DEN聯(lián)合NMOR誘導(dǎo)建立具有轉(zhuǎn)移潛能的肝癌模型

DEN聯(lián)合NMOR誘導(dǎo)建立具有轉(zhuǎn)移潛能的肝癌模型【摘要】目的探討二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)聯(lián)合N亞硝基嗎啉(Nnitrosomorpholine，NMOR)誘導(dǎo)建立具有轉(zhuǎn)移潛能的SD大鼠肝癌模型以及合適的劑量和周期。方法5周齡雄性SD大鼠110只，分成4組：DEN+NMOR組(60只)、DEN組(20只)、NMOR組(20只)以及正常對(duì)照組(10只)。第1天DEN+NMOR組和DEN組大鼠按100mg/kg腹腔注射DEN1次，NMOR組和對(duì)照組給予等量的生理鹽水腹腔注射。第2天DEN+NMOR組和NMOR組給予含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×10-4NMOR的飲水自由飲用，DEN組和對(duì)照組飲用滅菌自來水。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行20周。結(jié)果16周時(shí)DEN+NMOR組、DEN組、NMOR組及正常對(duì)照組肝癌發(fā)生率分別為60%(6/10)、20%(1/5)、0(0/5)、0(0/2)；20周時(shí)分別為88%(21/24)、17%(1/6)、14%(1/7)、0(0/2)。DEN+NMOR組16周及20周肝癌肺轉(zhuǎn)移率分別為33%(2/6)和48%(10/21)，其他組未發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。結(jié)論(1)用DEN啟動(dòng)，NMOR促進(jìn)的方法誘導(dǎo)建立SD大鼠肝癌模型操作簡便、效果確切、成瘤周期短，有一定的肺轉(zhuǎn)移率。(2)按100mg/kg給予1次DEN腹腔注射，給予含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×10-4NMOR的飲水連續(xù)20周可能是有效的劑量和周期。

【關(guān)鍵詞】N亞硝基嗎啉；肺轉(zhuǎn)移；肝腫瘤；SD大鼠

【Abstract】ObjectiveToestablishdiethylnitrosamine(DEN)andNnitrosomorpholine(NMOR)inducedmetastatichepatocellularcarcinoma(HCC)modelinSDratsandinvestigateproperdoseandtreatmentperiod.MethodsOnehundredandten5weekoldmaleSDratswererandomlydividedintoDEN+NMORgroup(n=60),DENgroup(n=20),NMORgroup(n=20)andcontrolgroup(n=10).RatsinDEN+NMORgroupandDENgroupweregivenasingleintraperitonealinjectionofDENat100mg/kg,andratsinNMORgroupandcontrolgroupwereintraperitoneallyinjectedwithnormalsalineatthesamedosageatthefirstday.Fromtheseconddayon,groupsDEN+NMOR,NMORweregiven1×10-4NMORinthedrinkingwater,whileDENgroupandcontrolgroupweregivensterilizedwaterfor20weeks.ResultsTheHCCincidenceingroupsDEN+NMOR,DEN,NMORandcontrolgroupwas60%(6/10),20%(1/5),0(0/5),0(0/2)bytheendofthe16thweek,and88%(21/24),17%(1/6),14%(1/7),0(0/2)bytheendofthe20thweek.LungmetastasisincidenceingroupDEN+NMORbytheendofthe16thand20thweekwas33%(2/6),48%(10/21),respectively.NolungmetastasiswasobservedingroupsDEN,NMOR,andcontrolgroup.Conclusions(1)EstablishmentofhepatocarcinogenesismodelinducedbyDENandNMORinSDratprovidesanefficientmeansforrapidinductionoflungmetastasisofHCC.(2)AsingleintraperitonealinjectionofDENasaninitiatorofhepatocarcinogenesisatadoseof100mg/kgandfollowedby1×10-4NMORinthedrinkingwaterfor20weeksareappropriate.

【Keywords】Nnitrosomorpholine;Lungmetastasis;Liverneoplasm;SDrat

誘導(dǎo)性大鼠肝癌模型是肝癌研究中應(yīng)用廣泛的動(dòng)物模型，最常用的誘導(dǎo)藥物為二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)。但DEN誘導(dǎo)的肝癌多為EdmondsonⅠ級(jí)和Ⅱ級(jí)，轉(zhuǎn)移率很低，與人肝癌易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的情況不甚符合［1］。因此我們探討用DEN聯(lián)合N亞硝基嗎啉(Nnitrosomorpholine,NMOR)誘導(dǎo)建立具有轉(zhuǎn)移潛能的SD大鼠肝癌模型。

1材料與方法

誘癌劑

DEN，分子式(C2H5)2NNO；NMOR，分子式C4H8N2O2。均購自Sigma公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

5周齡雄性SD大鼠110只，體質(zhì)量(±)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分成4組：DEN+NMOR組(60只)，DEN組(20只)，NMOR組(20只)，正常對(duì)照組(10只)。飼養(yǎng)于該中心SPF環(huán)境下，滅菌飼料和飲用水由該實(shí)驗(yàn)中心提供，穩(wěn)定飼養(yǎng)1周后，開始誘癌處理。

誘癌方法

參照文獻(xiàn)［2］及我們預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，第1天DEN+NMOR組和DEN組按100mg/kg腹腔注射DEN1次，NMOR組和對(duì)照組給予等量的生理鹽水。第2天DEN+NMOR組和NMOR組給予含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×10-4NMOR的飲水自由飲用，DEN組和對(duì)照組飲用滅菌自來水。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行20周。分別于第4、8、12周取DEN+NMOR組大鼠2～3只、其他組1～2只處死觀察。剩余的大鼠于16周和20周分兩批處死。實(shí)驗(yàn)中死亡的大鼠隨時(shí)解剖觀察。

觀察指標(biāo)

(1)一般情況：觀察動(dòng)物的精神、飲食、活動(dòng)等情況，定期稱體質(zhì)量。(2)組織學(xué)檢查：摘取肝臟、肺用10%甲醛固定24h后以層厚1mm大體切片觀察有無腫瘤結(jié)節(jié)或轉(zhuǎn)移灶。無癌灶者，取肝、肺組織；有癌灶者取癌結(jié)節(jié)及距癌灶邊緣cm的組織。蘇木精伊紅染色鏡檢，肝細(xì)胞癌按Edmondson分級(jí)法分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，體質(zhì)量采用±s表示，檢驗(yàn)用方差分析；統(tǒng)計(jì)肝癌發(fā)生率、肺轉(zhuǎn)移率、大鼠病死率采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法。

2結(jié)果

大鼠一般情況

誘癌第1周內(nèi)，DEN+NMOR組和DEN組部分動(dòng)物出現(xiàn)活動(dòng)減少、飲食差，有大鼠死亡；第2周最為嚴(yán)重；前3周是死亡發(fā)生的高峰期；4周后大鼠情況好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量增加，死亡數(shù)量明顯減少；5～12周時(shí)，各組情況良好，體質(zhì)量增長較快；14周以后DEN+NMOR組大鼠體質(zhì)量增加較其他組減慢；20周3組體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34499，)。DEN+NMOR組、DEN組、NMOR組及對(duì)照組大鼠16周病死率分別為28%(17/60)、25%(5/20)、15%(3/20)、0(0/10)，20周病死率分別為30%(18/60)、25%(5/20)、20%(4/20)、0(0/10)，DEN+NMOR、DEN、NMOR3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=，)。

肝癌發(fā)生率及肝臟病理變化

16周和20周時(shí)各組肝癌發(fā)生率見表1。早期(4～8周)主要病理改變?yōu)楦渭?xì)胞變性、壞死。16周時(shí)，DEN+NMOR組部分肝臟表面可見灰白色結(jié)節(jié)，一般為1～2個(gè)，直徑為～cm；20周時(shí)，大鼠肝臟多腫大，表面粗糙，質(zhì)地脆弱，呈典型結(jié)節(jié)性肝硬化表現(xiàn)。癌結(jié)節(jié)增大、增多，散在、多發(fā)，直徑為～cm。鏡下肝臟呈結(jié)節(jié)性肝硬化、肝癌表現(xiàn)。癌細(xì)胞多排列實(shí)片狀及腺樣，可見靜脈癌栓(圖1)。在DEN+NMOR組27只成癌動(dòng)物中，25只為肝細(xì)胞癌，2只為混合性肝癌。腫瘤分化以中、低分化為主，其中Ⅰ級(jí)4只，Ⅱ級(jí)9只，Ⅲ級(jí)12只。表1肝癌發(fā)生率及肺轉(zhuǎn)移率

肺轉(zhuǎn)移

DEN+NMOR組發(fā)生肝癌的大鼠中，肺轉(zhuǎn)移率在16周和20周時(shí)分別為33%(2/6)、48%(10/21)(表1)。肺表面出現(xiàn)灰白色結(jié)節(jié)，部分有融合。病理檢查為肝癌肺轉(zhuǎn)移并可見血管內(nèi)癌栓(圖2)。

3討論

誘發(fā)性肝癌模型的建立多采用氨基偶氮染料、芳香胺類化合物、亞硝胺及黃曲霉素等化學(xué)藥物，其中以亞硝胺類，尤其是DEN是公認(rèn)可靠的誘癌藥物。NMOR屬于亞硝胺類，用DEN+NMOR誘導(dǎo)建立F344大鼠肝癌模型，發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)生率和肝癌肺轉(zhuǎn)移率均較高，而且如果劑量合適，可以明顯減少大鼠的病死率［2］。國內(nèi)普遍使用的是SD或Wistar等封閉群大鼠。本實(shí)驗(yàn)提示，用DEN+NMOR聯(lián)合誘導(dǎo)建立具有轉(zhuǎn)移潛能的SD大鼠肝癌模型是可行的。雖然Yoshino等［2］使用DEN100mg/kg，然后給予含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4×10-5NMOR飲水建立F344大鼠肝癌模型，20周時(shí)肝癌發(fā)生率達(dá)到100%。但我們預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)在SD大鼠上使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4×10-5NMOR卻只得到很低的誘癌成功率，原因可能是SD大鼠對(duì)腫瘤的易感性低于F344大鼠。改用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×10-4NMOR后，效果較好。是否還可以加大劑量或延長實(shí)驗(yàn)周期來獲得更好的效果，尚需進(jìn)一步研究。

大鼠死亡時(shí)間分布多在實(shí)驗(yàn)開始4周內(nèi)，死亡的原因主要有肺部感染、急性肝損害、腸壞死等。

前4周主要是變性，8周后可看到增生反應(yīng)，出現(xiàn)嗜酸性、嗜堿性結(jié)節(jié)，而這些現(xiàn)象被認(rèn)為是肝癌發(fā)生過程中的幾種關(guān)鍵變化［3-5］。16周時(shí)出現(xiàn)肉眼可見的癌結(jié)節(jié)，20周時(shí)肝臟呈現(xiàn)典型的結(jié)節(jié)性肝硬化，癌結(jié)節(jié)散在、多發(fā)。近一半的肝癌大鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。此過程與我國人肝癌多經(jīng)歷肝炎→肝硬化→肝癌發(fā)生、發(fā)展→侵襲轉(zhuǎn)移的病理過程相類似。DEN+NMOR組肝癌發(fā)生率高于單用DEN或NMOR組，分級(jí)多為Ⅱ、Ⅲ級(jí)，有靜脈癌栓和肺轉(zhuǎn)移灶。這說明DEN+NMOR誘發(fā)肝癌效果肯定，癌分化程度較低，有一定的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力。

本實(shí)驗(yàn)表明，用DEN+NMOR聯(lián)合誘導(dǎo)建立SD大鼠肝癌模型，操作簡便、成瘤周期較短，有一定的肺轉(zhuǎn)移率；病理過程遵循損傷、增生、硬化和肝癌發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的規(guī)律，可為研究肝癌的機(jī)制以及干預(yù)治療提供平臺(tái)。

【參考文獻(xiàn)】

［1］陳華,趙德明.肝癌動(dòng)物模型.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理,2005,22(4):32-35.

［2］YoshinoH,FutakuchiM,ChoYM,etal.ModificationofaninvivolungmetastasismodelofhepatocellularcarcinomabylowdoseNnitrosomorpholineanddiethylnitrosa