抗氧化活性研究方法演示文稿

抗氧化活性研究方法演示文稿當前第1頁\共有16頁\編于星期五\0點優(yōu)選抗氧化活性研究方法當前第2頁\共有16頁\編于星期五\0點目錄一.檢測抗氧化活性的原因二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性三.檢測方法四.DPPH法（原理，一般方法，酶標法）五.ABTS法六.TBARS法七.鐵離子還原能力(FRAP)當前第3頁\共有16頁\編于星期五\0點一.檢測抗氧化活性的原因

1.天然植物中許多化學(xué)物質(zhì)具有抗氧化活性2.抗氧化劑有延緩衰老等功效，越來越受到人們關(guān)注3.據(jù)文獻記齊墩果酸型三萜有較好的抗氧化活性4.抗氧化活性測試簡單，快捷，經(jīng)濟當前第4頁\共有16頁\編于星期五\0點

二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性抗氧化劑自由基對人體造成的傷害天然植物當前第5頁\共有16頁\編于星期五\0點三.檢測方法目前常用的抗氧化活性檢測方法主要基于以下機理：(1)在特定條件下，樣品對檢測體系中脂類物質(zhì)的氧化抑制能力反映被測物的抗氧化活性；（TBARS法）(2)在特定條件下，樣品對檢測體系中自由基的清除能力反映被測物的抗氧化活性；（DPPH自由基的清除）(3)在特定條件下，測定樣品的還原能力反映被測物的抗氧化活性。（還原Fe3+）

當前第6頁\共有16頁\編于星期五\0點四.DPPH法1.原理

DPPH(二苯代苦味酰基自由基)是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基。

特點：醇溶液呈紫色，波長為517nm下具有最大吸收。具有單一電子，故能接受一個電子或氫離子，有自由基清除劑存在時，DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長處的吸光值下降,吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，從而以評價試驗樣品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率來表示，抑制率越大，抗氧化性越強。當前第7頁\共有16頁\編于星期五\0點實驗步驟

2.實驗步驟

（1）酶標法檢測——酶標儀取96孔細胞培養(yǎng)板，各孔分別加入150μmol·L-1的DPPH溶液180μL,各濃度梯度樣品溶液20μL,終濃度分別為3.9~500μmol·L-1，反應(yīng)總體積200μL,以溶劑作對照。加樣后，振蕩混勻。封板膠封板后，室溫下避光靜置。分別在10~120min時間范圍內(nèi)于517nm處測定各孔吸光度值。觀察樣品抗DPPH的時效量效變化過程，確定實驗的穩(wěn)定性和最佳實驗反應(yīng)時間。計算公式為:清除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A（溶劑）x100％當前第8頁\共有16頁\編于星期五\0點VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲線10-120min內(nèi),隨著作用時間的延長VitE抗DPPH作用增強，但在3.9-31.2μmol·L-1范圍內(nèi)，各時間點的藥效變化不明顯，62.5-500μmol·L-1濃度范圍，隨著濃度增加，各時間點的藥物作用曲線逐漸分離，并在500μmol·L-1，各時間點量效趨于平穩(wěn)。從圖中可以看出，在這些時間點中，30min的量效曲線基本呈斜線上升。30min當前第9頁\共有16頁\編于星期五\0點VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲線

反應(yīng)時間t為30min的量效曲線（相關(guān)系數(shù)）當前第10頁\共有16頁\編于星期五\0點實驗步驟（2）一般方法——紫外分光光度計法將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取0.1mL樣品加入3.5mLDPPH甲醇溶液(0.06mmol/L)，混合30min后測定515nm處吸光度。每份樣品平行操作3次。

計算公式為:清除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A（溶劑）x100％當前第11頁\共有16頁\編于星期五\0點酶標法優(yōu)勢3.酶標法優(yōu)勢

抗氧化微孔板實驗方法的優(yōu)勢：①耗材量少，試劑量以微升計；②試劑種類少，部分試劑配制可交互使用；③方法簡便，耗時短；④可重復(fù)性強，可以廣泛應(yīng)用于藥物篩選，特別是高通量藥物篩選研究。當前第12頁\共有16頁\編于星期五\0點五.ABTS法

1.原理以水溶性的ABTS+自由基引發(fā)劑為顯色劑。

特點：ABTS與過硫酸鉀反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍/綠色陽離子自由基ABTS+，最大吸光波長為734nm。

向ABTS+其中加入被測物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會與ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，然后在ABTS+這種自由基的734nm吸光波長下檢測吸光度的變化來反映物質(zhì)的抗氧化能力。當前第13頁\共有16頁\編于星期五\0點實驗步驟

2.實驗步驟將樣品用甲醇配制成一系列濃度,取0.15mL樣品加入2.85mLABTS自由基工作液，混合，放置10min后,在734nm處測定吸光度。每份樣品平行操作3次。計算公式為：清除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A（溶劑）×100％A（溶劑）為2.85mLABTS溶液與0.15mL甲醇混合后的吸度，A（樣品）為2.85mLABTS溶液與0.15mL樣品混合后的吸光度。

當前第14頁\共有16頁\編于星期五\0點ABTS法優(yōu)缺點3.優(yōu)缺點

簡便，快速，適合于大量樣品的檢測。

ABTS在與氫原子供體的反應(yīng)中選擇性差是此法的一個不足，它可與任何羥基化的芳香族化合物反應(yīng)，這與它們的實際抗氧化能力關(guān)，因此,TEAC值也包括對抗氧化不起作用的羥基。當前第15頁\共有16頁\編于星期五\0點六.TBARS法簡介脂質(zhì)體系中氧化反應(yīng)抑制或中止的判斷主要通過測量被氧化物的濃度，氧的去除或氧化產(chǎn)物的形成。因