植物生物工程實(shí)驗二植物的提取詳解演示文稿

植物生物工程實(shí)驗二植物的提取詳解演示文稿本文檔共40頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分（優(yōu)選）植物生物工程實(shí)驗二植物的提取本文檔共40頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分

保證DNA一級結(jié)構(gòu)的完整性排除其它分子的污染RNA、蛋白質(zhì)、多糖等DNA提取的原則實(shí)驗原理（DNA提?。┍疚臋n共40頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分DNA存在部位主要存在于細(xì)胞核中，線粒體和葉綠體中也少量存在本文檔共40頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分基因組DNA的提取CTAB法SDS法質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法DNA提取的方法本文檔共40頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分在濃氯化鈉溶液(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化鈉溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來.分離得到核蛋白后,需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去,常采用的去除蛋白的方法有3種:

①用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液,使其乳化,然后離心除去變性蛋白質(zhì),此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相和氯仿相中間,而DNA溶于上層水相.用兩倍體積95%乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來.如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀,得到的是游離的DNA.

②用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性,與核酸分離,從而從材料中直接提取出DNA.

③用苯酚處理,然后離心分層,DNA或溶于上層水相,或存在于中間殘留物中,蛋白變性后則停留在酚層內(nèi).吸出上面水層,將其注入兩倍體積的95%乙醇溶液中,得到白色纖維狀DNA沉淀本文檔共40頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分CTAB法原理

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl），該復(fù)合物可溶的有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)上清加入乙醇沉淀DNA。CTAB溶液在低于15℃時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于15℃。CTAB本文檔共40頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入本文檔共40頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分SDS法原理SDS陰離子去垢劑高溫（55～65℃）裂解細(xì)胞，蛋白變性，染色體離析高鹽(KAc或NH4Ac)或降低溫度（冰?。┦沟鞍踪|(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNASDS本文檔共40頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)SDS提取緩沖液的配方本文檔共40頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分DNA提取基本步驟材料準(zhǔn)備細(xì)胞裂解核酸分離純化核酸沉淀核酸溶解保存本文檔共40頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分

基因組DNA新鮮材料，低溫保存細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長材料準(zhǔn)備本文檔共40頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分基因組DNA材料過多影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：

植物材料－－液氮研磨培養(yǎng)細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)胞裂解本文檔共40頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分采用吸附材料吸附分離DNA，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)溶劑（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分而輕柔的混勻離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法核酸分離純化本文檔共40頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分多糖的去除：多糖水解酶蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑（SDS、異硫氰酸胍等）蛋白酶處理多酚的去除：加入還原劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG，可防止酚類與DNA的結(jié)合鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌本文檔共40頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分預(yù)冷的乙醇或異丙醇更充分沉淀加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)核酸沉淀

若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解本文檔共40頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分DNA質(zhì)量檢測紫外分光光度計檢測法

嘌呤和嘧啶的母環(huán)含有共軛雙鍵，因此也有紫外吸收現(xiàn)象，且在260nm和280nm處也存在吸收峰。蛋白質(zhì)中含苯環(huán)的氨基酸在這兩個波長下也會發(fā)生光吸收。因此，通過260nm和280nm下樣品的吸收值比率可判斷核酸純度本文檔共40頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分A：測DNA：

純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.8，OD260m／OD230應(yīng)大于2.0。1)OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。2)小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；3)OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。測定結(jié)果分析本文檔共40頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分瓊脂糖電泳瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。本文檔共40頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分DNA、RNA在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對照，可比較出被測DNA溶液濃度。注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作本文檔共40頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分根據(jù)OD260定量：測定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：a.dsDNA(doublestrandedDNA)=50mg/mlb.ssDNA(singlestrandedDNA)=40mg/mlc.oligonucleotide=33mg/ml本文檔共40頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分本文檔共40頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分PCR實(shí)驗原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。在待擴(kuò)增的DNA片斷兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。本文檔共40頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分DNA復(fù)制（replication）起始解旋引物酶結(jié)合延伸連接終止解鏈方向3′3′53′5′3′5′3′5′3′353本文檔共40頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分本文檔共40頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分本文檔共40頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗需求為止。本文檔共40頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分一般PCR反應(yīng)條件本文檔共40頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分儀器藥品1.5ml離心管；5ml離心管；研磨棒；5ml吸頭；1000ul吸頭（盒）；200ul吸頭（盒）；10ul吸頭（盒）；5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30ul移液器；2ul移液器；試劑瓶；量筒恒溫水浴鍋；高速離心機(jī)；紫外分光光度計；電泳儀；電泳槽；酸度計；電子天平；PCR儀CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；瓊脂糖；EB；引物；dNTP；Taq酶；EB本文檔共40頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分實(shí)驗步驟試劑配制貯存液最終含量100mlTris（121.14）1M12.114g1MTrisHCl,pH8.0先用蒸餾水溶解加至90ml左右，再用HCl調(diào)整pH至8.0，定容至100ml貯存液最終含量100mlEDTA（292.25）0.5M14.613g0.5MEDTA,pH8.0先用蒸餾水，再加入NaOH（固體）調(diào)pH至8.0，定容至100ml貯存液最終含量100mlNaCl（58.44）5M29.22g蒸餾水定容至100ml5MNaCl本文檔共40頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分貯存液最終含量100mlCTAB2%2g5MNaCl1.4M28ml0.5MEDTA20mM4ml1MTrisHClpH8.0100mM10mlPVP1%1g蒸餾水定容至100ml2×CTAB貯存液最終含量（10ml）3mlCTAB1g0.3g5MNaCl1.4ml0.42ml蒸餾水8.6ml2.58ml10%CTAB本文檔共40頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分貯存液最終含量100ml1MTrisHCl,pH8.010mM10ml0.5MEDTA,pH8.01mM2ml蒸餾水定容至1000mlT10E1貯存液最終含量（1000ml）100mlTris54g5.4gH3BO427.5g2.75g0.5MEDTA,pH8.020ml2ml蒸餾水定容至100ml5×TBE本文檔共40頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分異丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/mlEB貯存液最終含量（100ml）4.2ml異戊醇4ml168ul氯仿96ml4032ul抽提液1MTrisHCl；0.5MEDTA；5MNaCl；T10E1以及所有需使用的離心管，各種吸頭均需滅菌本文檔共40頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分操作流程操作規(guī)程1. 稱取100mg新鮮葉片，置于預(yù)冷1.5ml離心管中，加入液氮，研為細(xì)粉。加入350μl新鮮2×CTAB緩沖液，再仔細(xì)研磨。（CTAB用于抽提DNA）2. 用350μl新鮮2×CTAB緩沖液，沖洗研磨棒，加入2μlβ－巰基乙醇，混勻。65℃水浴45分鐘，每15分鐘搖動一次。冷卻至室溫，靜置2分鐘。3. 每支離心管加入700μl氯仿：異戊醇（24：1）（672氯仿:28異戊醇）混合液。輕柔短暫地混和，避免DNA斷裂。顛倒幾次。（氯仿、異戊醇、苯酚都用于沉淀蛋白質(zhì)）4. 在微型離心機(jī)中，以14，000rpm離心5分鐘。移取上層水層，置于新的、標(biāo)識好的1.5ml離心管中。注意避免取到中層物質(zhì)。將氯仿：異戊醇廢液倒入廢液缸。5. 加入50μl10％CTAB（溶于0.7MNaCl），輕柔混和，并保證混和完全。本文檔共40頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分6. 重復(fù)第3、第4步。7. 每支離心管中加入等體積異丙醇（400－500μl）。上下顛倒幾次，4℃靜置20分鐘（或－20℃，15分鐘）。（異丙醇用于沉淀DNA）8. 14，000rpm離心20分鐘。小心倒出上清夜，避免DNA顆粒丟失。倒置離心管，空氣干燥（1－2分鐘）。9. 用1ml70％乙醇清洗DNA（3分鐘），14,000rpm離心30分鐘。小心倒出70%乙醇，用1ml90％乙醇清洗DNA，14,000rpm離心30分鐘，小心地倒去乙醇。倒置離心管，空氣中干燥，或用真空泵干燥15分鐘。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸）10. 以150μlT10E1或蒸餾水溶解DNA，加入1～2μl不含DNA酶的RNA酶A（10mg/ml）。37℃反應(yīng)1小時。11. 4℃保存（－20℃長期保存）。本文檔共40頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分冷卻至室溫2μlβ-巰基乙醇100mg鮮葉水浴1.5ml離心管液N2研磨700μlCTAB65℃，45′離心↑↓/15′加入700μl氯仿：異戊醇（672:28）靜置2min渦旋混和，↑↓加入50μl10％CTAB溫和短時5′14,000rpm上清夜短時溫和輕柔混和加入等體積異丙醇循環(huán)一次離心↑↓靜置30′4℃，20′沉淀離心14,000rpm20′↓空氣干燥1－2′1ml70％乙醇沉淀3′14,000rpm沉淀加入150μlT10E11ml90％乙醇離心14,000rpm30′↓空氣干燥1－2μlRNAseA37℃，1h-20℃保存-20℃，15′冷卻至室溫本文檔共40頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分瓊脂糖凝膠電泳取5×TBE緩沖液20mL加水至100mL，配制成1×TBE稀釋緩沖液，待用。膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入50mL1×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為1％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。本文檔共40頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期一\16點(diǎn)20分3.膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。向冷