豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定規(guī)程

豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定規(guī)程范圍本文件規(guī)定了豬腸外致病性大腸桿菌術(shù)語和定義、主要設備和材料、操作規(guī)程、結(jié)果報告和廢棄物無害化處理與人員安全防護。本文件適用于豬腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.38食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數(shù)GB4789.41食品安全國家標準食品微生物學檢驗腸桿菌科檢驗GB4789.6食品安全國家標準食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗GB19489實驗室生物安全通用要求SN/T2025動物檢疫實驗室生物安全操作規(guī)范SN/T2984檢驗檢疫動物病原微生物實驗活動生物安全要求細則術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。腸外致病性大腸桿菌ExtraintestinalpathogenicEscherichiacoli，ExPEC根據(jù)大腸桿菌致病性特征以及發(fā)病機制的不同，可將其分為共生型大腸桿菌、腸內(nèi)致病性大腸桿菌和腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）。ExPEC是一組不同種類的大腸桿菌，不僅可正常定殖于腸道，而且能侵入血液循環(huán)系統(tǒng)引起菌血癥，并誘發(fā)敗血癥或局部腸道外感染，如腦膜炎、關節(jié)炎、肺炎、心內(nèi)膜炎等。主要設備和材料4.1顯微鏡：10×～100×。4.2電子天平：感量0.1g。4.3恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃4.4冰箱：2℃～5℃。4.5無菌培養(yǎng)皿：直徑75nm或90mm。4.6無菌試管：12mm×100mm，15mm×150mm。4.7麥氏比濁管。4.8pH計、pH比色管或精密pH試紙。4.9飽和氯化鈉溶液：見附錄A中A.1。4.1030%甘油緩沖鹽水溶液：見附錄A中A.2。4.11麥康凱培養(yǎng)基（MAC）：按照GB4789.6中附錄A.3執(zhí)行。4.12革蘭氏染色液：按照GB4789.41中附錄B.6執(zhí)行。4.13三糖鐵（TSI）X脂斜面培養(yǎng)基：按照GB4789.6中附錄A.5執(zhí)行。4.14蛋白胨水和靛基質(zhì)試劑：按照GB4789.6中附錄A.6執(zhí)行。4.15緩沖葡萄糖蛋白胨水和甲基紅試劑、V-P試劑：按照GB4789.38中附錄A.4執(zhí)行。4.16枸櫞酸鹽培養(yǎng)基：按照GB4789.38中附錄A.5執(zhí)行。4.17LB固體培養(yǎng)基：見附錄A中A.3。4.18試驗小鼠：6~8周齡，體重18~22g，清潔級。4.19大腸桿菌O抗原單因子標準血清購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。5操作規(guī)程5.1操作流程ExPEC分離鑒定的流程示意圖見附錄B（資料性附錄）。5.2操作步驟樣品采集5.2.2.1病料樣品的采集：無菌操作采集病豬的肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、腦等腸外組織，或關節(jié)積液、心包積液。5.2.2.2病料樣品的保存與運輸：病料樣品采集后需延遲送檢的，可保存于飽和氯化鈉溶液或30%甘油緩沖鹽水溶液中，保存時間不超過72h。樣品均需采取低溫（0～4℃）保存和運輸。5.2.2細菌分離與純化無菌操作將病料樣品分別接種于麥康凱培養(yǎng)基（MAC），37℃培養(yǎng)18~24h，挑取疑似菌落（菌落呈鮮桃紅色或粉紅色，中等大小，直徑1.0~2.5mm，圓形，邊緣整齊，表面光滑）純化后進行大腸桿菌鑒定。腸外大腸桿菌鑒定形態(tài)特征鑒定：革蘭氏染色鏡檢。大腸桿菌為革蘭氏陰性直短桿菌，兩端鈍圓，無芽孢，多散在，也有成對排列。生化特性鑒定：先取純化菌落接種三糖鐵（TSI）X脂斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18~24h。大腸桿菌為斜面和底面均變黃或變紅，產(chǎn)氣，不產(chǎn)H2S。之后將純化菌落分別接種蛋白胨水、緩沖葡萄糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18~24h，進行吲哚試驗（I）、甲基紅試驗（MR）、V-P試驗（Vi）、枸櫞酸鹽利用試驗（C），簡稱IMViC試驗。大腸桿菌為IMViC＋＋－－。按照GB4789.38、GB4789.6執(zhí)行。腸外致病性大腸桿菌鑒定按照1株腸外大腸桿菌分離株說明。取10只健康狀態(tài)良好小鼠，分成試驗組和對照組，每組5只。將腸外大腸桿菌分離株制成濃度約為0.5麥氏比濁度的菌懸液，分別腹腔注射試驗組小鼠，每只0.3mL。對照組小鼠每只腹腔注射0.3mL用于稀釋菌液的無菌生理鹽水。注射后觀察3d內(nèi)小鼠精神狀況及死亡情況。若對照組小鼠均健活，試驗組小鼠出現(xiàn)精神萎靡，不進食，靜止抱團不活動，最后死亡的臨床癥狀，并將死亡的小鼠在無菌操作下取其肺臟、肝臟、脾臟組織分別接種于MAC，37℃培養(yǎng)24h，挑取大腸桿菌疑似菌落進行革蘭氏染色鏡檢，將符合大腸桿菌形態(tài)特征的細菌純化后接種TSI，并進行IMViC試驗，結(jié)果與接種菌株一致則說明腸外大腸桿菌分離株為ExPEC。腸外致病性大腸桿菌O抗原血清型鑒定見附錄C。腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進化群鑒定見附錄D。6結(jié)果報告6.1符合5.2.2，5.2.3，5.2.4，可確定為ExPEC。6.2符合6.1，且根據(jù)5.2.5，可確定為某種血清型的ExPCE。6.3符合6.1，且根據(jù)5.2.6，可確定為某種系統(tǒng)進化群的ExPCE。7廢棄物無害化處理與人員安全防護7.1ExPCE歸于腸桿菌科埃希氏菌屬，是一類能引起人畜腸道以外器官疾病的重要病原菌，至少攜帶2種或2種以上與腸道外組織感染相關的特定毒力基因，可引起人和動物泌尿系統(tǒng)感染、新生兒腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎等。7.2應按照GB19489、SN/T2984和SN/T2025的規(guī)定執(zhí)行。

附錄A（資料性附錄）培養(yǎng)基的配制A.1飽和氯化鈉溶液A.1.1成分氯化鈉38~39g蒸餾水100mL制法將38~39g氯化鈉加入100mL蒸餾水中，充分攪拌，待完全溶解混勻后，分裝于采樣管，每管5~10mL，121℃高壓滅菌15min備用。A.230%甘油緩沖鹽水溶液成分氯化鈉0.5g堿性磷酸鈉1.0g中性甘油30mL蒸餾水100mLA.2.2制法先將鹽類成分溶于水中，然后加入甘油，混勻，分裝于采樣管，每管5~10mL，121℃高壓滅菌15min備用。A.3LB固體培養(yǎng)基A.3.1成分胰蛋白胨10.0g酵母提取物5.0g氯化鈉10.0gX脂15.0g~20.0g蒸餾水1000mLA.3.2制法將A.3.1中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.4±0.2，121℃滅菌20min，待冷卻至50℃左右時傾注平板。

附錄B（資料性附錄）豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定流程圖B.1豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定流程

附錄C（資料性附錄）豬腸外致病性大腸桿菌O抗原血清型鑒定C.1ExPEC的O抗原制備將ExPEC接種于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18~24h，用3mL0.5%石炭酸生理鹽水將菌苔洗下，置于試管中，制成濃稠的懸液，121℃高壓滅菌2h，破壞其K抗原，即為O抗原，儲存于4℃?zhèn)溆?。C.2ExPEC的O抗原玻板凝集試驗取O抗原分別與大腸桿菌的O抗原單因子血清進行玻板凝集反應。即O抗原和O抗原單因子血清各取15μL在玻板上混勻，2min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應。同時以O抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象。玻板凝集試驗判定標準見表C.1。表C.1玻板凝集試驗判定標準反應強度判斷依據(jù)對應結(jié)果++++液體完全透明，出現(xiàn)大的凝集塊陽性+++液體幾乎完全透明，有明顯凝集塊陽性++液體不甚透明，有可見凝集塊陽性+液體渾濁，有小的顆粒狀物陰性-液體渾濁，無凝集現(xiàn)象陰性C.3ExPEC的O抗原的試管凝集試驗經(jīng)過玻板凝集試驗初步篩選可能的O血清型，然后通過試管凝集試驗確定其O血清型。定型標準為血清的試管凝集價≥1:640。其步驟如下：O抗原單因子定型血清的稀釋：采取倍比稀釋法。取潔凈試管8支并標記，每支試管用移液器加入0.5mL0.5%石炭酸生理鹽水。用移液器吸取1:10稀釋的大腸桿菌抗O因子血清0.5mL加入第1管，在管內(nèi)反復吹打6~8次，使血清與生理鹽水充分混合，然后吸取0.5mL加入第2管，同樣混合均勻后吸取0.5mL加入第3管，重復上次操作，直至第7管，混勻后從第7管中吸取0.5mL棄去。第8管不加血清作為對照。此時從第1管到第7管的血清稀釋倍數(shù)分別是1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280。加入抗原：向各支試管中分別加入0.5mLO抗原，此時血清稀釋倍數(shù)相應增大一倍。C.3.3抗原抗體反應：將各管混合液震蕩搖勻，置于37℃水浴鍋4h或在室溫中過夜，觀察結(jié)果。結(jié)果判定：（ⅰ）生理鹽水對照管中的抗原應分散，無凝集塊沉淀，并呈混濁懸液。（ⅱ）試驗管如有凝集，管底可見到凝集塊，液體上部澄清、半澄清或混濁度降低，管底凝集塊輕搖即浮起，呈片塊狀。（ⅲ）凝集強弱判斷（以“＋”表示）：確定抗體凝集效價時，應以出現(xiàn)“＋＋”（50%）凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度為抗血清的凝集價。“＋＋＋＋”液體完全透明，100%凝集，管底出現(xiàn)大片的傘狀沉淀，震蕩時呈大片絮狀，但可打碎成小絮片狀?！埃币后w幾乎透明，75%凝集，管底有明顯的傘狀沉淀，震蕩時呈小或大絮片狀?！埃币后w中等混濁，50%凝集，管底有中等量的傘狀沉淀，震蕩時呈小絮片狀。“＋”液體透明度不明顯，25%凝集，管底有少許不明顯的傘狀沉淀?！埃笨乖贵w不凝集，液體混濁、無透明度，管底無傘狀沉淀，但由于菌體自然下沉，管底中央出現(xiàn)圓點狀沉淀，震蕩時呈均勻混濁狀態(tài)。

附錄D（資料性附錄）豬腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進化群PCR鑒定D.1材料準備D.1.1主要儀器PCR擴增儀、1.5mL離心管、0.2mLPCR反應管、水浴鍋、高速冷凍離心機、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器、移液器吸管。D.1.2主要試劑2×PCRMasterMix、超純水、X脂糖、10mg/ML溴化乙錠（EB）、TBE緩沖液、上樣緩沖液（10×LoadingBuffer）、相對分子質(zhì)量Marker（DL-2000）。D.1.3引物序列豬腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進化群PCR鑒定用引物見表D.1。表D.1豬腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進化群PCR鑒定用引物檢測基因引物名稱引物序列（5'-3）片段長度（bp）chuAchuA-FchuA-RGACGAACCAACGGTCAGGATTGCCGCCAGTACCAAAGACA279yjaAyjaA-FyjaA-RTGAAGTGTCAGGAGACGCTGATGGAGAATGCGTTCCTCAAC211TspE4.C2TspE4.C2-FTspE4.C2-RGAGTAATGTCGGGGCATTCACGCGCCAACAAAGTATTACG152D.2操作步驟ExPEC基因組DNA的提取采用煮沸法。即取1mL培養(yǎng)20h的新鮮菌液加入1.5mL離心管中，以12000r/min離心5min，棄上清液，加入50μL超純水混均，置沸水中煮沸10min，之后冰浴5min，再煮沸5min，以12000r/min離心5min，取上清液即為DNA模板。D.2.2ExPEC的系統(tǒng)進化群分群基因PCR擴增檢測過程應同時做陽性和陰性空白對照。陽性對照模板為A、B1、B2、D群大腸桿菌，陰性空白對照為滅菌超純水。PCR反應體系：總體積為25μL，其中含有12.5μL的2×TaqPCRMasterMix，10μmol/L上、下游引物各1μL，1μg/LDNA模板2μL，滅菌超純水8.5μL。PCR反應程序：預變性94℃5min；變性94℃45s，退火60℃45s，延伸72℃50s，循環(huán)35次；72℃終延伸5min。D.2.3PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測用100ML1×TAE緩沖液制備1.0%X脂糖凝膠，加入5μL10mg/MLEB。取5μLPCR擴增產(chǎn)物與1μL10×LoadingBuffer混合后加入點樣孔進行電泳，電壓100V，電流100A，電泳30min。用凝膠成像