實(shí)驗(yàn)大腸菌群的檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)大腸菌群的檢驗(yàn)第一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆砧b別大腸菌群的方法。掌握以最大概率數(shù)法測(cè)定大腸菌群數(shù)量的方法。第二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)原理

大腸菌群指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，以此作為糞便污染指標(biāo)來評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品有否被腸道致病菌污染。食品中大腸菌群以100ml檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。第三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二第四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱：（36±1）℃顯微鏡培養(yǎng)皿

試管、移液管、三角燒瓶、小倒管天平載玻片第五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)試劑乳糖膽鹽發(fā)酵管：20g蛋白胨、5g豬膽鹽及10g乳糖溶于1L水中，校正pH為7.4，加25ml溴甲酚紫指示液(0.4g/L)，分裝每管20ml,

并放入一個(gè)小倒管，115℃高壓滅菌20

min。伊紅美藍(lán)瓊脂平板：10g蛋白陳、2gK2HPO4及17g瓊脂溶解于1L水中，校正pH至7.1，分裝于錐形瓶?jī)?nèi)，121℃高壓滅菌15min。臨用時(shí)加人10g乳糖并加熱溶化瓊脂，冷至50～55℃。加人20mL伊紅溶液（20g/L)和10ML美藍(lán)溶液（6.5g/L）搖勻，傾注平板。第六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二乳糖發(fā)酵管：

將20g蛋白陳和10g乳糖溶于1L水中，校正pH至7.4，加入25mL溴甲酚紫指示液(0.4g/L)，按檢驗(yàn)要求分裝，并放人一個(gè)小倒管，加熱至115℃高壓滅菌15min滅菌生理鹽水：0.9％第七頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二革蘭氏染色液：

①結(jié)晶紫染色液：1g結(jié)晶紫溶于20mL95%乙醇，與80mL草酸銨溶液（10g/L)混合，搖勻。②革蘭氏碘液：1g碘與2g碘化鉀混合后，用少量水溶解，稀釋至300mL。③沙黃復(fù)染液：0.25g沙黃溶于10ml95%乙醇中，然后用90ml水稀釋，混勻。第八頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟1）檢樣稀釋（無菌操作）①將25mL（或g）檢樣置于含225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶，充分振搖（固體檢樣用勻漿器，用8000－10000r/min的速度處理1min）制成1：10的均勻稀釋液。②用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，混勻，制成1：100的稀釋液。③另取1mL滅菌試管，按②操作依次做10倍遞增稀釋液，每稀釋一次，換用一支1mL滅菌試管。第九頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二2）乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)接種2mL待檢樣品于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)。接種3個(gè)稀釋度，每一稀釋度接種3管，置（36土1)℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)（24士2)h。如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸桿菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。第十頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二3）分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)接在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置（36士1)℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18一24h。取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。第十一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二4）證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1一2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置（36士1)℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（24士2)h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽袍桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。第十二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)報(bào)告

根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL（或g）大腸菌群的MPN。第十三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二第十四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二第十五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二第十六頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二第十七頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二注：①本表采用3個(gè)稀釋度：1ML(g)，0.1mL(g）和0.01mL(g)。每稀釋度3管。②表內(nèi)所列檢樣量如改用10mL(g)，1mL(g）和0.1mL(g）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.1ML(g),0.01ML(g）和0.001mL(g）時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加10倍，其余可類推。第十八頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法附1：平板劃線接種方法第十九頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二第二十頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二第二十一頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二第二十二頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二附2：革蘭氏染色法操作步驟1、涂片：取大腸桿菌制成涂片，干燥，固定。2、染色：用草酸銨結(jié)晶紫染色1min,用水沖洗。3、媒染：滴加革蘭氏碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋1min，用水沖去碘液。4、乙醇脫色：斜置載玻片于一燒杯上，滴加95%乙醇，并輕輕搖動(dòng)載片，至乙醇液不呈現(xiàn)紫色時(shí)停止（約0.5min）。立即用水沖凈乙醇并用濾紙輕輕吸干。脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵，必須嚴(yán)格掌握乙醇的脫色程度。若脫色過度則陽性菌被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)陰性菌被誤染為陽性菌。第二十三頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二5、復(fù)染：蕃紅染液復(fù)染1min,水洗。6、吸干并鏡檢：若研究工作中要確證未知菌的革蘭氏反應(yīng)時(shí)，則需同時(shí)用已知菌進(jìn)行染色作對(duì)照。第二十四頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二步驟：結(jié)果:

陽性菌——紫色陰性菌——紅色結(jié)晶紫初染碘液媒染乙醇脫色蕃紅復(fù)染涂片固定革蘭氏染色法（GramStain）第二十五頁，共二十八頁，編輯于2023年，星期二細(xì)菌經(jīng)結(jié)晶紫初染染成紫色。

革蘭氏染色陽性菌（G+）細(xì)胞壁肽聚糖層數(shù)多，為空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，再經(jīng)乙醇脫水，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為致密，染料復(fù)合物不易從細(xì)胞內(nèi)漏出，仍為紫色。

革蘭氏染色陰性菌（G-）細(xì)胞壁脂類含量多，肽聚糖層數(shù)少，為平面片層結(jié)構(gòu)，易被乙醇溶解，使細(xì)胞壁通透性增高，結(jié)合的染料復(fù)合物容易泄漏，細(xì)菌被脫色為無色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染成紅色。第二十六頁，共二十八頁，編輯于