食品微生物（下）

食品微生物（下）徐喜林主編第七章微生物的遺傳變異和育種第一節(jié)微生物的遺傳和變異一、遺傳和變異1.遺傳(heredity)

生物的上一代將自己的遺傳因子傳遞給下一代的行為或功能。特點(diǎn)：具有極其穩(wěn)定的特性。2.變異（Variation）是生物體在某種外因或內(nèi)因作用下引起的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，亦即遺傳型的改變。特點(diǎn)：幾率極低(一般為10-5—10-6)；性狀變化幅度大；變化后的新性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。二、遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)1.肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

1928年英國(guó)的細(xì)菌學(xué)家格里菲斯(Griffith)首先發(fā)現(xiàn)肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。肺炎雙球菌是一種病原菌，存在著兩種不同類(lèi)型：光滑型(Smooth簡(jiǎn)稱S型)和粗糙型(Rough簡(jiǎn)稱R型)。光滑型肺炎雙球菌的菌體有莢膜，菌落光滑，當(dāng)侵染人或動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，能使其患病死亡；粗糙型肺炎雙球菌菌體無(wú)莢膜，菌落粗糙，不會(huì)使人和動(dòng)物致病。

格里菲斯以R型和S型作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)。格里菲斯首先將R型肺炎雙球菌注入小白鼠體內(nèi)，小白鼠安然無(wú)恙；將S型注入時(shí)，小白鼠患病死亡。將S型菌在60℃溫度下加熱殺死后注入小白鼠體內(nèi)，小白鼠不患病。但將加熱殺死的S型菌和R型活菌混合注入時(shí)，小白鼠出乎意料地患病死亡，并從小白鼠體內(nèi)分離出活的S型菌。格里菲斯稱這一現(xiàn)象為轉(zhuǎn)化作用。

在混合注入時(shí)，S型菌已被加熱殺死，當(dāng)然不能死而復(fù)生。因此，在小白鼠體內(nèi)分離到的活的S型菌只能是R型菌的變異菌株，而這又是在S型菌的被稱為轉(zhuǎn)化因子的物質(zhì)作用下發(fā)生的。至于轉(zhuǎn)化因子是什么物質(zhì)，格里菲斯對(duì)此并未作出回答。1944年美國(guó)的埃弗雷(O.Avery)、麥克利奧特(C.Macleod)及麥克卡蒂(M.Mccarty)等人在格里菲斯工作的基礎(chǔ)上，首先將組成S型肺炎雙球菌的各類(lèi)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分離提純，獲得了純度很高的糖類(lèi)、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、核酸等。然后把這些化學(xué)物質(zhì)逐個(gè)和R型肺炎雙球菌混合，在動(dòng)物體外進(jìn)行培養(yǎng)，觀察是哪種物質(zhì)能引起轉(zhuǎn)化作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有DNA能起這種作用，這就證明了在生物體內(nèi)決定遺傳的物質(zhì)是DNA。2.噬菌體感染試驗(yàn)

1952年A.Hershey和M.Chase利用示蹤元素，對(duì)大腸桿菌T2噬菌體進(jìn)行了這類(lèi)實(shí)驗(yàn)。T2噬菌體由蛋白質(zhì)和核酸組成，這樣噬菌體中的硫元素只能在蛋白質(zhì)中存在，而磷元素只在核酸中存在。A.Hershey等人首先用含有35S和32P兩種元素的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，然后讓T2噬菌體侵染培養(yǎng)后的大腸桿菌，從而使T2噬菌體打上35S和32P的標(biāo)記。

接著又讓這種T2噬菌體侵染不含標(biāo)記元素的大腸桿菌，并在T2噬菌體完成了吸附和侵入后而未復(fù)制前，在組織攪碎器中強(qiáng)烈攪拌，以便使吸附在菌體外表的T2噬菌體蛋白質(zhì)外殼脫離細(xì)胞并均勻分布，再進(jìn)行離心沉淀，分別測(cè)定沉淀物和上清液中的同位素標(biāo)記。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾乎全部35S都在上清液中，而幾乎全部

32P和細(xì)菌一起出現(xiàn)在沉淀物中。這說(shuō)明T2噬菌體蛋白質(zhì)外殼沒(méi)有進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞(通過(guò)電鏡證實(shí)了這點(diǎn))，而是由于攪拌從細(xì)菌表現(xiàn)脫落下來(lái)，質(zhì)量較輕，在離心時(shí)不被沉淀而在上清液中。而T2噬菌體的DNA進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，由于質(zhì)量較重，在離心時(shí)被沉淀下來(lái)。3.煙草花葉病毒的拆開(kāi)與重組試驗(yàn)

1965年，美國(guó)的法朗克—康勒特（II.FraenkelConrat）將煙草花葉病毒拆成RNA（該病毒不含DNA）和蛋白質(zhì)，并分別對(duì)煙草進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有RNA能感染煙草，并在感染后的寄主中分離到完整的具有蛋白質(zhì)外殼的煙草花葉病毒。

后來(lái)他又將甲、乙兩種變種的煙草花葉病毒拆開(kāi)，在體外分別將甲病毒的RNA和乙病毒的蛋白質(zhì)結(jié)合，將乙病毒的RNA和甲病毒的蛋白質(zhì)結(jié)合進(jìn)行重組。接著他把這些經(jīng)過(guò)重組的病毒分別感染煙草。結(jié)果從寄主分離所得的病毒蛋白質(zhì)均取決于相應(yīng)病毒的RNA。證明了核酸（RNA）是煙草花葉病毒的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。

第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變1.基因突變的概念

基因突變是指DNA（或RNA）中的核苷酸順序突然發(fā)生穩(wěn)定的可遺傳的變化。它包括堿基對(duì)置換、移碼突變和染色體畸變?nèi)N情況。堿基對(duì)置換和移碼突變是由于DNA鏈上的一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿基發(fā)生改變而引起的，所以又稱點(diǎn)突變；而染色體畸變則是指DNA鏈上的一段變化和損傷現(xiàn)象，表現(xiàn)為染色體結(jié)構(gòu)的插入、缺失、重復(fù)、易位、倒位及其數(shù)量的變化。微生物的基因突變?nèi)菀装l(fā)生，所以很重要。2.基因突變的類(lèi)型（1）形態(tài)突變指細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或引起菌落形態(tài)改變的哪些突變類(lèi)型。例如細(xì)菌的鞭毛、芽孢或莢膜的有無(wú)，菌落的大小，外形的光滑、粗糙及顏色的變異；放線菌或真菌產(chǎn)孢子的多少，外形及顏色的變異等。（2）致死突變型指由于基因突變而造成個(gè)體死亡的突變類(lèi)型。（3）條件致死突變型是指在某一條件呈現(xiàn)致死效應(yīng)而另一條件下卻不表現(xiàn)致死效應(yīng)的突變型。如溫度敏感突變型。（4）營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變型是一類(lèi)重要的生化突變型。是指某種微生物經(jīng)基因突變而引起微生物代謝過(guò)程中某些酶合成能力的喪失的突變型，它們必須在原有培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分才能正常生長(zhǎng)繁殖。這種突變型在科研和生產(chǎn)中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。（5）抗性突變型是指一類(lèi)能能抵抗有害理化因素的突變型。根據(jù)其抵抗的對(duì)象分抗藥性、抗紫外線、抗噬菌體等突變類(lèi)型。這些突變類(lèi)型在遺傳學(xué)基本理論的研究中非常有用，常用作選擇性標(biāo)記菌種。（6）抗原突變型是指細(xì)胞成分，特別是細(xì)胞表面成分如細(xì)胞壁、莢膜、鞭毛的細(xì)致變異而引起抗原性變化的突變型。（7）其它突變型如毒力、糖發(fā)酵能力、代謝產(chǎn)物的種類(lèi)和數(shù)量以及對(duì)某種藥物的依賴性等的突變型。3.基因突變的特點(diǎn)（1）結(jié)果與原因之間的不對(duì)應(yīng)性即突變后表現(xiàn)的性狀與引起突變的原因之間無(wú)直接對(duì)應(yīng)關(guān)系。例如抗青霉素突變體并非由于接觸青霉素而引起，抗紫外線突變體也不是由紫外線所引起。（2）自發(fā)性各種性狀的突變，可以在沒(méi)有人為誘發(fā)因素處理下自發(fā)地發(fā)生。

（3）稀有性自發(fā)突變雖然可以隨時(shí)發(fā)生，但是突變的頻率是極低的；一般在10-6～10-9之間。（4）獨(dú)立性在一個(gè)群體中，各種性狀都可以發(fā)生突變，但彼此之間獨(dú)立進(jìn)行。（5）誘變性通過(guò)誘發(fā)因素的作用，可以提高突變率，一般可提高10～106倍。（6）穩(wěn)定性由于基因突變而產(chǎn)生的新性狀的改變是穩(wěn)定的，可以遺傳。（7）可逆性從原始的野生型基因變異成突變型基因，稱正向突變；相反，突變型基因也可以同樣的頻率恢復(fù)到原來(lái)的野生型基因，稱恢復(fù)突變。實(shí)驗(yàn)證明任何突變既有可能正向突變，也可發(fā)生恢復(fù)突變，二者發(fā)生的頻率基本相同。4.基因突變的機(jī)制（1）誘發(fā)基質(zhì)*堿基對(duì)的置換在DNA分子上，堿基對(duì)待置換屬于一種微小的損傷，它只涉及一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換。堿基對(duì)的置換可分成兩類(lèi)：一類(lèi)是DNA鏈上的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤或一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶所置換，成為轉(zhuǎn)換；另一類(lèi)是DNA鏈上的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘧啶或一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘌呤所置換，成為顛換。

這類(lèi)誘變劑的種類(lèi)很多，常用的主要有亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（如硫酸二乙酯、甲基黃酸乙酯、N—甲基—N—硝基—N—亞硝基胍、N—甲基—N—亞硝基脲、乙烯酰氨、環(huán)氧乙酸、氮芥）以及堿基類(lèi)似物等。*移碼突變這是指由一種誘變劑引起DNA分子中一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基插入或缺失，從而使該部位后面全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤的一類(lèi)突變，與染色體畸變相比，移碼突變也屬于DNA分子中的微小損傷。

吖啶類(lèi)染料及其化合物是移碼突變的有效誘變劑，例如吖啶、啶黃、啶橙，5-氨基吖啶。吖啶類(lèi)化合物的誘變機(jī)制目前還不很清楚?，F(xiàn)普遍認(rèn)為，由于吖啶類(lèi)化合物是一種平面型三環(huán)分子，結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤—嘧啶堿基對(duì)相似，因此能夠嵌入兩個(gè)相鄰的DNA堿基對(duì)之間，造成雙螺旋的部分解開(kāi)，從而在復(fù)制過(guò)程中，會(huì)使鏈上插入或缺失一個(gè)堿基，結(jié)果引起移碼突變。*染色體畸變是指由誘變劑引起DNA分子的大損傷，它包括染色體結(jié)構(gòu)上的缺失、重復(fù)、易位及倒位等。紫外線、X射線、γ射線等射線、亞硝酸及烷化劑等均能引起染色體畸變，尤其是紫外線引起DNA分子多處較大的損傷。如DNA鏈的斷裂，DNA分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用以及嘧啶二聚體的形成等。

（2）自發(fā)突變機(jī)制*背景輻射和環(huán)境中多因素低劑量的誘變效應(yīng)不少自發(fā)突變實(shí)質(zhì)上是由于一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素長(zhǎng)期作用的綜合效應(yīng)。例如充滿宇宙空間的各種短波輻射，高溫誘變效應(yīng)以及自然界中普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)的作用等。*微生物自身代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)過(guò)氧化氫是微生物正常代謝的一種產(chǎn)物，但它對(duì)脈孢菌具有誘發(fā)作用，如果同時(shí)加入過(guò)氧化氫酶抑制劑，則可大大提高誘變的效率。這說(shuō)明過(guò)氧化氫有可能是引起自發(fā)突變的一種內(nèi)源誘變劑。*互變異構(gòu)效應(yīng)因?yàn)镈NA分子中的四種堿基A、T、G、C的第六位碳原子上不是酮基（T、G）就是氨基（A、C），所以有人認(rèn)為T(mén)和G會(huì)以酮式和烯醇式兩種互變異構(gòu)的形式出現(xiàn)，而A和C則可以氨基式或亞氨基式兩種狀態(tài)出現(xiàn)。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的平衡一般趨向于酮式和亞氨基式，因此，在DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中一般總是以A:T與G:C堿基配對(duì)的形式出現(xiàn)。可是在偶然情況下，T也會(huì)以烯醇式形式出現(xiàn)，恰好DNA的復(fù)制達(dá)到這一點(diǎn)時(shí)，在它相對(duì)應(yīng)的位置上出現(xiàn)配對(duì)堿基G，而不出現(xiàn)常規(guī)的A。

當(dāng)DNA再次復(fù)制時(shí)，通過(guò)G和C配對(duì)，就使原來(lái)的A:T轉(zhuǎn)變?yōu)镚:C。同樣如果C以亞氨基形式出現(xiàn)，在DNA復(fù)制達(dá)到這一點(diǎn)時(shí)，DNA對(duì)應(yīng)鏈上將是A，而不是G。這可能是引起自發(fā)突變的重要原因之一。*環(huán)狀突變效應(yīng)如果在DNA大分子上有回文結(jié)構(gòu)區(qū)段，在雙鏈解開(kāi)時(shí)，容易出現(xiàn)發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)，在復(fù)制過(guò)程中，有時(shí)越過(guò)這一區(qū)段而發(fā)生丟失，從而引起所謂自發(fā)突變。二、微生物的誘變育種1.基本概念誘變育種是利用物理或化學(xué)誘變處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，促進(jìn)其突變率大幅度提高，然后采取簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變體，以供生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)實(shí)驗(yàn)之用。

2.意義誘變育種具有及其重要的意義，當(dāng)今發(fā)酵工業(yè)所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過(guò)誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能的。例如青霉素，1943年開(kāi)始生產(chǎn)時(shí)，發(fā)酵的效價(jià)只有20單位/毫升，通過(guò)誘變育種及其它措施的配合，到1977年已達(dá)50000單位/毫升，比原來(lái)提高2～3千倍。

誘變育種不僅能提高菌種的生產(chǎn)性能而增加產(chǎn)品的產(chǎn)量，而且還可以達(dá)到改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝等目的。從方法上講。它具有方法簡(jiǎn)便、工作速度快和效果顯著等優(yōu)點(diǎn)。因此，雖然目前在育種方法上，雜交、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)以及基因工程、原生質(zhì)體融合等方面都在快速的研究發(fā)展，但誘變育種仍為目前最主要、最廣泛使用的育種手段。3.誘變育種的思路確定出發(fā)菌株↓菌種的純化選優(yōu)↓←出發(fā)菌株的性能測(cè)定同步培養(yǎng)↓制備單細(xì)胞（或單孢子）懸液↓←活菌濃度測(cè)定誘變劑的選擇與劑量確定的預(yù)試驗(yàn)↓誘變處理↓平板分離↓計(jì)形態(tài)變異的菌落，計(jì)算突變率挑取疑似突變菌落純培養(yǎng)↓突變體的初步篩選↓←用簡(jiǎn)單快捷的方法重復(fù)篩選↓←搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)選出突變體（根據(jù)情況進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn)或重復(fù)誘變處理）第三節(jié)基因重組與雜交一、基因重組和雜交的基本概念1.基因重組基因重組又稱為遺傳重組，它是把不同性狀個(gè)體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過(guò)遺傳分子的重新組合后，形成新遺傳個(gè)體的過(guò)程?；蛑亟M時(shí)，不發(fā)生任何堿基對(duì)結(jié)構(gòu)上的變化；重組后生物體新的遺傳性狀出現(xiàn)完全是基因重組的結(jié)果。2.雜交不同的性細(xì)胞之間結(jié)合，并隨之發(fā)生染色體的重組，從而產(chǎn)生新的遺傳型后代的現(xiàn)象。重組是分子水平上的概念，是遺傳分子水平上的雜交，而雜交是細(xì)胞水平上的概念。雜交必然包含著基因重組，而基因重組不僅局限于通過(guò)雜交一種形式完成。二、原核生物的基因重組1.轉(zhuǎn)化（Transformation）（1）概念

轉(zhuǎn)化是受體菌直接吸收來(lái)自供體菌的DNA片段，整合到自己的基因組中去，并表達(dá)供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象。許多細(xì)菌如芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、奈瑟氏球菌屬和嗜血菌屬(嗜血桿菌屬Haemophilus)能夠自然發(fā)生轉(zhuǎn)化作用。

轉(zhuǎn)化過(guò)程示意圖（2）感受態(tài)(compentence)細(xì)胞吸收DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化的能力取決于細(xì)胞所處的特殊生理狀態(tài)，即細(xì)菌細(xì)胞的感受態(tài)。感受態(tài)與細(xì)胞表面存在DNA的受體有關(guān)。如大腸桿菌，在冷的條件下通過(guò)化學(xué)方法處理，可以誘導(dǎo)建立感受態(tài)。2.轉(zhuǎn)導(dǎo)

通過(guò)缺陷型噬菌體或溫和型噬菌體為媒介，將供體細(xì)胞中DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，從而使受體菌獲得供體菌的某些遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。（1）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)由缺陷型噬菌體誤包（而非整合）供體菌DNA中的任何一部分片段（包括核外遺傳物質(zhì)在內(nèi)）后，當(dāng)再次感染受體細(xì)菌時(shí)，使后者獲得了這部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。

普遍性專(zhuān)導(dǎo)（2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)由溫和型噬菌體侵染而形成的某一溶源細(xì)菌被誘導(dǎo)裂解時(shí)，其中極少數(shù)個(gè)體的DNA可能與噬菌體的DNA發(fā)生若干特定基因的交換，從而被整合到噬菌體的基因組上，當(dāng)該噬菌體再次感染受體菌時(shí)，就使受體菌獲得了這一特定遺傳性狀的現(xiàn)象，當(dāng)成為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。

通常當(dāng)一個(gè)噬菌體被誘導(dǎo)后，以非常精確的方式從染色體上切離形成一個(gè)完全的噬菌體基因組。極少數(shù)的原噬菌體發(fā)生不精確的切離(誤切)，鄰近噬菌體位點(diǎn)上的一小段供體菌染色體被切離，而一小段噬菌體的DNA遺留在供體菌染色體上。含有這段染色體DNA的噬菌體顆粒，將會(huì)感染受體細(xì)胞，整個(gè)噬菌體DNA可整合在受體菌染色體上形成溶源化，或通過(guò)重組作用與受體菌染色體DNA整合。galbiogalbiogalbiogalbiobiogal局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)3.接合（conjugation）

通過(guò)供體細(xì)菌和受體細(xì)菌細(xì)胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的過(guò)程，稱為接合（有時(shí)也稱原核生物的雜交）。在細(xì)菌中，接合現(xiàn)象研究最清楚的是大腸桿菌。根據(jù)對(duì)接合現(xiàn)象的研究，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的接合與其細(xì)菌表面的性纖毛有關(guān)。不久又發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有雄性和雌性之分，而決定它們性別的是有是否存在F因子所決定。

接合是同通過(guò)質(zhì)粒使遺傳物質(zhì)在兩個(gè)細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的機(jī)制。一個(gè)含有接合質(zhì)粒(F+，致育性)的細(xì)胞與不含有接合質(zhì)粒(F-)的細(xì)胞借助于細(xì)胞表面的F-性菌毛形成交配個(gè)體。性菌毛收縮，拉兩個(gè)細(xì)胞接觸，從含有質(zhì)粒的細(xì)胞(供體)DNA轉(zhuǎn)移到受體。

轉(zhuǎn)移的起始點(diǎn)在質(zhì)粒DNA一條鏈的一個(gè)缺口位點(diǎn)上，DNA以單鏈形式轉(zhuǎn)移，通過(guò)滾環(huán)模型形式復(fù)制。完整鏈作為DNA合成的模板，而缺口鏈被替代和轉(zhuǎn)移進(jìn)人受體細(xì)胞。一旦受體細(xì)胞中互補(bǔ)的DNA鏈合成，形成新的F因子。ElectronMicrographofEscherichiacoliwithaConjugationPilus

臍狀雌性細(xì)菌不含F(xiàn)因子，稱為F—菌株，雄性含有F因子，并且根據(jù)F因子在細(xì)胞中存在情況的不同而有不同名稱，在有些雄性細(xì)胞中含有游離的F因子，稱為F+菌株，另一些細(xì)胞中含的F因子被整合在細(xì)胞核的DNA上，不成游離狀態(tài)存在，稱為Hfr菌株，即高頻重組菌株。還有F因子能被整合到細(xì)胞核DNA上，也能從上面脫落下來(lái)，呈游離存在，但在脫落時(shí)，F(xiàn)因子有時(shí)能帶一小段細(xì)胞核DNA。我們將這種含有游離存在的但又帶有一小段細(xì)胞核DNA的F因子的細(xì)菌稱為F'菌株。F+菌株接合的結(jié)果是產(chǎn)生二個(gè)F+菌株

F+F-F+F-F+F+F+F+F‘菌株與F-菌株接合的結(jié)果是產(chǎn)生二個(gè)F’菌株。接合過(guò)程同F(xiàn)+與F-菌株的接合過(guò)程。Hfr菌株與F-菌株接合的情況較為復(fù)雜，接合的結(jié)果也不完全一樣。Hfr菌株常常只能將部分的細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)移給F-菌株，這是由于接合容易中斷而F因子總是最后從供體細(xì)胞進(jìn)入受體細(xì)胞的原故。由于Hfr菌株與F-菌株發(fā)生接合時(shí)，Hfr染色體在F因子處發(fā)生斷裂，由環(huán)狀變成線狀。又由于斷裂發(fā)生在F因子處，所以必然要等Hfr的整條染色體全部轉(zhuǎn)移完后，F(xiàn)因子才能進(jìn)入到F-細(xì)胞，可是事實(shí)上由于種種原因，這種線狀染色體在轉(zhuǎn)移過(guò)程中常常發(fā)生斷裂，因此Hfr菌株的許多基因雖然可以進(jìn)入F-菌株，越是前端的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)越多，在F-菌株中出現(xiàn)重組子的時(shí)間就越早，頻率也高。而F因子由于位于末端，故進(jìn)入F-菌株的機(jī)會(huì)最少，引起性別變化的可能性最小。這樣Hfr與F-菌株接合的結(jié)果重組頻率雖高，但卻很少出現(xiàn)F+菌株?？傊?，通過(guò)Hfr與F-菌株的接合，在大多數(shù)情況下，受體細(xì)菌仍是F-菌株，只有在極少數(shù)情況下，由于遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的完整，受體細(xì)胞才能成為Hfr菌株。4.溶源性轉(zhuǎn)變這是一種與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似但又有本質(zhì)不同的現(xiàn)象。溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)在本質(zhì)上的不同，首先是它的溫和型噬菌體不攜帶任何供體菌的基因，其次是這種噬菌體是正常的完整的，而不是異常情況下產(chǎn)生的缺陷型噬菌體。

溶源轉(zhuǎn)變的典型例子是不產(chǎn)毒素的白喉棒狀桿菌（lorynebactceriumdip—hthariac）菌株被噬菌體侵染而發(fā)生溶源化時(shí)，會(huì)變成產(chǎn)毒素的致病菌株。其他如沙門(mén)氏菌、紅霉菌、鏈霉菌等也具有溶源轉(zhuǎn)變的能力。三、真核生物的基因重組1.有性雜交在微生物的有性繁殖過(guò)程中，不同的性細(xì)胞間的結(jié)合，并隨之發(fā)生染色體的重組。從而產(chǎn)生新遺傳型后代的現(xiàn)象，稱有性雜交。凡是能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能進(jìn)行有性雜交。微生物的兩個(gè)性細(xì)胞相互聯(lián)結(jié)，通過(guò)質(zhì)配、核配后形成雙倍體的合子，合子進(jìn)行減數(shù)分裂時(shí)，部分染色體可能發(fā)生交換而進(jìn)行重組，由此而產(chǎn)生重組染色體并把遺傳性狀按一定的規(guī)律性傳給后代。

有性雜交在生產(chǎn)實(shí)踐中被廣泛用于優(yōu)良品種的培育。例如用于酒精發(fā)酵的酵母菌和用于面包發(fā)酵的酵母菌是同屬一種啤酒酵母的兩個(gè)不同菌株，面包酵母的特點(diǎn)是對(duì)麥芽糖及葡萄糖的發(fā)酵能力強(qiáng)，產(chǎn)生CO2多，生長(zhǎng)快；而酒精酵母是產(chǎn)酒率高而對(duì)麥芽糖、葡萄糖的發(fā)酵能力弱，所以釀酒廠生產(chǎn)酒精后的酵母，不能供面包廠作引子用。通過(guò)兩者的雜交，就得到了既能生產(chǎn)酒精，又能將菌體用作面包廠和家用發(fā)酵酵母的優(yōu)良菌種。2.準(zhǔn)性生殖準(zhǔn)性生殖是一種類(lèi)似于有性生殖但比它更原始的一種生殖方式。它可使同一種生物的兩個(gè)不同來(lái)源的體細(xì)胞經(jīng)融合后，不通過(guò)減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率的基因重組。準(zhǔn)性生殖多見(jiàn)于一般不具典型有性生殖的酵母和霉菌，尤其是半知菌中。（1）菌絲聯(lián)結(jié)發(fā)生在一些形態(tài)上沒(méi)有區(qū)別的，但在遺傳性狀上可以有差別的兩個(gè)同種親本的體細(xì)胞（單倍體）間。發(fā)生聯(lián)結(jié)的頻率很低。（2）形成異核體兩個(gè)單倍體細(xì)胞經(jīng)聯(lián)結(jié)后，使原有的兩個(gè)單倍體核集中到同一個(gè)細(xì)胞中，形成雙向的異核體。異核體能獨(dú)立生活。（3）核融合在異核體中的雙核融合，產(chǎn)生雙倍體雜合子核。核融合后產(chǎn)生雜合子核的頻率也是極低的，如構(gòu)巢曲霉和米曲霉為10-5～10-7.（4）體細(xì)胞重組和單倍體化雙倍體的雜合子極不穩(wěn)定，在進(jìn)行有絲分裂過(guò)程中，極少數(shù)的染色體會(huì)發(fā)生交換和單倍體化，從而形成了極個(gè)別的具有新遺傳性狀的單倍體雜合子。如果對(duì)雙倍體雜合子用紫外線、γ射線或用氮芥等化學(xué)誘變劑進(jìn)行處理，就會(huì)促進(jìn)染色體斷裂、畸變或?qū)е氯旧w在兩個(gè)子細(xì)胞中的分配不均，因而有可能產(chǎn)生有不同性狀組合的單倍體雜合子。準(zhǔn)性生殖對(duì)一些沒(méi)有有性繁殖過(guò)程但有重要生產(chǎn)價(jià)值的半知菌及其它微生物的育種，提供了重要的手段。準(zhǔn)性生殖3.微生物雜交育種（講稿）（1）酵母雜交育種（2）霉菌雜交育種4.原生質(zhì)體融合四、遺傳工程遺傳工程思路微生物育種專(zhuān)題1營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株影印培養(yǎng)法用于篩選大量特殊突變菌落的一個(gè)方法。細(xì)菌鋪制成平板，在含所有營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上（完全培養(yǎng)基）親本和突變株均能生長(zhǎng)，采用一個(gè)稀釋度使單個(gè)菌落能在平板上看到；培養(yǎng)后，用一個(gè)無(wú)菌的絲絨布包裹的圓柱章的圓墊轉(zhuǎn)移上述菌落至可以檢出突變株的培養(yǎng)基平板上。培養(yǎng)基的性質(zhì)根據(jù)突變株的需求，在營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的情況下，可以在有特殊生長(zhǎng)因子和沒(méi)有特殊生長(zhǎng)因子的平板上影印法轉(zhuǎn)移菌落，不能合成那種生長(zhǎng)因子的突變菌株，在基本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，但能在加入已知生長(zhǎng)因子的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(加富培養(yǎng)基)，突變株菌落通過(guò)在基本培養(yǎng)基不能生長(zhǎng)來(lái)鑒別，可以從能生長(zhǎng)的加富培養(yǎng)基平板上選出和純化。微生物育種專(zhuān)題2原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體融合又稱細(xì)胞融合，這是近年來(lái)才出現(xiàn)的繼轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合之后的轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的又一重要方法。它是通過(guò)人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生帶有新遺傳性狀型重組子的過(guò)程。能夠進(jìn)行原生質(zhì)體融合的細(xì)胞不僅有原核微生物中的細(xì)菌、放線菌，而且還有真核微生物中的酵母菌、霉菌和高等動(dòng)、植物細(xì)胞。

微生物原生質(zhì)體融合的研究開(kāi)始于1976年。其一般原理和主要過(guò)程是：首選準(zhǔn)備兩個(gè)具有選擇性遺傳標(biāo)記的突變株，在高滲溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿?，例如?xì)菌可用溶菌酶，真菌可用蝸牛酶等除去細(xì)胞壁，再將形成的原生質(zhì)體離心聚集，并加入促融合劑聚乙二醇（PEG）促進(jìn)融合，然后在高滲溶液中稀釋?zhuān)坎荚谀苁蛊湓偕?xì)胞壁進(jìn)行分裂繁殖的培養(yǎng)基上，待形成菌落后，通過(guò)影印接種法將其接種到各種選擇培養(yǎng)基上，最后鑒定它們是否為重組子，圖示如下：第四節(jié)菌種的保藏

微生物菌種是一類(lèi)重要的自然資源。菌種的保藏和復(fù)壯是微生物學(xué)的一項(xiàng)重要基礎(chǔ)工作。優(yōu)良菌種被分離選育出來(lái)后，必須盡可能保持其原來(lái)性狀和生活力不變異、不死亡、不被污染。但在自然條件下，菌種的污染、死亡和生產(chǎn)性能的逐漸下降又是不可避免的。為了解決這一矛盾，就必須采取妥善的保藏和復(fù)壯方法，以便隨時(shí)供應(yīng)優(yōu)良菌種給生產(chǎn)、科研使用。

一、菌種的退化與復(fù)壯1.菌種的退化現(xiàn)象常見(jiàn)的菌種退化現(xiàn)象最易覺(jué)察到的是菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)的改變，如菌落顏色的改變,畸形細(xì)胞的出現(xiàn)等；其次是生長(zhǎng)變得緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少，例如放線菌、霉菌在斜面上多次傳代后產(chǎn)生“光禿”現(xiàn)象等，從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難，再次是菌種的代謝活動(dòng)，代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力或其對(duì)寄主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素發(fā)酵單位的減少，枯草桿菌產(chǎn)淀粉酶能力的衰退等。

所有這些都對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)不利。但是在生產(chǎn)實(shí)踐中，必須將其與培養(yǎng)條件的改變導(dǎo)致菌種形態(tài)和生理上的變異區(qū)別開(kāi)來(lái)。因?yàn)閮?yōu)良菌株的生產(chǎn)性能是和發(fā)酵工藝條件緊密相關(guān)的。如果培養(yǎng)條件起變化，如培養(yǎng)基中某些元素缺乏，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)孢子數(shù)量減少，也會(huì)引起孢子顏色的改變；溫度、pH值的變化也會(huì)使產(chǎn)量發(fā)生波動(dòng)等。所有這些，只要條件恢復(fù)正常，菌種原有性能就能恢復(fù)正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為退化。2.菌種退化的原因菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變，就會(huì)引起產(chǎn)量下降；如果控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變，則使菌種產(chǎn)孢子性能下降。特別是對(duì)某一特定基因來(lái)講，突變頻率就更低，因此不能認(rèn)為群體中個(gè)體發(fā)生生產(chǎn)性能的突變是很容易的，但就一個(gè)經(jīng)常處于旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞而言，發(fā)生突變的機(jī)率就比處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞大得多，尤其是處于一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細(xì)胞在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢(shì)，于是退化性狀的表現(xiàn)就更加明朗，最終成為一株退化了的菌體。

因此可見(jiàn)，菌種的退化是一個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程。開(kāi)始時(shí)，在群體中只有個(gè)別細(xì)胞發(fā)生負(fù)突變，這時(shí)如不及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采用有效措施而一味移種傳代，就會(huì)造成群體中負(fù)突變個(gè)體的比例逐漸增高，最后占優(yōu)勢(shì)，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)出嚴(yán)重的退化現(xiàn)象。3.防止菌種退化的措施（1）控制傳代次數(shù)即盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到最低水平，以降低自發(fā)突發(fā)的機(jī)率。眾所周知，微生物存在著自發(fā)突變，而突變都是在繁殖過(guò)程中發(fā)生而表現(xiàn)出來(lái)的。據(jù)研究證明，DNA在復(fù)制過(guò)程中堿基發(fā)生差錯(cuò)的機(jī)率低于5×10-4，一般自發(fā)突變頻率在10-8～10-9之間。從這里可看出，菌種傳代次數(shù)越多，產(chǎn)生突變的機(jī)率就越高，因而菌種發(fā)生退化的機(jī)會(huì)就越多。所以不論在實(shí)驗(yàn)室還是在生產(chǎn)實(shí)踐上，必須嚴(yán)格控制菌種的移種傳代次數(shù)。（2）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件在生產(chǎn)實(shí)踐中，創(chuàng)造和發(fā)現(xiàn)一個(gè)適合原種生長(zhǎng)的條件可以防止菌種退化。例如，有人發(fā)現(xiàn)用老苜蓿根汁培養(yǎng)基培養(yǎng)“5406”抗生菌——細(xì)黃鏈霉菌可以防止它的退化，在赤霉素產(chǎn)生菌——藤倉(cāng)赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖密、天門(mén)冬素、谷氨酰胺、5－核苷酸或甘露醇等豐富營(yíng)養(yǎng)時(shí)，也有防止菌種退化的效果，還有在棲土曲霉3.942的培養(yǎng)中，有人曾用改培養(yǎng)溫度的措施（從20～30℃提高到33～34℃）來(lái)防止它產(chǎn)孢子能力的退化。（3）利用不同類(lèi)型的細(xì)胞進(jìn)行移種傳代在放線菌和霉菌中，由于其菌的細(xì)胞常含有幾個(gè)核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會(huì)出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時(shí)，就沒(méi)有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實(shí)踐中采用滅過(guò)菌的棉團(tuán)輕巧地沾取“5406”孢子進(jìn)行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達(dá)到了防止退化的效果；還有人發(fā)現(xiàn)，構(gòu)巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改變子囊孢子移種傳代則不易退化。（4）采用有效的菌種保藏方法有發(fā)酵生產(chǎn)用的菌種中，主要性狀都屬于數(shù)量性狀，而這類(lèi)性狀恰是最容易退化的，即使在較好的保藏條件下，還是存在這種情況。因此，有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌種退化。4.退化菌種的復(fù)壯退化菌種的復(fù)壯可通過(guò)純種分離和性能測(cè)定等方法，從退化菌種的群體中找出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)菌種的原有典型性狀，這是一種消極的狹義的復(fù)壯措施；而廣義的復(fù)壯則應(yīng)是一項(xiàng)積極措施，即在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常有意識(shí)地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測(cè)定，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以這實(shí)際上是一種利用自發(fā)突變不斷從生產(chǎn)中進(jìn)行選種的工作。

二、菌種的保藏菌種保藏的方法很多，保藏的原理都大同小異，首先要挑選優(yōu)良純種，最好是采用它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等，其次要人為地創(chuàng)造一個(gè)使微生物代謝處于不活躍，生長(zhǎng)繁殖受到抑制而有利于休眠的環(huán)境條件，如干燥、低溫、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)以及添加保護(hù)劑等。一種好的保藏方法，首先應(yīng)能長(zhǎng)期保持菌種的優(yōu)良性狀和生長(zhǎng)性能不變。菌種保藏的具體方法很多，但按其主要原理可以分為以下幾類(lèi)：1.低溫保藏法主要利用低溫對(duì)微生物的生命活動(dòng)具有抑制作用的原理進(jìn)行保藏。根據(jù)所用溫度的高低可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是普通低溫保藏法，即將斜面菌種直接放入0－4℃冰箱中保藏，但是保存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般為3～6個(gè)月；另一類(lèi)是利用超低溫保藏法，用-20℃以下的超低溫冰箱或干冰、液氮（-195℃）等進(jìn)行凍結(jié)保藏效果很好。

2.干燥保藏法主要是指把菌種接種到適當(dāng)載體上，在干燥條件下進(jìn)行保藏。能夠作載體的材料很多，如土壤、細(xì)砂、硅膠、濾紙片、麩皮等，這種保藏方法主要適合于細(xì)菌的芽胞和霉菌的孢子。細(xì)菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麩皮管保藏。3.隔絕空氣保藏法利用好氣性微生物無(wú)氧不生長(zhǎng)繁殖的原理，取滅菌的液體石蠟，注入菌種斜面后，再用固體石蠟密封試管口以隔絕空氣，最后放入低溫冰箱中保藏效果很好。如果不用石蠟，可以在斜面菌種長(zhǎng)到最好時(shí)采用滅菌的橡皮塞代替原有的棉塞，塞緊試管口，放入冰箱或室溫下暗處同樣可以達(dá)到保藏菌種的目的。4.真空冷凍干燥保藏法在這類(lèi)方法中，幾乎利用了一切有利于菌種保藏的因素如低溫、缺氧、干燥等，因此是目前最好的一類(lèi)綜合性的保藏方法，保藏期長(zhǎng)，但操作過(guò)程復(fù)雜，要求一定的設(shè)備條件。其基本過(guò)程是：①培養(yǎng)菌種；②加菌種保護(hù)劑（一般食品工業(yè)用菌種多用牛乳作保護(hù)劑）；③分裝、預(yù)凍；④真空凍干；⑤真空封口。真空凍干菌種可在常溫下長(zhǎng)期保藏，也可在低溫下保藏。5.寄主保藏法適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動(dòng)植物病原菌和病毒。以上介紹了菌種保藏方法的大體類(lèi)別，實(shí)際上具體方法差不多都是綜合性的效果更好。方法原理適宜菌種保藏期冰箱保藏法（斜面）低溫各類(lèi)微生物3-6月冰箱保藏法（半固體）低溫細(xì)菌、酵母菌6-12月石蠟封管保藏法低溫、缺氧各類(lèi)微生物1-2年沙土管保藏法干燥、營(yíng)養(yǎng)貧瘠芽孢、孢子1-10年真空冷凍干燥保藏法低溫、干燥、無(wú)氧各類(lèi)微生物5-15年幾種常用的菌種保藏方法第四節(jié)酸乳酸乳是新鮮乳（牛乳、馬乳、羊乳等畜乳）經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成的乳制品。它具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，所含蛋白質(zhì)易被人體消化吸收，其中鈣比普通乳中的鈣更易于吸收。酸牛乳在胃腸內(nèi)具有抑制異常發(fā)酵的作用并能防止和治療胃腸炎的作用。緩解乳糖不耐癥。因此，它越來(lái)越受到人們的喜愛(ài)。目前，我國(guó)許多大中城市都有乳品廠生產(chǎn)酸乳。一、酸乳發(fā)酵應(yīng)用的微生物（一）普通酸乳發(fā)酵菌制作普通酸乳使用的主要菌種是保加利亞乳桿菌（德氏乳桿菌保加利亞亞種）和嗜熱鏈球菌。其發(fā)酵劑有時(shí)是單一菌株（很少），但通常是使用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌按一定比例混合的發(fā)酵劑，這樣制作的普通酸乳風(fēng)味和質(zhì)地較好。兩種菌的比例（即群落的均衡性）對(duì)酸牛乳的質(zhì)量十分重要?？梢愿鶕?jù)二菌的培養(yǎng)方式（混合培養(yǎng)還是單菌培養(yǎng)）、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、pH值以及對(duì)牛乳的加熱強(qiáng)度等來(lái)確定其比例。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生化特性

果糖乳糖葡萄糖甘露糖蔗糖德氏乳桿菌保加利亞亞種+++——嗜熱鏈球菌+++—+

培養(yǎng)方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)

混合培養(yǎng)1.兩種菌的配伍性（可混合性易于判斷。）2.可簡(jiǎn)化操作，并可獲得兩種菌的共生傾向。由于兩種菌對(duì)培養(yǎng)條件有不同要求，可能產(chǎn)生不均衡現(xiàn)象。單獨(dú)培養(yǎng)1.可調(diào)節(jié)二者的不均衡性。2.發(fā)現(xiàn)二者之一有退化現(xiàn)象時(shí)可及時(shí)除去，更新菌種。

兩種乳酸菌混合培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)的比較正常酸乳的革蘭氏染色（二）嗜酸菌乳發(fā)酵微生物

嗜酸乳桿菌可在人的腸道內(nèi)定植生長(zhǎng)，能抑制腸道病原菌生長(zhǎng)，是真正的益生菌，因而嗜酸菌乳可作為療效飲料使用。嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)需要一定的維生素等生長(zhǎng)因子，在原料乳及制作發(fā)酵劑的脫脂乳中，需要添加5%的番茄汁或胡蘿卜汁。嗜酸乳桿菌最適生長(zhǎng)溫度為37℃，菌種的培養(yǎng)及發(fā)酵都需要在37℃的溫度下進(jìn)行。（三）雙歧桿菌以雙歧桿菌為代表的腸道有益菌群，對(duì)機(jī)體的保健作用早已為世人所注目，可概括為（1）能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)致病菌的抵抗能力；（2）能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高抗感染能力；（3）能控制血液中的內(nèi)毒素，預(yù)防和治療肝腎疾病；（4）能阻止腸道內(nèi)致癌物質(zhì)的生成，預(yù)防和抑制癌變的發(fā)生；（5）可預(yù)防和治療老年心血管疾病；（6）能提供多種維生素和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

很早以前就有人根據(jù)該菌能在腸道內(nèi)繁殖的特點(diǎn)，設(shè)想將其添加到食品中，帶入腸道，使該菌在腸道中成為優(yōu)勢(shì)菌種，以達(dá)到利于人體健康的目的。日本于50年代對(duì)該菌進(jìn)行研究，70年代初解決了雙歧桿菌培養(yǎng)的一系列問(wèn)題，80年代后，則出現(xiàn)了雙歧桿菌的研究熱。美國(guó)的Biogarde公司和布拉格乳品研究所等也對(duì)該菌有過(guò)深入的研究。有人認(rèn)為，雙歧桿菌發(fā)酵制品將成為21世紀(jì)新一代的發(fā)酵乳制品。目前，國(guó)外市場(chǎng)上已有一些雙歧桿菌屬的發(fā)酵制品，如德國(guó)的雙歧桿菌酸奶、丹麥的AB—酸奶、捷克的Biokys和日本的Miru-Miru等。我國(guó)在這方面起步較晚，市場(chǎng)上這類(lèi)產(chǎn)品較少，還有待于進(jìn)一步的研究與開(kāi)發(fā)。乳酸菌的定義(1)細(xì)胞為革蘭氏陽(yáng)性;(2)細(xì)胞形態(tài)為桿菌或球菌;(3)過(guò)氧化氫酶為陰性;(4)消耗的葡萄糖50%以上產(chǎn)生乳酸;(5)不形成芽孢;(6)無(wú)運(yùn)動(dòng)性,或僅少。雙歧桿菌在過(guò)去是歸于乳酸菌之中,現(xiàn)在則不屬于乳酸菌而是單獨(dú)另辟雙歧桿菌屬,其中的一個(gè)原因是所產(chǎn)生的乳酸不足50%。二、酸乳生產(chǎn)工藝（一）普通酸乳

合格的鮮乳→熱處理→均質(zhì)→加糖→加發(fā)酵劑（44～45℃時(shí)）→裝瓶→發(fā)酵43℃（4-5小時(shí)）→冷卻→貯藏（后熟）（5℃）普通酸乳加工中，還可以加入一定量的蔗糖、水果香精、果汁、咖啡、可可等，得到不同風(fēng)味的酸乳制品。

（二）嗜酸菌乳原料乳→熱處理（100℃，1h）→冷卻至37℃→接種（1～2%發(fā)酵劑）→發(fā)酵（37℃）→冷卻→攪拌→裝瓶→貯存（5～20℃）（三）雙歧桿菌酸乳雙歧桿菌酸奶的生產(chǎn)工藝有兩種，即混合發(fā)酵法和雙歧桿菌單獨(dú)發(fā)酵法?；旌习l(fā)酵法工藝流程如下：原料乳→調(diào)配→均質(zhì)→殺菌（90℃，30min）→冷卻（40～42℃）→接種→裝罐→發(fā)酵（36～39℃，6小時(shí)）→冷卻（10℃）→冷藏（4～10℃）→成品

單獨(dú)發(fā)酵工藝是將雙歧桿菌發(fā)酵菌種與酸奶發(fā)酵菌種分別接種于兩個(gè)發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，兩者發(fā)酵后按1:1的比例混合裝罐，移入冷庫(kù)中冷藏即可。另外，為確保酸乳中雙歧桿菌的活菌數(shù)保持在一定的水平，這類(lèi)產(chǎn)品最好在7天內(nèi)銷(xiāo)售。注：活乳酸菌產(chǎn)品主要類(lèi)型1.傳統(tǒng)酸凝乳2.攪拌型酸乳3.酸乳飲料4.其它酸乳制品注意與乳酸飲料類(lèi)產(chǎn)品區(qū)分第五節(jié)發(fā)酵蔬菜發(fā)酵蔬菜是指各種蔬菜經(jīng)微生物（主要是植物乳桿菌等）發(fā)酵而成的產(chǎn)品，常叫做泡菜或酸菜等。一、發(fā)酵蔬菜中的微生物蔬菜發(fā)酵主要是乳酸發(fā)酵，將原料中的糖分（主要是單糖、雙糖甚至五碳糖）分解成乳酸及其它物質(zhì)的過(guò)程。參與這一復(fù)雜過(guò)程的微生物主要是蔬菜表面天然存在的植物乳桿菌（Lacfobacillusplamfarum），另外還有腸膜明串珠菌、小片球菌、短乳桿菌、大腸桿菌等。乳酸菌分布極廣，在空氣中及原料的表面均有大量存在。蔬菜原料入壇后，乳酸發(fā)酵便開(kāi)始進(jìn)行。根據(jù)壇內(nèi)各種微生物的活動(dòng)情況和生成乳酸量的多少，泡菜的發(fā)酵過(guò)程大致可分為三個(gè)階段。初期發(fā)酵新鮮原料浸泡入鹽水后，食鹽使蔬菜中的水分不斷向外滲出，原料中的可溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如糖分就會(huì)擴(kuò)散到鹽水中，同時(shí)食鹽也自然會(huì)擴(kuò)散進(jìn)入植物組織內(nèi)部。這樣，使泡菜鹽水的濃度降低到2～4%，變成含有糖分的低濃度鹽水。這時(shí)抗鹽性強(qiáng)和抗鹽性弱的微生物幾乎都能活動(dòng)。其中除了真正的乳酸菌之外，還有酵母和大腸桿菌等，而且初期占優(yōu)勢(shì)的是大腸桿菌。大腸桿菌能將糖分發(fā)酵分解成乳酸、醋酸、琥珀酸、乙醇、二氧化碳和氫等。因此初期會(huì)有大量的氣體不斷由壇內(nèi)經(jīng)水槽逸出。當(dāng)然這些氣體中部分是蔬菜細(xì)胞間隙的空氣因鹽水浸泡后排出，也有少量是由于蔬菜組織細(xì)胞短暫的無(wú)氧呼吸產(chǎn)生的。初期生成的乳酸量不高，大致在0.3～0.4%之間。中期發(fā)酵經(jīng)過(guò)初期發(fā)酵，乳酸積累達(dá)到0.3%以上時(shí)，大腸桿菌對(duì)酸性物質(zhì)最為敏感，不能適應(yīng)這種酸性環(huán)境。而正型乳酸菌則逐漸成為為優(yōu)勢(shì)菌群，它們能將糖分分解成乳酸但不產(chǎn)生氣體，因此中期氣體產(chǎn)量大為減少。中期所生成的乳酸量約在0.4～0.8%之間，抗酸性較弱的微生物，在此階段無(wú)法活動(dòng)甚至死亡。由此可見(jiàn)，在其發(fā)酵期間，諸如大腸桿菌、腐敗細(xì)菌及丁酸菌等均不能生存，而乳酸菌和酵母可以活動(dòng)，霉菌盡管抗酸性強(qiáng)，但由于壇內(nèi)缺乏氧氣也無(wú)法活動(dòng)。

末期發(fā)酵泡菜的酸化過(guò)程繼續(xù)發(fā)展，在此期間只有抗酸性特別強(qiáng)的乳酸菌才能繼續(xù)活動(dòng)，乳酸的積累量達(dá)到1%以上。但乳酸含量一旦達(dá)到1.2%以上時(shí)，所有的乳酸菌也會(huì)逐漸不能適應(yīng)，最后也停止了活動(dòng)。泡菜中期發(fā)酵階段品質(zhì)最好，具有最佳風(fēng)味，此時(shí)乳酸含量大致在0.6%左右。此時(shí)維生素C的保持率也較高。如果乳酸含量超過(guò)1%，泡菜便失去了它本身的特點(diǎn)，成為純粹的“酸菜”了。二、制作工藝（一）選料凡是組織較致密、質(zhì)地脆嫩、肉質(zhì)肥厚而不易軟化的新鮮蔬菜均可作為泡菜的原料。例如：黃瓜、嫩豇豆、嫩姜、甘藍(lán)、菊芋及大蒜頭等這些優(yōu)質(zhì)原料腌制的泡菜比較耐貯存；蘿卜、胡蘿卜、青菜頭、青辣椒等也都可作為泡菜制品的原料。（二）加工處理新鮮原料經(jīng)過(guò)充分清洗后，應(yīng)先進(jìn)行整理，凡不適用的部分均應(yīng)一一剔除干凈，如粗皮、粗筋、須根、老葉以及表皮上的黑色斑點(diǎn)等。對(duì)于個(gè)體較小的蔬菜原料可不進(jìn)行切分，但個(gè)體過(guò)大的應(yīng)適當(dāng)切分成小塊為宜。瀝干水分即可入壇泡制。如將原料適當(dāng)晾干后再進(jìn)行泡制，其品質(zhì)會(huì)更好。有時(shí)可先將原料用9～10%的鹽水預(yù)泡1～2天使其脫除部分水分，然后再進(jìn)行泡制。三、影響蔬菜發(fā)酵的因素（一）食鹽濃度酸、泡菜食鹽濃度一般為4%以下。這樣的食鹽濃度對(duì)于腐敗菌有一定的抑制作用。1%的食鹽可以達(dá)到調(diào)味的目的。另外，食鹽濃度對(duì)蛋白酶、果膠酶的活性均有不同程度的影響，所以生產(chǎn)中常采用低鹽法或分次加鹽腌制的方法。（二）pH值微生物對(duì)pH值均有一定要求，但各類(lèi)微生物之間存在著差異。在腌制品中，有益發(fā)酵作用的乳酸菌和酵母菌比較耐酸，其它微生物除霉菌抗酸外，腐敗細(xì)菌、丁酸菌、大腸桿菌等在pH值為4.5以下時(shí)，都會(huì)受到不同程度的抑制。為了抑制有害微生物的活動(dòng)，創(chuàng)造乳酸發(fā)酵的有利條件，在生產(chǎn)上，腌制初期可采用提高酸度的方法。（三）原料的質(zhì)地及化學(xué)成分有些原料體積過(guò)大，致密堅(jiān)硬，滲透作用較差。為了加快細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，在加工過(guò)程中可以采用切分、揉搓、重壓、加溫等措施來(lái)改變組織細(xì)胞的滲透性。原料中的水分含量與泡菜制品的品質(zhì)密切相關(guān)，一般在加工前處理時(shí)，應(yīng)適當(dāng)減少原料中的水分。原料中的糖分是微生物的發(fā)酵作用的主要基質(zhì)，一般蔬菜原料中含糖在1～3%，為了促進(jìn)發(fā)酵作用，可以在原料中加糖。1克糖通過(guò)乳酸發(fā)酵可生成1克乳酸，因而要進(jìn)行乳酸發(fā)酵的蔬菜要含有一定的糖分。（四）溫度對(duì)于蔬菜的發(fā)酵來(lái)說(shuō)，最適室溫在20～32℃，但在10～43℃的范圍內(nèi)，乳酸菌均可生長(zhǎng)繁殖，為了控制腐敗微生物的活動(dòng)，生產(chǎn)上常采用的溫度為12～22℃，只是所需時(shí)間稍長(zhǎng)。第六節(jié)酒類(lèi)一、白酒白酒屬于蒸餾酒，主要是以谷物類(lèi)為原料，經(jīng)糊化、糖化、發(fā)酵后進(jìn)行蒸餾得到的含酒精較高的酒類(lèi)。白酒的酒精度較高，高達(dá)65度以上。高度白酒主要產(chǎn)于我國(guó)，其它國(guó)家的白酒很少超過(guò)50度。（一）白酒釀造的微生物學(xué)原理淀粉質(zhì)原料中的淀粉經(jīng)過(guò)糊化、糖化后轉(zhuǎn)化成單糖、雙糖等簡(jiǎn)單的碳水化合物（可發(fā)酵糖），糖再經(jīng)發(fā)酵作用轉(zhuǎn)化成酒精。糖化主要是在霉菌（產(chǎn)生糖化酶）作用下完成，發(fā)酵主要是在酵母（酒精發(fā)酵）的作用下完成。（二）白酒釀造的微生物類(lèi)群及特性1.糖化菌糖化菌必須具有產(chǎn)生淀粉酶的能力。盡管這類(lèi)微生物很多，但生產(chǎn)上常用的糖化微生物主要是曲霉和根霉這兩種霉菌。

曲霉有黑曲霉、白曲霉、黃曲霉和米曲霉等。黑曲霉類(lèi)中以鄔氏曲霉、泡盛曲霉和甘薯曲霉應(yīng)用最廣。白曲霉實(shí)際為鄔氏曲霉的變種，其中以河內(nèi)白曲和輕研二號(hào)最為著名。1947年以前酒精生產(chǎn)是以米曲霉固體曲，現(xiàn)在大多被黑曲霉類(lèi)代替。酒曲中還含有大量的根霉，是白酒生產(chǎn)中主要的淀粉糖化菌，其中以東京根霉（又叫河內(nèi)根霉）、魯氏根霉和爪哇根霉最為著名。另外，酒曲中還含有大量毛霉。2.酒精發(fā)酵微生物許多微生物都能利用己糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，但白酒生產(chǎn)中利用的微生物幾乎都是真菌。主要有南陽(yáng)酵母、12號(hào)酵母（RasseⅫ）、1號(hào)酵母（RasseⅠ）、2號(hào)酵母（RasseⅡ）、M酵母（HefeM)。

另外，一些細(xì)菌也能進(jìn)行酒精發(fā)酵，如林奈假單胞菌及運(yùn)動(dòng)假單胞菌等可以利用葡萄糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，產(chǎn)生酒精。據(jù)報(bào)道，運(yùn)動(dòng)假單胞菌用于酒精生產(chǎn)在國(guó)外已有中試。關(guān)于我國(guó)釀造工業(yè)中是否采用細(xì)菌進(jìn)行酒精發(fā)酵，至今未見(jiàn)報(bào)道。短乳桿菌、布氏乳桿菌、雙歧桿菌的異型乳酸發(fā)酵可以產(chǎn)生一些乙醇。

利用細(xì)菌進(jìn)行酒精發(fā)酵，早在80年代初就引起注意。但其工業(yè)化生產(chǎn)較難實(shí)現(xiàn)，還有許多問(wèn)題有待解決。目前最有希望的是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，它能產(chǎn)生與酵母相同程度的乙醇，而發(fā)酵時(shí)間僅為酵母的1/3～1/2。該菌對(duì)糖的代謝僅限于葡萄糖、果糖和蔗糖，這就影響了它的工業(yè)化應(yīng)用。有關(guān)人員預(yù)運(yùn)用生物技術(shù)對(duì)此種微生物進(jìn)行基因重組，以擴(kuò)大其碳源的利用范圍，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。（三）白酒工藝及微生物變化1.大曲白酒的生產(chǎn)大曲酒是以高粱、玉米等為原料，經(jīng)糖化、發(fā)酵、蒸餾和勾兌而制成。目前國(guó)內(nèi)采用的工藝有清渣法和續(xù)渣法兩種。大曲是以小麥或大麥和豌豆為原料，經(jīng)粉碎后加水壓成磚塊狀，再由人工控制溫度培養(yǎng)而成，所以又叫“塊曲”，是一種含有較多根霉、毛霉、念珠霉以及乳酸菌、醋酸菌、芽孢桿菌等多種微生物的混合曲種。

根據(jù)制曲過(guò)程中曲坯最高溫度控制的差異，大曲可分為高溫曲（最高溫度超過(guò)60℃以上）和中溫曲（最高溫不超50℃）兩種類(lèi)型。為了提高曲香，國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)名酒廠均采用高溫曲生產(chǎn)，如茅臺(tái)酒（60～65℃）、瀘州大曲（55～60℃）、西風(fēng)酒（55～60℃）五糧液（58～60℃）等。高溫曲制作工藝

曲母↓小麥100%—→潤(rùn)料—→磨碎—→粗麥粉—→拌曲料—→水↓貯存←出房←成品曲←堆積培養(yǎng)←曲坯←踩曲

先在原料小麥中加入5～10%的水潤(rùn)料，約3～5小時(shí)后進(jìn)行粉碎，要求成片狀，未通過(guò)20目篩的粗粒及麥皮占50～60%，通過(guò)20目篩的細(xì)粉占40～50%；然后按麥粉的重量加入37～40%的水，夏季4～5%、冬季5～8%的曲母，進(jìn)行拌料，稱為“和曲”；以踩曲機(jī)將曲料壓成磚塊狀的曲坯，要求松而不散，移入曲房?jī)?nèi)（墊草15cm），三橫三豎相間排列，曲坯之間間隔2cm，用草隔開(kāi)。排滿一層后，上面鋪7cm的墊草，再放第二層，曲堆高度以4～5層為宜。最后在曲堆上覆蓋一層草，以利于保溫，并時(shí)常向草上噴水。

堆曲后經(jīng)過(guò)培養(yǎng)（夏季5～6，冬季7～9天），曲坯內(nèi)部溫度可達(dá)60℃以上，表面長(zhǎng)出霉衣，此時(shí)進(jìn)行第一次翻曲，再經(jīng)7天培養(yǎng)，進(jìn)行第二次翻曲。翻曲后15天可略開(kāi)窗門(mén)，促進(jìn)換氣。40～50天后，曲溫降至室溫，曲塊接近干燥，即可拆曲出房。出房的成品曲以黃色為佳，醬香氣味，再經(jīng)3～4個(gè)月的貯存，成為陳曲后可以使用。續(xù)渣法白酒釀造工藝清渣法白酒工藝二、啤酒啤酒（beer）是以麥芽為主要原料，首先制成麥汁，添加酒花，采用啤酒酵母發(fā)酵而制成的一種釀造酒。啤酒起源于9千年前的亞述，即現(xiàn)在地中海南岸地區(qū)，以后傳入歐洲、美洲、及東亞地區(qū)。啤酒的原料主要是：大麥、酒花、啤酒酵母和一些輔料。大麥?zhǔn)轻勗炱【频闹饕?，先制成麥芽，?jīng)過(guò)烘干干燥后貯藏一段時(shí)間就可以生產(chǎn)麥汁，用于啤酒的釀造。

酒花的添加賦予啤酒酒花香味和爽口的苦味，增加啤酒泡沫的持久性和穩(wěn)定性，與麥汁共同煮沸時(shí)能促進(jìn)蛋白質(zhì)的凝固，有利于麥汁的澄清，還能夠增強(qiáng)麥汁和啤酒的防腐性能。酒花中最重要的成分是酒花樹(shù)脂（包括α—酸和β—酸），是啤酒的苦味物質(zhì)。另外，其中還含有酒花油和多酚物質(zhì)，前者賦予啤酒的香味，后者有利于啤酒的穩(wěn)定性。

啤酒釀造常添加的輔料有大米、玉米和糖等。輔料的添加改善浸出物的組分、風(fēng)味和色澤，增強(qiáng)啤酒的穩(wěn)定性和貯存性能，降低成本。大米淀粉含量高，蛋白質(zhì)含量低，是應(yīng)用最多的輔料，大多數(shù)啤酒生產(chǎn)廠家都是在糖化時(shí)，加入20～30%的大米，我國(guó)南方的廠家大米添加量可達(dá)到45%以上，美國(guó)啤酒生產(chǎn)中添加大米的量有的可達(dá)到40～50%。

啤酒生產(chǎn)中的用水主要在糖化、制麥、洗滌、滅菌、冷卻及其它環(huán)節(jié)。以糖化用水最為重要，它直接影響到啤酒的質(zhì)量。許多名牌啤酒的生產(chǎn)都具備良好的水源。不良的水質(zhì)經(jīng)過(guò)改良也可以用于啤酒的生產(chǎn)。水在啤酒中主要是起溶劑的作用。（一）啤酒釀造的微生物學(xué)原理原料中的淀粉在淀粉酶的作用下轉(zhuǎn)化成單糖；單糖再通過(guò)發(fā)酵轉(zhuǎn)化成酒精；同時(shí)，其中的蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下轉(zhuǎn)化成短肽和氨基酸。淀粉轉(zhuǎn)化成糖、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成氨基酸，主要是在酶制劑的作用下完成；單糖轉(zhuǎn)化成酒精主要是在啤酒酵母的作用下完成。（二）啤酒釀造的微生物及特性啤酒酵母在分類(lèi)學(xué)上屬于真菌，子囊菌亞門(mén)酵母屬，有兩個(gè)主要的菌種，即上面發(fā)酵啤酒酵母和下面發(fā)酵啤酒酵母。國(guó)內(nèi)啤酒廠基本都用下面發(fā)酵啤酒酵母。它在發(fā)酵時(shí)懸浮在發(fā)酵液中，發(fā)酵終了能很快凝聚成塊，沉積于底部，成為酵母泥，酵母泥可以回收供下次發(fā)酵使用。目前國(guó)內(nèi)較好的下面酵母有青島酵母、沈啤1號(hào)、龍輕16號(hào)、首都啤酒酵母等。近年來(lái)還從西德、丹麥等國(guó)家引進(jìn)了一些優(yōu)良酵母，都屬于下面酵母。啤酒酵母

啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)程序試管斜面（原種）→富氏瓶培養(yǎng)→巴氏瓶培養(yǎng)→卡氏罐培養(yǎng)→漢森罐培養(yǎng)→酵母繁殖槽→主發(fā)酵（三）啤酒工藝及微生物變化1.麥汁的制備及處理麥汁的制備即糖化。先將原料擠壓粉碎，保持大塊的麥皮便于過(guò)濾。而輔料的粉碎則以細(xì)粉為好。糖化方法有煮出法和浸出法兩大類(lèi)。煮出法又可分為一次煮出、二次煮出和三次煮出等方法。國(guó)內(nèi)大部分廠家都生產(chǎn)淡色啤酒，幾乎都采用二次煮出法。麥汁的處理包括麥汁過(guò)濾、煮沸、酒花添加、冷卻等環(huán)節(jié)。2.麥汁發(fā)酵生麥汁冷卻到6.0～6.8℃時(shí)，送入酵母增殖槽，按0.5～0.65的比例添加酵母泥（酵母泥需用麥汁按1:1稀釋?zhuān)儆脡嚎s空氣或泵送入添加槽內(nèi)），送入無(wú)菌壓縮空氣，使酵母與麥汁充分混合，并使麥汁中溶解一定量的氧氣供酵母呼吸作用。通常接種的細(xì)胞濃度為800～1200萬(wàn)個(gè)/ml。經(jīng)16～24h增殖后的發(fā)酵液，轉(zhuǎn)入另一個(gè)發(fā)酵罐或池內(nèi)，進(jìn)行以下的發(fā)酵。（1）主發(fā)酵主發(fā)酵又稱前發(fā)酵，這是啤酒的主要發(fā)酵過(guò)程。前發(fā)酵過(guò)程可分為低泡期、高泡期和落泡期三個(gè)時(shí)期。*低泡期倒罐（槽）后4～5h，液面四周出現(xiàn)較多的白色泡沫，并向中間擴(kuò)展，直至整個(gè)液面。吹開(kāi)液面，可看到二氧化碳?xì)馀萦可弦好?。此階段可持續(xù)2～3天，每天溫度上升1℃，糖分每天下降1度。*高泡期發(fā)酵三天后，泡沫繼續(xù)增高，可高達(dá)25～30cm。由于酒精含量的升高，使酒花樹(shù)脂析出，逐漸形成棕黃色泡蓋。這是發(fā)酵最旺盛時(shí)期。品溫可高達(dá)9～10℃，此時(shí)需要注意降溫。降糖速度每天1.5度。此階段可維持2～3天。*落泡期是發(fā)酵的衰落期。發(fā)酵5天后，溫度開(kāi)始下降，降溫速度變慢，泡沫開(kāi)始收縮，發(fā)酵液中析出物增多，泡沫由棕黃色變成棕褐色，并形成褐色泡蓋，酵母逐漸下沉。當(dāng)11度的糖度降到4.0～4.5度，12的糖度降到3.8～4.8度時(shí)，即可進(jìn)行下一個(gè)階段的后發(fā)酵。此階段可維持2～3天。（2）后發(fā)酵啤酒的后發(fā)酵又稱啤酒的后熟，也稱貯酒。目的在于完成糖的最后發(fā)酵，促進(jìn)啤酒的成熟。*下酒與封罐將主發(fā)酵后除去大量沉淀酵母的發(fā)酵液送到后酵罐內(nèi)的過(guò)程成為下酒。下酒前應(yīng)用二氧化碳?xì)獬錆M后酵罐，以驅(qū)除罐內(nèi)氧氣。*后酵管理整個(gè)后酵過(guò)程的罐壓應(yīng)保持相對(duì)的穩(wěn)定，不可忽高忽低。后酵溫度多用室溫控制，一般先高后低，即由下酒時(shí)的品溫5～8℃，于2～3天內(nèi)降低到3℃，以后逐漸降到0～-1℃，并保持此溫。后酵的時(shí)間也稱酒齡，可根據(jù)啤酒的種類(lèi)與麥汁濃度而異。一般12度啤酒的酒齡都在20～30天之間，特制啤酒也不超60天。后酵期滿以后，即可過(guò)濾、罐裝殺菌，制成成品啤酒。三、葡萄酒葡萄酒是以葡萄為原料，經(jīng)發(fā)酵而制成的一種飲料酒。它是果酒中最為重要的一種。葡萄酒的酒精度較低，一般在8～22度之間，又由于其口味醇和，深受人們的喜愛(ài)，生產(chǎn)和銷(xiāo)售量都比較大。葡萄酒工業(yè)在許多國(guó)家和地區(qū)的工業(yè)生產(chǎn)中占有相當(dāng)重要的地位。我國(guó)的葡萄酒在1985年產(chǎn)量已達(dá)23.2萬(wàn)噸，近年來(lái)，市場(chǎng)的需求量仍有很大增長(zhǎng)，隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，我國(guó)的葡萄酒工業(yè)將會(huì)有更廣闊的前景。（一）葡萄酒釀造的微生物學(xué)原理葡萄中的糖類(lèi)，經(jīng)過(guò)發(fā)酵轉(zhuǎn)化成酒精和其他有機(jī)酸等物質(zhì)。糖轉(zhuǎn)化成酒精是在酵母的作用下完成的。（二）葡萄酒釀造的微生物類(lèi)群及特性葡萄酒酵母主要是釀酒酵母中的菌種。具有發(fā)酵糖產(chǎn)生酒精的能力。有氧條件下繁殖旺盛，無(wú)氧條件下酒精發(fā)酵。

溫度在10℃以下時(shí)，酵母一般不發(fā)芽或發(fā)芽速度非常緩慢。相反，溫度略為升高時(shí)，對(duì)酵母發(fā)芽具有顯著的影響，從20～22℃開(kāi)始，發(fā)芽速度已經(jīng)很快，單位時(shí)間內(nèi)分解糖的量隨著溫度的升高而增加，直到34～35℃。當(dāng)溫度達(dá)到37～39℃時(shí)，酵母的活力減弱，40℃時(shí)酵母停止發(fā)芽。這是葡萄酒釀造中可達(dá)到的最高溫度。（三）葡萄酒工藝及微生物學(xué)變化1.榨汁不論釀制紅葡萄酒還是白葡萄酒，都必須先將葡萄分選、除梗、破碎、熱處理及分級(jí)等工藝而制成葡萄汁。破碎一般采用雙滾筒破碎機(jī)，破碎率要求達(dá)到95%以上。進(jìn)行熱處理有利于了產(chǎn)品的果香、增進(jìn)酒色。經(jīng)過(guò)熱處理的葡萄汁應(yīng)加入防腐劑（二氧化硫或偏重亞硫酸鉀等），抑制有害微生物生長(zhǎng)繁殖；同時(shí)保持葡萄汁的還原狀態(tài)，以防受到氧化而發(fā)生品質(zhì)的劣變。此外，若果汁中含酸較高而糖分較低時(shí)，應(yīng)在發(fā)酵之前調(diào)整糖分與酸度。2.葡萄汁的酒精發(fā)酵自流汁放入發(fā)酵池后，加入5%的酵母液，將溫度調(diào)整到24～26℃進(jìn)行發(fā)酵。這一階段主要是在酵母的作用下，將葡萄汁中的糖分分解轉(zhuǎn)化成酒精和二氧化碳（及少量副產(chǎn)物）。發(fā)酵后的酒精度應(yīng)在13度以上。

葡萄皮上附著有很多的野生酵母，以前的工藝中可讓其自然發(fā)酵，但容易造成異常的發(fā)酵，所以現(xiàn)在一般都要添加2～10%的純培養(yǎng)酵母（葡萄酒酵母），添加的酵母繁殖力旺盛，發(fā)酵速度較快。發(fā)酵菌種，通?；煊?～4種或并用自然發(fā)酵，以防產(chǎn)品香味單調(diào)。傳統(tǒng)工藝中這一階段是用開(kāi)口或密閉發(fā)酵桶進(jìn)行，現(xiàn)代發(fā)酵工藝逐漸革新為帶有降溫設(shè)施的自動(dòng)翻汁發(fā)酵池。3.出池與后發(fā)酵前發(fā)酵結(jié)束后應(yīng)進(jìn)行換池，轉(zhuǎn)入貯池進(jìn)行陳釀。如果一切正常，葡萄醪的比重應(yīng)是有規(guī)則的下降，隨著糖分的消失，后發(fā)酵在4～5天內(nèi)完成。此時(shí)，要注意調(diào)整糖度達(dá)13度，二氧化硫含量在100ppm。4.后加工工序后發(fā)酵結(jié)束后，葡萄酒逐漸自然澄清，溫度在5～6℃，不再產(chǎn)生二氧化碳，酒中所有懸浮物—酒石酸鹽及微生物細(xì)胞都慢慢沉降到池底形成酒腳。酒腳必須及時(shí)清除，所以要進(jìn)行倒池。一個(gè)月內(nèi)進(jìn)行第一次倒池，除去酒腳；半年后進(jìn)行第二次倒池，并下膠澄清。澄清后將清酒抽出進(jìn)行冷凍處理，冷凍溫度要控制在酒的冰點(diǎn)以上0.5℃，時(shí)間5～7天，同時(shí)過(guò)濾除去混濁物質(zhì)。5.調(diào)配按照產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，葡萄酒的酒精含量、糖含量、加以調(diào)整。為協(xié)調(diào)風(fēng)味，還需要進(jìn)行勾兌。注意：發(fā)酵過(guò)程中很多因素影響到發(fā)酵過(guò)程是否能夠正常進(jìn)行和產(chǎn)品的質(zhì)量。如：溫度、壓力、氧、酸、糖及其他碳源、酒精、二氧化碳、單寧、亞硫酸及其鹽、殺菌劑等。華夏葡萄酒第八章微生物在發(fā)酵食品中的應(yīng)用第一節(jié)食醋

食醋（Vinegar）是我國(guó)傳統(tǒng)的酸性調(diào)味品，其主要成分是乙酸，含量為3-5%，此外，還含有各種有機(jī)酸、糖類(lèi)和脂類(lèi)等成份。食醋花色品種繁多，著名的有山西陳醋，鎮(zhèn)江香醋、保寧麩醋、北京熏醋、浙江玫瑰米醋、福建紅曲醋及東北白醋等。釀醋的原料在我國(guó)南方以糯米和大米為主，北方則多用高粱和小麥。近年來(lái)，多注意采用代用原料，如玉米、薯類(lèi)、碎米、麩皮、米糠、糠糟、廢糖蜜以及一些含淀粉的野生植物等。

一、食醋釀造中的微生物（一）淀粉糖化微生物麩曲醋生產(chǎn)中常用的糖化菌是曲霉菌。對(duì)糖化菌選擇的要求是：糖化力高，適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖速度快。一般而言，凡能生產(chǎn)麩曲白酒的糖化菌均可用作醋曲的糖化菌。如烏沙米曲霉、甘薯曲霉、黑曲霉、米曲霉、黃曲霉等。一般認(rèn)為黑曲霉比米曲霉、黃曲霉的糖化力高，出醋率也顯著提高，故大多用黑曲霉制作麩曲。（二）酵母菌目前我國(guó)食醋生產(chǎn)中常用的酵母菌基本上與酒精、白酒和黃酒生產(chǎn)所用的酵母相同。從分類(lèi)系統(tǒng)而言，淀粉質(zhì)原料酒精發(fā)酵常用菌種酵母屬中的啤酒酵母（Sa—ccharomycescereviside）及其變種，如拉斯2號(hào)（Rasse—Ⅱ）、拉斯12號(hào)（R-asse—Ⅻ）、K字酵母及從我國(guó)酒精生產(chǎn)中篩選的南陽(yáng)5號(hào)（代號(hào)為1300）、南陽(yáng)混合（代號(hào)為1308）等酵母菌，其酒精發(fā)酵作用均較強(qiáng)。（三）醋酸菌醋酸菌是指氧化酒精生成醋酸的一類(lèi)細(xì)菌的總稱?？蓜澐譃閮纱箢?lèi)：

1.醋酸桿菌屬主要作用是氧化酒精為醋酸，也能氧化葡萄糖生成少量的葡萄糖酸，并可繼續(xù)氧化醋酸為CO2和H2O。

2.葡萄糖桿菌屬主要作用是氧化葡萄糖為葡萄糖酸，并氧化酒精生成少量醋酸，但不能將醋酸氧化成CO2和H2O。

生產(chǎn)上常用菌種有許詩(shī)醋酸桿菌（Acetshuenbachii），醋化桿菌（Acet.aceti）、巴氏醋酸桿菌（Acet.pasteurianus）等。目前大多數(shù)采用人工培養(yǎng)的優(yōu)良醋酸菌，如中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的As1.41號(hào)釀醋菌及滬釀1.01號(hào)醋酸菌。二、食醋釀造工藝（教材221頁(yè)）（一）固態(tài)釀醋薯干（或碎米、高粱等）→粉碎→加麩皮→谷糠混合→潤(rùn)水→蒸料→冷卻→接種（麩曲、酒母、水）→入缸糖化發(fā)酵→拌糠接種（醋母）→翻醅→加鹽后熟→淋醋→貯存陳醋→配兌→滅菌→包裝→成品（二）酶法液態(tài)釀醋（三）液體深層發(fā)酵制醋第二節(jié)醬油醬油是我國(guó)傳統(tǒng)調(diào)味品之一。醬油釀造是以成分復(fù)雜的農(nóng)產(chǎn)品為原料，通過(guò)各種微生物酶的作用，將原料中的蛋白質(zhì)和碳水化合物分解成氨基酸、糖、有機(jī)酸、酒精和脂類(lèi)等多種物質(zhì)的混合體，具有一定色、香、味和刺激食欲的作用。一、釀造醬油應(yīng)用的微生物釀造醬油的菌種多用米曲霉。其菌落特征在不同的培養(yǎng)基上有一定差異，在察氏培養(yǎng)基上菌落形成較慢，培養(yǎng)10天菌落可達(dá)5-6cm，質(zhì)地疏松，初為白色、黃色，后為黃褐色至淡綠色；在一般天然培養(yǎng)基上菌落形成較快，培養(yǎng)2-3天就全部產(chǎn)生孢子，呈黃綠色。我國(guó)較好的菌種有滬釀3.042，渝3.811，961米曲霉，961-2米曲霉，廣州米曲霉，WS2米曲霉，滬釀VE328米曲霉。也有人用過(guò)黑曲霉和甘薯曲霉作為醬油釀造菌種。二、醬油釀造工藝

水食鹽+水 ↓↓原料→潤(rùn)水→蒸煮→冷卻→接種→通風(fēng)制曲→成曲扮鹽水→入池發(fā)酵→浸出淋油→生醬油→加熱→調(diào)配→澄清→質(zhì)量檢驗(yàn)→成品（一）原料處理原料處理主要是將原料經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)钠扑楹蠹铀疂?rùn)脹，在經(jīng)蒸煮使蛋白質(zhì)變性、淀粉糊化，以利于酶的分解作用，同時(shí)殺滅原料中的微生物，給曲霉生長(zhǎng)發(fā)育創(chuàng)造條件。（二）種曲制備種曲即醬油釀造制曲時(shí)所用的種子，它是由生產(chǎn)所需要的菌種經(jīng)過(guò)相當(dāng)?shù)募兇馀囵B(yǎng)而得的含有大量孢子的曲種。種曲的優(yōu)劣直接影響醬油曲質(zhì)量、醬醅雜菌含量、發(fā)酵速度、蛋白質(zhì)和淀粉水解程度。因此種曲制造必須十分嚴(yán)格。種曲制備流程如下：原菌種→斜面試管培養(yǎng)→三角瓶培養(yǎng)→種曲（三）制曲制曲的目的主要是使米曲霉在熟料中充分生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)分泌出醬油生產(chǎn)所需要的酶，如蛋白酶、谷氨酸酶、果膠酶、纖維素酶等；并使原料發(fā)生變化，為發(fā)酵創(chuàng)造必要的條件。目前多數(shù)廠采用厚層通風(fēng)制曲法。（四）發(fā)酵發(fā)酵是指將曲拌以適量鹽水后，置于發(fā)酵容器中，在一定溫度下，利用微生物酶將醬醅中的有機(jī)物進(jìn)行一系列分解的反應(yīng)，蛋白質(zhì)分解成氨基酸，淀粉分解成糖，進(jìn)而產(chǎn)生醇、酸、酯，形成色、香、味具佳且風(fēng)味獨(dú)特的醬油。醬醅發(fā)酵是有多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果。發(fā)酵過(guò)程中，既有大分子物質(zhì)的降解，又有新物質(zhì)的合成。（五）浸出淋油浸出淋油是從醬醅中提取有效成分的過(guò)程，浸出是將醬油中的成分溶于鹽水中；淋油則是把醬油與醬渣通過(guò)過(guò)濾分離出來(lái)。（六）醬油的后處理醬油的后處理包括滅菌、配制（勾兌）、質(zhì)量檢查和包裝等工序，總的目的是為了保證成品醬油有一個(gè)穩(wěn)定的質(zhì)量水平。第三節(jié)豆制品的發(fā)酵發(fā)酵豆制品是我國(guó)著名的民族特產(chǎn)發(fā)酵食品之一，滋味鮮美，風(fēng)味獨(dú)特。全國(guó)各地均有生產(chǎn)，品種繁多。一、發(fā)酵豆制品應(yīng)用的微生物主要是毛霉二、發(fā)酵豆制品工藝（教材224頁(yè)）第九章微生物污染與控制第一節(jié)微生物污染源由于微生物本身的特點(diǎn)，使得微生物在自然界廣泛分布，高山、海洋、陸地、河流、湖泊以及空氣中都有它們的存在。微生物的類(lèi)型和數(shù)量隨著環(huán)境的變化而變化。食品中的微生物主要來(lái)源于土壤、空氣、水、人和動(dòng)物、加工設(shè)備、原料及包裝材料等方面。一、土壤中的微生物污染土壤中的環(huán)境條件是很多微生物非常適應(yīng)的，因?yàn)橥寥乐泻形⑸锷L(zhǎng)繁殖所需要的一切營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和各種條件。比如土壤中含有大量的動(dòng)植物殘?bào)w，為微生物提供了氮源和碳源，硫、磷、鉀、鈣等礦質(zhì)元素以及錳、鉬、硼等微量元素在土壤中的含量都非常豐富；土壤又具有通氣性、保水性；土壤的酸堿度（pH3.5-10.5)也能滿足微生物的需求；土壤對(duì)紫外線具有很好的遮蔽作用，防止微生物受到傷害，這些都為微生物提供了良好的生活條件。

不同的土壤中微生物的種類(lèi)和數(shù)量有很大的不同，距地面以下5-20cm是微生物最好的生活場(chǎng)所，肥沃的土壤（有機(jī)質(zhì)含量高）中每克可以含有3*109個(gè)細(xì)菌，耕作土壤中細(xì)菌總重量可以達(dá)到每畝90-200Kg。土壤中細(xì)菌占微生物總量的70—80%，放線菌占5—30%，另外還有真菌、藻類(lèi)以及原生動(dòng)物等，在果園、菜園中含有大量的酵母。

土壤中與食品有關(guān)的細(xì)菌有：芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)桿菌屬、微桿菌屬、棒桿菌屬、葡萄球菌屬、假單孢菌屬等；霉菌有：青霉屬、曲霉屬、毛霉屬、根霉屬、木霉屬、鐮刀霉屬、枝孢霉屬等；酵母有：假絲酵母、隱球酵母、紅酵母、漢遜氏酵母等。

土壤中的主要病原微生物有：結(jié)核桿菌、傷寒桿菌、化膿球菌、豬丹毒桿菌、巴氏桿菌、布氏桿菌、多種腸道桿菌及病毒。另外還有能形成芽孢的碳疽桿菌、破傷風(fēng)桿菌、肉毒梭菌等細(xì)菌及惡性水腫的病原體。

土壤中微生物的來(lái)源，有天然生活在土壤中的自養(yǎng)型微生物，如各種腐生菌；也有的隨動(dòng)植物尸體進(jìn)入土壤之中；還有的隨著污水和空氣進(jìn)入土壤。這些微生物在土壤中存活時(shí)間并不相同，有時(shí)存在很大差異，所以，們對(duì)食品污染的程度是不同的。幾種微生物在土壤中的存活時(shí)間──────────────────────────微生物種類(lèi)存活時(shí)間──────────────────────────結(jié)核桿菌