凝膠柱層析分析蛋白質(zhì)分子量大小

凝膠柱層析分析蛋白質(zhì)分子量大小第一頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日一.實驗目的

掌握凝膠層系的原理、測定蛋白質(zhì)分子量大小的方法熟悉并掌握分子實驗相關儀器的應用及操作第二頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日二.實驗原理層析技術(shù)：是利用混合物中各組分的物理化學性質(zhì)(分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等)的不同，使各組分以不同程度分布在兩相中，是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)所有的層析系統(tǒng)都由兩個相組成：固定相：是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分（可以為固體、液體）。流動相：即可以流動的物質(zhì)，如水和各種溶媒（可以為液體或氣體）第三頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日二.實驗原理名稱分離原理吸附層析法固定相是固體吸附劑，組份在吸附劑表面吸附力不同,疏水力或靜電引力分配層析法各組份在流動相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不同，溶解度離子交換層析法固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑親和力不同，離子間結(jié)合力凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同，排阻效應親和層析法固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，親和力按原理，層析分類第四頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日二.實驗原理—凝膠層析

凝膠層析，又稱為凝膠過濾、分子排阻層析或分子篩層析，是利用生物大分子相對的分子質(zhì)量差異進行層析分離的方法。凝膠顆粒內(nèi)部呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，篩孔直徑一致。待分離的物質(zhì)中，分子量大的分子分子直徑大，無法進入凝膠顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔穴內(nèi)，它會從凝膠顆粒的間隙里通過，因此流出速度快；分子量小的分子會進入凝膠顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔穴中穿行，因此流出速度慢

第五頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日第六頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日二.實驗原理—凝膠層析樣品中各組分的流出順序，可用分配系統(tǒng)Ka來量度Ka=(Ve-Vo)/ViVe：為洗脫體積，表示某一組分從層析柱洗出到最高峰出現(xiàn)時，所需的洗脫液體積Vo：外體積，為層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（可以用凝膠干重與濕重之差計算而得到）Vi：內(nèi)體積，為層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部微孔的體積（用分子量很大的物質(zhì)實際測量而計算得到）第七頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日二.實驗原理—凝膠層析

當某組分的Ka=0時(即Ve=Vo)，說明該組分完全不進入凝膠顆粒微孔，洗脫時最先流出若某組分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)時，說明該組分可自由地擴散進入凝膠顆粒內(nèi)部的微孔中，洗脫時，最后流出Ka在0-1之間的組分，洗脫時Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。在限定的條件下，Vi和Vo都是恒定值在一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用。當洗脫液的體積等于Vo+Vi時，所有組分都應該被洗脫出來，即Ka的最大值為1。然而在某種情況下Ka值會大于1。這種反?，F(xiàn)象說明這一層析過程不是單純的凝膠層析，其中可能還夾雜有吸附或離子交換等過程

第八頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關（Ve為洗脫體積）LogM=k1-k2Ve先測得幾種標準蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測V測第九頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日柱層析裝置

(恒流泵層析柱收集器主機記錄儀等5件套)

三.儀器和試劑第十頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日四.操作步驟裝柱：凝膠溶脹后，濕法裝柱，以柱床均勻、無氣泡表面平整為佳系統(tǒng)平衡：連接各裝置，用緩沖液洗滌柱子，并打開檢測器，使檢測器穩(wěn)定上樣：分別加標準分子量蛋白質(zhì)和1ml血清。洗脫、記錄結(jié)果計算及分析第十一頁，共十三頁，編輯于2023年，星期日注意事項要通過實驗合理調(diào)整流速、檢測器和記錄儀的靈敏度，和記錄儀的走紙速度，才能獲得良好的洗脫曲線若峰有重疊，宜加長柱子，降低流速若峰間距離過大，峰過寬，宜縮短柱子，加快流速，降低走紙速度峰過高，可減少加樣量，或降低檢測器和記錄儀的靈敏度峰過低則需加大靈敏度，或加大