的修飾加工往往在特定的細(xì)胞器中進(jìn)行第三節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\12點15分第三節(jié)返回翻譯開始時，核糖體小亞基先與mRNA的起始密碼（如AUG）部位和一個帶有相應(yīng)反密碼子的特定tRNA相結(jié)合。接著核糖體大亞基與核糖體小亞基結(jié)合，形成完整的核糖體。起始tRNA處于核糖體的P位，下一個氨基酸由相應(yīng)的氨酰tRNA攜帶進(jìn)入到A位。本文檔共71頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\12點15分第三節(jié)返回A位氨基酸的氨基與P位氨基酸的羧基之間形成肽鍵，起始tRNA與氨基酸脫離，P位的tRNA轉(zhuǎn)移到E位后脫離核糖體。新形成的二肽的tRNA轉(zhuǎn)移到已空出的P位上，A位又可以接受下一個氨酰tRNA，如此重復(fù)將氨基酸逐個合成到肽鏈上的過程。本文檔共71頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\12點15分第三節(jié)返回隨著翻譯的進(jìn)行及多肽鏈的延長，當(dāng)mRNA上的終止密碼子進(jìn)入到核糖體的A位時，一種肽鏈釋放因子（蛋白酶）便與A位的終止密碼子結(jié)合，多肽鏈與P位的tRNA水解分離，合成完畢的多肽鏈從核糖體中被釋放出來，再折疊組裝成有功能的蛋白質(zhì)。本文檔共71頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\12點15分第三節(jié)返回一段mRNA可以相繼與多個核糖體結(jié)合，同時進(jìn)行多條同一種肽鏈的合成。本文檔共71頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\12點15分第三節(jié)中心法則示意圖本文檔共71頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\12點15分第四節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控和DNA損傷的修復(fù)第四節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\12點15分第四節(jié)乳糖操縱子學(xué)說：沒有乳糖時，操縱子前端的調(diào)節(jié)基因編碼產(chǎn)生的阻遏蛋白使乳糖操縱子處于關(guān)閉狀態(tài)；有乳糖時，乳糖分子首先與阻遏蛋白相互結(jié)合，改變了阻遏蛋白的形狀，使后者不能再與操縱基因相結(jié)合。這時，操縱基因便開啟。原核基因表達(dá)的調(diào)控本文檔共71頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\12點15分第四節(jié)真核生物基因表達(dá)的調(diào)控可以發(fā)生在不同的水平上：

（1）轉(zhuǎn)錄水平的控制。

（2）對前體mRNA的加工。

（3）mRNA穿過核膜向細(xì)胞質(zhì)運輸?shù)目刂啤?/p>

（4）在細(xì)胞質(zhì)中mRNA的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)和mRNA的選擇性降解。

（5）mRNA的選擇性翻譯和翻譯速率的調(diào)節(jié)。

（6）蛋白質(zhì)產(chǎn)物的修飾、與活化等。真核基因表達(dá)的調(diào)控本文檔共71頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\12點15分第四節(jié)細(xì)胞中核酸序列的改變通過基因表達(dá)有可能導(dǎo)致生物遺傳特征的變化。這種核酸序列的變化稱為基因突變。DNA序列中涉及單個核苷酸或堿基的變化稱為點突變。點突變通常有兩種情況：一是一個堿基或核苷酸被另一種堿基或核苷酸所替換；二是一個堿基的插入或缺失。DNA鏈中某一個堿基被另一個所替換，這種替換的結(jié)果有時可以不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。這種突變稱為同義突變。DNA鏈中有的堿基的替換造成一個密碼子的改變，進(jìn)而改變了多肽鏈上一個氨基酸種類，這種替換稱為錯義突變。在DNA鏈上，插入或缺失一個或幾個非3的堿基，這種突變會使其下游的三聯(lián)密碼子都被讀錯，產(chǎn)生完全錯誤的肽鏈或使肽鏈合成提前終止，稱為移碼突變。基因突變和DNA損傷的修復(fù)本文檔共71頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\12點15分返回第四節(jié)替換造成的同義突變和錯義突變

本文檔共71頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\12點15分返回第四節(jié)插入和缺失造成的突變又稱為：移碼突變本文檔共71頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\12點15分第四節(jié)基因突變可能改變蛋白質(zhì)（酶）的結(jié)構(gòu)與功能，使生物體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、代謝過程和生理功能等特征發(fā)生改變，嚴(yán)重的突變則影響生物體的生存力或?qū)е律飩€體的死亡。如腫瘤的發(fā)生就與一些控制細(xì)胞周期、分裂和生長的基因突變有密切的關(guān)系；引起鐮狀細(xì)胞貧血癥的原因就是基因的點突變等?；蛲蛔兊脑蚨喾N多樣。除了DNA復(fù)制錯誤造成堿基的替換、插入或缺失等自發(fā)突變外，一些外界因素如某些化學(xué)物質(zhì)（又稱為誘變劑）、紫外線、電離輻射等也可能誘導(dǎo)基因突變或損傷的發(fā)生。在生物長期進(jìn)化過程中，生物細(xì)胞也形成了一套DNA損傷或突變的修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞自行修復(fù)DNA損傷的主要方式有光復(fù)合修復(fù)、切除修復(fù)，還有重組修復(fù)、應(yīng)答修復(fù)、錯配修復(fù)等幾種。本文檔共71頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\12點15分返回第四節(jié)引起鐮形細(xì)胞貧血癥的原因就是基因的點突變，即編碼血紅蛋白β肽鏈上一個決定谷氨酸的密碼子GAA變成了GUA，使得β肽鏈上的谷氨酸變成了纈氨酸，引起了血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了根本的改變。本文檔共71頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\12點15分第四節(jié)返回DNA的光復(fù)合修復(fù)和切除修復(fù)本文檔共71頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\12點15分第五節(jié)重組DNA技術(shù)─基因工程

第五節(jié)重組DNA操作的一般步驟本文檔共71頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\12點15分進(jìn)行DNA重組操作，首先要獲得需要的目的基因，最常用的方法包括：（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因文庫，從中調(diào)用目的基因。（2）以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA片段。（3）利用聚合酶鏈。反應(yīng)（PCR）特異性地擴(kuò)增所需要的目的基因片段。

一、獲得目的基因第五節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\12點15分返回將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在細(xì)菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，便構(gòu)成了該生物的基因文庫。第五節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\12點15分返回逆轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ)DNA：

（1）細(xì)胞核內(nèi)的基因組經(jīng)過轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生出前體mRNA；

（2）經(jīng)剪切作用后，除去內(nèi)含子，形成了成熟mRNA.

（3）從細(xì)胞中分離出所需要的mRNA，再以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則人工合成一段與之互補(bǔ)的DNA片段，這一過程稱為逆轉(zhuǎn)錄。

（4）逆轉(zhuǎn)錄完成時，RNA被降解。接著，在大腸桿菌DNA聚合酶的作用下，再以第一條DNA為模板，人工合成另一條互補(bǔ)的DNA子鏈。第五節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\12點15分聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)即PCR技術(shù)是在體外的小試管中通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增（包括分離）一段目的基因的技術(shù)。該技術(shù)高效、快捷、特異性好。完成PCR需要在小試管中加入4種物質(zhì)：（1）作為模板的DNA序列，即從細(xì)胞中提取分離的微量總DNA.（2）與計劃獲取的目的基因雙鏈各自3’端序列相互補(bǔ)的兩種DNA引物（人工合成的約20個堿基的短DNA小片段）.（3）TaqDNA聚合酶，該酶具有很好的熱穩(wěn)定性.（4）4種脫氧核苷酸，簡寫為dNTP（包括dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。整個聚合酶鏈反應(yīng)在特制的PCR儀中進(jìn)行，4種反應(yīng)混合物經(jīng)歷了變性、退火、延伸三步曲。第五節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\12點15分（1）變性：在95℃高溫下,作為模板的雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA。（2）退火：反應(yīng)體系的溫度降至55-60℃，使得部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對并結(jié)合。（3）延伸：反應(yīng)體系的溫度回升到72℃左右，TaqDNA聚合酶在該合適溫度條件下以目的基因為模板，逐個將4種脫氧核苷酸依照模板DNA的堿基順序按堿基互補(bǔ)的原則連接在引物之后，使合成的新鏈延伸，形成互補(bǔ)的DNA雙鏈。新形成的雙鏈DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板。第五節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\12點15分

1988年由美國科學(xué)家KaryMullis發(fā)明；開汽車時的聯(lián)想，使他以后發(fā)明了PCR技術(shù)；1993年獲得了諾貝爾獎。返回PCR的發(fā)明：第五節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\12點15分基因重組和克隆操作最重要的工具是限制性內(nèi)切酶、載體和宿主菌。限制性內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離提純的核酸內(nèi)切酶，可以識別一小段特殊的核酸序列并將其在特定位點處切開。載體是運送目的基因片段進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具，目前最常用的載體包括細(xì)菌質(zhì)粒（如pUC18）、λ噬菌體、cosmid質(zhì)粒等。基因克隆過程是通過將攜帶目的基因的重組DNA分子轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞中來完成的。實驗室內(nèi)一般常用酶切和電泳方法來檢查克隆的基因，還可以利用DNA雜交的技術(shù)直接鑒定帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌克隆。二、基因重組和克隆第五節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\12點15分幾種常用的限制性內(nèi)切酶第五節(jié)返回本文檔共71頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期三\12點15分返回EcoRI是最早被發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切酶。第五節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期三\12點15分1．該質(zhì)粒比較小，可以插入一段較長的DNA片段。2．進(jìn)入宿主細(xì)菌細(xì)胞后，pUC18在每個細(xì)胞中可復(fù)制形成約500個拷貝。3．在pUC18中有一小段人為設(shè)計和插入的具有多種限制性酶切位點的序列，即多克隆位點。4．pUC18中有一個lacZ基因，多克隆位點區(qū)就位于lacZ基因之中。插入了外源DNA片段的pUC18進(jìn)入宿主細(xì)菌后，在含有X-gal底物的培養(yǎng)基上形成白色菌落，而不是藍(lán)色菌落；。5．pUC18還攜帶了氨卞青霉素抗性基因，便于篩選。返回實用質(zhì)粒載體pUC118：第五節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期三\12點15分返回將目的基因克隆到大腸桿菌細(xì)胞中的操作步驟。第五節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期三\12點15分返回用于分離、純化和鑒定DNA片段凝膠電泳技術(shù)。第五節(jié)本文檔共71頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期三\12點15分返回利用DNA雜交技術(shù)直接鑒定攜帶克隆基因的菌落。第