分子生物學實驗原理與常見問題解答

RNA提取原理與注意事項PCR原理與常見問題Real-timePCR介紹內(nèi)容本文檔共51頁；當前第1頁；編輯于星期二\10點31分商品化提取試劑盒原理：

異硫氰酸胍（GIT）-酚法

GIT與十二烷基肌氨酸鈉（Sarcosyl）作用使蛋白質(zhì)變性，從而釋放RNA；GIT與β－巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性；一定條件下（各家試劑條件不同），RNA不溶于乙醇，而DNA和蛋白質(zhì)溶于乙醇溶液，通過濾柱時，RNA掛柱，DNA和蛋白質(zhì)溶于濾液；在逐步洗脫的過程中，RNA不斷被純化；最后用水洗脫。本文檔共51頁；當前第2頁；編輯于星期二\10點31分杜絕外源酶的污染：嚴格戴好帽子，口罩，手套。實驗所涉及的離心管，Tip頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。RNA提取的注意事項（外界環(huán)境中多含Rnase，且RNA極不穩(wěn)定）RNasefreeDNasefree本文檔共51頁；當前第3頁；編輯于星期二\10點31分阻止內(nèi)源酶的活性：

選擇合適的勻漿方法。選擇合適的裂解液?？刂坪脴悠返钠鹗剂?。本文檔共51頁；當前第4頁；編輯于星期二\10點31分RNA提取原理與注意事項PCR原理與常見問題Real-timePCR本文檔共51頁；當前第5頁；編輯于星期二\10點31分PCR技術(shù)的基本原理模板DNA的變性：93℃-95℃左右，模板DNA與引物的退火(復性)：Ta=Tm-3~5℃引物的延伸：TaqDNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性變性--退火--延伸三個步驟

本文檔共51頁；當前第6頁；編輯于星期二\10點31分引物的復性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）復性溫度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應的特異性復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合本文檔共51頁；當前第7頁；編輯于星期二\10點31分1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍本文檔共51頁；當前第8頁；編輯于星期二\10點31分模板DNA95℃本文檔共51頁；當前第9頁；編輯于星期二\10點31分PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物本文檔共51頁；當前第10頁；編輯于星期二\10點31分PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶本文檔共51頁；當前第11頁；編輯于星期二\10點31分PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束第2輪開始本文檔共51頁；當前第12頁；編輯于星期二\10點31分PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq本文檔共51頁；當前第13頁；編輯于星期二\10點31分PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束本文檔共51頁；當前第14頁；編輯于星期二\10點31分PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點重復30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

本文檔共51頁；當前第15頁；編輯于星期二\10點31分標準的PCR反應體系（100ul體系）10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul本文檔共51頁；當前第16頁；編輯于星期二\10點31分PCR反應五要素模板（template）引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）Mg2+（magnesium）本文檔共51頁；當前第17頁；編輯于星期二\10點31分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。本文檔共51頁；當前第18頁；編輯于星期二\10點31分（2）引物濃度0.1-0.5mol/L濃度過高易導致模板與引物錯配,反應特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產(chǎn)量。本文檔共51頁；當前第19頁；編輯于星期二\10點31分（4）dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。本文檔共51頁；當前第20頁；編輯于星期二\10點31分（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應特異性。Mg2+可與負離子結(jié)合，所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。本文檔共51頁；當前第21頁；編輯于星期二\10點31分EB染色原理：

EB插入DNA堿基對之間的結(jié)合本文檔共51頁；當前第22頁；編輯于星期二\10點31分PCR常見問題無擴增產(chǎn)物非特異性擴增拖尾假陽性本文檔共51頁；當前第23頁；編輯于星期二\10點31分無擴增產(chǎn)物現(xiàn)象：陽對照有條帶，而樣品則無M樣品A樣品B陽性對照本文檔共51頁；當前第24頁；編輯于星期二\10點31分純度：含有抑制物濃度：含量低質(zhì)量：RNA被降解操作：體系配制有誤，模板加入有誤

原因純化模板或者使用優(yōu)質(zhì)試劑盒提取模板RNA加大模板的用量重新提取RNA，并做好無Rnase前處理重新配置擴增體系，重新PCR對策本文檔共51頁；當前第25頁；編輯于星期二\10點31分

非特異性擴增現(xiàn)象：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。本文檔共51頁；當前第26頁；編輯于星期二\10點31分引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因重新設計引物或者使用巢式PCR適當降低模板或引物濃度適當減少酶量降低鎂離子濃度適當提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)對策本文檔共51頁；當前第27頁；編輯于星期二\10點31分現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。

M12本文檔共51頁；當前第28頁；編輯于星期二\10點31分模板不純Buffer不合適退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多

原因純化模板更換Buffer適當提高退火溫度適量用酶適當降低dNTP和鎂離子的濃度減少循環(huán)次數(shù)對策本文檔共51頁；當前第29頁；編輯于星期二\10點31分靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染

原因開管輕柔，防止形成氣溶膠；防止靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外更換試劑、耗材試劑分裝，貯存適當。更換實驗室和所有試劑耗材。假陽性現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物對策本文檔共51頁；當前第30頁；編輯于星期二\10點31分PCR中應注意的事項（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設立對照：陽性對照：陽性模板陰性對照：陰性模板試劑對照：除模板外的所有組分本文檔共51頁；當前第31頁；編輯于星期二\10點31分Real-timePCR技術(shù)介紹本文檔共51頁；當前第32頁；編輯于星期二\10點31分實時熒光定量PCR定義在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法本文檔共51頁；當前第33頁；編輯于星期二\10點31分實時熒光定量PCR原理實時原理常規(guī)PCR技術(shù)：

對PCR擴增反應的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析本文檔共51頁；當前第34頁；編輯于星期二\10點31分實時熒光定量PCR原理定量原理介紹三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析本文檔共51頁；當前第35頁；編輯于星期二\10點31分實時熒光定量PCR原理-----------擴增曲線擴增曲線圖：橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標：熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集熒光基團熒光檢測元件本文檔共51頁；當前第36頁；編輯于星期二\10點31分實時熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號閾值（threshold）：

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值的缺省設置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍手動設置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99真正的信號:熒光信號超過域值本文檔共51頁；當前第37頁；編輯于星期二\10點31分實時熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)C(t)value本文檔共51頁；當前第38頁；編輯于星期二\10點31分實時熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量相同模板在同一臺PCR儀上相同條件下重復96次擴增的擴增曲線圖終點處檢測產(chǎn)物量不恒定，誤差大；Ct值則極具重現(xiàn)性起點量是樣本中原來的DNA量，更有意義；終點量經(jīng)過PCR放大，并非研究所期望的數(shù)據(jù)本文檔共51頁；當前第39頁；編輯于星期二\10點31分非特異性熒光標記：1、SYBRGreenⅠ特異性熒光標記：2、TaqMan3、MolecularBeacon實時熒光定量PCR的幾種方法介紹

本文檔共51頁；當前第40頁；編輯于星期二\10點31分－SYBRGreenⅠ法本文檔共51頁；當前第41頁；編輯于星期二\10點31分SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreenⅠ只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreenⅠ發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號（一般設置在復性階段）。SYBRGreen本文檔共51頁；當前第42頁；編輯于星期二\10點31分實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation本文檔共51頁；當前第43頁；編輯于星期二\10點31分實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析溫度熒光強度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度本文檔共51頁；當前第44頁；編輯于星期二\10點31分--TaqMan法本文檔共51頁；當前第45頁；編輯于星期二\10點31分與目標序列互補TaqMan---水解型雜交探針

5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)探針完整，