當(dāng)歸提取物的鑒定及鎮(zhèn)痛活性觀察

當(dāng)歸提取物的鑒定及鎮(zhèn)痛活性觀察【摘要】目的鑒定當(dāng)歸提取物的主要化學(xué)成分，并觀察其鎮(zhèn)痛作用。方法采用Molish反應(yīng)和Fehling實(shí)驗(yàn)反應(yīng)對(duì)當(dāng)歸提取物進(jìn)行鑒定，苯酚硫酸法測(cè)定其糖含量;采用小鼠扭體法和熱板法觀察當(dāng)歸提取物的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果當(dāng)歸提取物的主要成分為多糖，其糖含量為%，此提取物可明顯抑制醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)，提高小鼠痛覺(jué)反應(yīng)的痛閾。結(jié)論此當(dāng)歸提取物主要成分為多糖，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。

【關(guān)鍵詞】當(dāng)歸提取物;鑒定;多糖;鎮(zhèn)痛作用

ABSTRACT：ObjectiveToidentifyandanalyzethemaincompositionofAngelicaSinensisextractandtoinvestigateitsanalgesicTheidentificationtestwasprocessedwithMolishtestandFehlingtest,thepolysaccharidecontentanalysiswasprocessedbyphenolsulfuricacidreaction.Theanalgesiceffectwasinvestigatedbyaceticacid—inducedwringingtestandhotplateprocedureinThemaincompositionofAngelicaSinensisextractwaspolysaccharide,thepolysaccharidecontentofAngelicaSinensisextractwas%.Thefrequencyofwringingreactioninducedbyaceticacidwasobviouslydecreased,andthepainthresholdofmiceinthehotplateprocedurewasincreasedaftertheanimalswereadministeredwithAngelicaSinensisTheresultindicatesthatthemaincompositionofAngelicaSinensisextractispolysaccharide,anditpossessessignificantanalgesiceffect.

KEYWORDS：AngelicaSinensisextract;Identification;Polysaccharide;Analgesiceffect

當(dāng)歸AngelicaSinensis(Oliv.)Diels是祖國(guó)醫(yī)學(xué)中最常用的中藥材之一，可用于活血通經(jīng)、虛寒腹痛，亦可治跌打損傷。當(dāng)歸在歷代方劑中應(yīng)用頻度極高，已被證明具有復(fù)雜的生物活性[1~3]。我們從當(dāng)歸中提取到一種組分，對(duì)其主要成分進(jìn)行了初步鑒定，并觀察了其鎮(zhèn)痛作用。

1材料和方法

儀器與藥品

Savantecs100UVS400A冷凍真空干燥機(jī);RB200智能熱板儀，成都泰盟科技有限公司。葡萄糖對(duì)照品，Amresco。阿司匹林片，昆明制藥廠，臨用前取研碎后配制成12g/L的濃度。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠50只，雌性，體質(zhì)量20±2g，購(gòu)于湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

當(dāng)歸提取物的制備

當(dāng)歸100g，切片，乙醇回流后100℃沸水提取，提取液60℃減壓濃縮至60ml，加入95%乙醇3200ml，充分?jǐn)嚢瑁?20℃靜止48h后取上清，用乙酸乙酯萃取，收集水相，上大孔樹(shù)脂柱，分別用甲醇、乙醇、水過(guò)柱，收集水洗脫組分，60℃減壓濃縮后加入適量丙酮，4000rpm離心10min，收集沉淀，用水溶解后揮去溶劑，活性炭過(guò)濾，濾液-80℃冰箱預(yù)凍2天后于冷凍干燥機(jī)冷凍至干燥。

試劑制備

(1)Fehling試劑：CuSO4加水定容至，普通濾紙過(guò)濾;酒石酸鉀鈉與加水定容至，普通濾紙過(guò)濾。臨用前兩濾液等體積混合。

(2)5%苯酚試劑：取苯酚，加鋁片和，蒸餾，收集182℃餾分，稱(chēng)取，加水150ml溶解，置棕色瓶?jī)?nèi)冷藏備用。

(3)當(dāng)歸溶液：取凍干的當(dāng)歸提取物，分別配成/L、/L、/L的溶液，115℃滅菌30min后備用。

當(dāng)歸提取物的鑒定

(1)Molish反應(yīng)：取當(dāng)歸提取物，加水溶解，加2滴15%α萘酚乙醇溶液，混合搖勻后，沿管壁緩緩加入硫酸，將試管靜置10min后50℃水浴5min觀察在兩液面交界處有無(wú)紫紅色環(huán)出現(xiàn)。

(2)Fehling實(shí)驗(yàn)：取當(dāng)歸提取物，加水定容至200ml，取置試管中，加5%鹽酸液，沸水水浴15min，室溫靜止至冷，加酚酞指示劑1滴，用10%NaOH試液中和至中性，加Fehling試劑4～5滴，50℃水浴5min，觀察是否生成棕紅色沉淀。

多糖含量測(cè)定

按照文獻(xiàn)方法，精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品120mg，加水定容到100ml，得/ml葡萄糖貯備液，分別精密吸取葡萄糖貯備液、、、、、，定容至100ml，搖勻，分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,加入10ml試管中,加入5%苯酚溶液，旋渦混勻,迅速滴加濃硫酸5ml，旋渦混勻，60℃水浴加熱20min，室溫冷卻，另取1ml蒸餾水作空白對(duì)照，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

精密吸取當(dāng)歸提取物，用蒸餾水溶解定容至100ml，取該溶液100μl加入900μl蒸餾水使樣品液為1ml，加5%苯酚溶液，旋渦振蕩，迅速加濃硫酸，旋渦振蕩，60℃水浴20min，取出冷卻至室溫，于490nm處測(cè)定吸光度值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出當(dāng)歸提取物中總糖含量。

當(dāng)歸提取物的鎮(zhèn)痛作用

(1)當(dāng)歸提取物對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響。小鼠隨機(jī)分成5組，空白組，陽(yáng)性對(duì)照組，低劑量當(dāng)歸提取物組及中、高劑量組，每組10只。低、中、高劑量當(dāng)歸提取物組分別腹腔注射9g/L、18g/L、36g/L的當(dāng)歸提取物溶液，陽(yáng)性對(duì)照組按照300mg/kg給予阿斯匹林灌胃，空白組給予等量NS腹腔注射，給藥1h后，每只小鼠腹腔注射%醋酸溶液，記錄15min內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)。

(2)當(dāng)歸提取物對(duì)小鼠痛閾的影響。以熱板測(cè)痛儀測(cè)定動(dòng)物在(±)℃的基礎(chǔ)痛閾，低于10s或高于30s以及入儀器跳躍的小鼠剔除不用，記錄動(dòng)物放至熱板上至動(dòng)物出現(xiàn)舔足反應(yīng)的時(shí)間記為基礎(chǔ)痛閾。各組小鼠給藥1h后測(cè)定動(dòng)物痛閾，若動(dòng)物60s內(nèi)未出現(xiàn)舔足反應(yīng)，痛閾記為60s。

2結(jié)果

當(dāng)歸提取物的鑒定結(jié)果

Molish反應(yīng)：試液中有明顯紫紅色環(huán)出現(xiàn)，提示此當(dāng)歸提取物中含有糖類(lèi)物質(zhì)。

Fehling實(shí)驗(yàn)：試液中生成棕紅色沉淀，提示當(dāng)歸提取物中含有糖類(lèi)物質(zhì)。

當(dāng)歸提取物糖含量測(cè)定

以葡萄糖含量為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),得回歸方程為：A=+(r=),線性范圍6～60μg/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。將當(dāng)歸提取物溶液的OD490值代入回歸方程，求得當(dāng)歸提取物的糖含量為%。

當(dāng)歸提取物的鎮(zhèn)痛作用

熱板法觀察當(dāng)歸提取物對(duì)小鼠痛閾的影響，結(jié)果顯示高劑量當(dāng)歸提取物可明顯提高小鼠對(duì)熱刺激致痛的痛閾()，痛閾提高百分率為%，中劑量當(dāng)歸提取物雖可提高小鼠對(duì)熱刺激致痛的痛閾(痛閾提高百分比為%)但給藥前后配對(duì)檢驗(yàn)，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。阿司匹林對(duì)動(dòng)物痛閾提高率百分比為%，900mg/kg的當(dāng)歸提取物對(duì)動(dòng)物痛閾提高率雖較阿司匹林為高，但此兩組的組間比較沒(méi)有顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表1。表1熱板法觀察當(dāng)歸提取物對(duì)小鼠痛閾的影響

當(dāng)歸提取物對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響

中、高劑量當(dāng)歸提取物可明顯減少醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)(、)，高劑量當(dāng)歸提取物的扭體抑制率為%，接近阿司匹林(%)，高劑量當(dāng)歸提取物的抑制率雖高于中劑量當(dāng)歸提取物組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=)。低劑量的當(dāng)歸提取物并未對(duì)動(dòng)物的扭體反應(yīng)產(chǎn)生明顯影響。結(jié)果見(jiàn)表2。表2當(dāng)歸提取物對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響與空白組比較，*，**

3討論

多糖是廣泛存在于自然界的天然高分子化合物，由單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成。根據(jù)植物多糖溶于水、遇乙醇沉淀的性質(zhì)采用水提醇沉法提取植物多糖是最常用的提取方法[5~7]。從當(dāng)歸中提取多糖常用的方法是乙醇處理當(dāng)歸水提液，在水提液中含醇量達(dá)到80%時(shí)，幾乎可除去全部的蛋白質(zhì)和多糖、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)，對(duì)所得沉淀中進(jìn)行純化、分離，即可獲得當(dāng)歸總多糖(或稱(chēng)當(dāng)歸粗多糖)。

本文所涉及的當(dāng)歸提取物為當(dāng)歸水提液經(jīng)乙醇處理(含醇量80%)后的上清中提取到的組分，此提取物在Molish反應(yīng)中的二層界面出現(xiàn)紫色環(huán)，在Fehling實(shí)驗(yàn)中生成了棕紅色沉淀，均提示此當(dāng)歸提取物中含有糖類(lèi)物質(zhì)。

提取當(dāng)歸多糖時(shí)乙醇濃度一般控制在60%～80%,不同提取、分離方法從當(dāng)歸水提醇沉的沉淀中獲得的當(dāng)歸多糖組分的化學(xué)屬性存在很大差別。本文的當(dāng)歸提取物來(lái)源于當(dāng)歸水提組分中可溶解于80%的乙醇溶液的部分，而非來(lái)源于當(dāng)歸醇沉物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在傳統(tǒng)的水提醇沉法的上清液中仍含有多糖組分，這一部分當(dāng)歸多糖組分的分子量、單糖組成等化學(xué)屬性以及藥理學(xué)活性與來(lái)自于醇沉的沉淀中的多糖組分是否存在差別，尚待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此當(dāng)歸提取物能明顯提高小鼠對(duì)熱刺激致痛的痛閾，抑制小鼠對(duì)化學(xué)刺激致痛的扭體反應(yīng)。有研究報(bào)道從水提醇沉的沉淀中得到的當(dāng)歸總多糖也具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)，當(dāng)歸中的這兩個(gè)組分的藥理學(xué)活性是否存在差異，鎮(zhèn)痛機(jī)理如何，尚待進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究比較。

【參考文獻(xiàn)】

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