系統(tǒng)生物學(xué)-第三講-轉(zhuǎn)錄組學(xué)課件

第三講轉(zhuǎn)錄組學(xué)1PPT學(xué)習(xí)交流主要內(nèi)容RNA的種類和作用RNA研究方法高通量技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)的策略轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展microRNA研究2PPT學(xué)習(xí)交流RNA是解讀基因組的關(guān)鍵RNAProteinPhenotypeGenotype

DNA3PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄（transcription）

生物體以DNA為模板合成RNA的過(guò)程。

轉(zhuǎn)錄RNADNA

4PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄（Transcription）：遺傳信息由DNA轉(zhuǎn)換到RNA的過(guò)程。作為蛋白質(zhì)生物合成的第一步，轉(zhuǎn)錄是mRNA以及非編碼RNA（tRNA、rRNA等）的合成步驟。以特定的DNA片段作為模板，以DNA依賴的核糖核酸聚合酶（RNA聚合酶或RNA合成酶）作為催化劑而合成前mRNA的過(guò)程。mRNA轉(zhuǎn)錄時(shí)，DNA分子雙鏈打開(kāi)，在RNA聚合酶的作用下，游離的4種核糖核苷酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合到DNA單鏈上，并在RNA聚合酶的作用下形成單鏈mRNA分子。轉(zhuǎn)錄本：transcript。也稱為剪切體。一條基因通過(guò)不同剪接可構(gòu)成不同的轉(zhuǎn)錄本。5PPT學(xué)習(xí)交流參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料:NTP（ATP,UTP,GTP,CTP）模板:DNA酶:RNA聚合酶（RNApolymerase,RNA-pol）其他蛋白質(zhì)因子6PPT學(xué)習(xí)交流一、RNA的種類和作用1.RNA的種類2.各類RNA的作用7PPT學(xué)習(xí)交流RNA的常見(jiàn)種類1.核糖體RNA（rRNA）2.轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）3.信使RNA（mRNA）8PPT學(xué)習(xí)交流RNA的其他種類1.不均一核RNA（hnRNA）2.小核RNA（snRNA）3.核仁小RNA（snoRNA）4.小胞質(zhì)RNA（scRNA/7s-RNA)5.microRNA6.轉(zhuǎn)移-信使RNA（tmRNA）7.端粒酶RNA8.反義RNA……9PPT學(xué)習(xí)交流核糖體RNA（rRNA）1.rRNA是核糖體的組成成分

rRNA一般與核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，形成核糖體（ribosome)如果把rRNA從核糖體上除掉，核糖體的結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生塌陷。

2.定位（起始翻譯）

16S的rRNA3’端有一段核苷酸序列與mRNA的前導(dǎo)序列是互補(bǔ)的，這有助于mRNA與核糖體的結(jié)合，進(jìn)而起始翻譯。核糖體RNA，原核生物包括5s，16s，23s，真核生物包括5s，5.8s，18s和28s，而每種rRNA各自有各自的功能。10PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）

在蛋白質(zhì)合成中作為氨基酸的載體

合成i蛋白質(zhì)的原材料——20種氨基酸與mRNA的堿基之間缺乏特殊的親和力。因此，必須用一種特殊的RNA——轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）把氨基酸搬運(yùn)到核糖體上，tRNA能根據(jù)mRNA的遺傳密碼依次準(zhǔn)確地把它攜帶的氨基酸連結(jié)起來(lái)形成多肽鏈。11PPT學(xué)習(xí)交流信使RNA（mRNA）

作為蛋白質(zhì)合成時(shí)的模板

mRNA是以DNA的一條鏈為模板，以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈。其功能就是把DNA上的遺傳信息精確無(wú)誤地轉(zhuǎn)錄下來(lái)，然后再由mRNA的堿基順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序，完成翻譯，合成蛋白質(zhì)。

12PPT學(xué)習(xí)交流不均一核RNA（hnRNA）概念：在真核生物中，轉(zhuǎn)錄形成的前體RNA中含有大量非編碼序列，大約只有25%序列經(jīng)加工成為mRNA，最后翻譯為蛋白質(zhì)。而因?yàn)槲唇?jīng)加工的前體mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差別很大，所以通常稱為不均一核RNA。hn-RNA在受到加工之后，移至細(xì)胞質(zhì)，作為mRNA而發(fā)揮其功能。而大部分的hnRNA在核內(nèi)與各種特異的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體而存在著。13PPT學(xué)習(xí)交流小核RNA（snRNA）概念：小核RNA，也見(jiàn)譯為核內(nèi)小RNA，是含有100到300堿基的RNA，它是真核生物轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程中RNA剪接體的主要成分。功能：它參與真核生物細(xì)胞核中RNA的加工。snRNA和許多蛋白質(zhì)結(jié)合在一起成為小核核糖核蛋白，參與信使RNA前體（也就是hnRNA）的剪接，使后者成為成熟mRNA。14PPT學(xué)習(xí)交流核仁小RNA（snoRNA）

概念：核仁小分子RNA是一大類RNA分子，其大小一般在幾十到幾百個(gè)核苷酸，它們能與特定的蛋白質(zhì)（如自身免疫抗原等）相結(jié)合生成snoRNP，在細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且富集于核仁區(qū)，所以被稱為核仁小分子RNA。功能：負(fù)責(zé)rRNA的加工（切割和修飾），參與核糖體的生物合成。15PPT學(xué)習(xí)交流小胞質(zhì)RNA（scRNA/7s-RNA)存在于細(xì)胞質(zhì)中的小RNA分子（如信號(hào)識(shí)別顆粒組分中含有的7sRNA）,是蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號(hào)識(shí)別體的組成。16PPT學(xué)習(xí)交流小RNA分子有些小RNA分子能直接調(diào)控某些基因的開(kāi)關(guān)從而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育并決定細(xì)胞分化的組織類型小RNA分子本身又包含了若干類RNA，根據(jù)小RNA的生成、結(jié)構(gòu)和功能大約可分為以下三類：miRNA（microRNA)siRNA(smallinterferingRNA)其他小RNA17PPT學(xué)習(xí)交流microRNA概念：

MicroRNAs(miRNAs)是一種大小約21—23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成。不同于siRNA，但是和siRNA密切相關(guān)。功能：microRNA通過(guò)與相應(yīng)的蛋白結(jié)合，形成一個(gè)“RNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默復(fù)合體”。該復(fù)合體主要有4個(gè)作用：1.降解靶mRNA；2.抑制mRNA的翻譯；3.在細(xì)胞核內(nèi)募集組蛋白脫乙?；傅纫蜃?，沉默DNA的表達(dá)；4.擴(kuò)增相應(yīng)的microRNA。

對(duì)一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞死亡，脂肪代謝和細(xì)胞分化。18PPT學(xué)習(xí)交流第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA——在線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7，可以通過(guò)部分互補(bǔ)結(jié)合到目的mRNA靶的3’非編碼區(qū)(3’UTRs)，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)合成，通過(guò)調(diào)控一組關(guān)鍵mRNAs的翻譯從而調(diào)控線蟲(chóng)發(fā)育進(jìn)程。繼線蟲(chóng)之后，隨后多個(gè)研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個(gè)miRNAs。

19PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)移-信使RNA（tmRNA）tmRNA是一類具有類似tRNA分子和mRNA分子雙重功能的小分子RNA，它在一種特殊的翻譯模式――反式翻譯模式過(guò)程中發(fā)揮重要作用。最近又發(fā)現(xiàn)它與基因的表達(dá)調(diào)控及細(xì)胞周期的調(diào)控等生命過(guò)程密切相關(guān)。反式翻譯是細(xì)菌體內(nèi)一種修復(fù)翻譯水平上受阻的遺傳信息表達(dá)過(guò)程的機(jī)制。20PPT學(xué)習(xí)交流端粒酶RNA端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，是染色體端粒的RNA序列。

功能：端粒酶是真核生物端粒復(fù)制的模板，它可以使用其部分RNA作為模板來(lái)合成端粒重復(fù)單元。在大多數(shù)真核生物中，染色體末端DNA的逐步丟失會(huì)被端粒酶所抑制。在具有端粒酶活性的細(xì)胞內(nèi)，它的任務(wù)是作為反轉(zhuǎn)錄的模板然后加在端粒的末端以解決染色體因復(fù)制而變短的問(wèn)題。這種酶在大多數(shù)細(xì)胞里是沒(méi)有活性的，但在某些腫瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，干細(xì)胞以及生殖細(xì)胞里活性較高。21PPT學(xué)習(xí)交流反義RNA(antisenseRNA）反義RNA(antisenseRNA)，可通過(guò)與靶位序列互補(bǔ)而與之結(jié)合的RNA，或直接阻止靶序列功能,或改變靶部位構(gòu)象而影響其功能。22PPT學(xué)習(xí)交流RNA分析方法

23PPT學(xué)習(xí)交流mRNA檢測(cè)技術(shù)核酸雜交技術(shù)原位雜交逆轉(zhuǎn)錄PCR(ReversetranscriptionPCR，RT-PCR)RACE24PPT學(xué)習(xí)交流northernblot25PPT學(xué)習(xí)交流放射性同位素標(biāo)記物α-32P-dCTP靈敏度達(dá)0.01pg非放射性標(biāo)記物地高辛靈敏度達(dá)0.1pgDIG-dUTP-----通過(guò)酶促反應(yīng)摻入到DNA/RNA中去制成探針----雜交----加抗地高辛-酶的復(fù)合物—加底物—顯色

探針制備26PPT學(xué)習(xí)交流探測(cè)不同條件下的基因表達(dá)變化B.WITEK-ZAWADA,200328SrRNA18SrRNA27PPT學(xué)習(xí)交流FISH：FluorescenceInSituHybridization原位雜交28PPT學(xué)習(xí)交流原位雜交MorozLL,200629PPT學(xué)習(xí)交流30PPT學(xué)習(xí)交流RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR31PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄本All

transcripts

All

mRNAs32PPT學(xué)習(xí)交流DNARNA蛋白質(zhì)基因組學(xué)RNA組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)33PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄組概念由Velculescu等在1995年首次提出。轉(zhuǎn)錄組：廣義上指一個(gè)細(xì)胞內(nèi)基因組DNA轉(zhuǎn)錄得到的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以及轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞特定發(fā)育時(shí)期或特定生理?xiàng)l件下的表達(dá)水平，包括編碼RNA（mRNA）和非編碼RNA（如tRNA、rRNA、snRNA、miRNA等），狹義上指所有mRNA的集合。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，是解讀基因組功能原件和揭示細(xì)胞及組織分子組成所必需的。34PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄組的特點(diǎn)：受到內(nèi)外多種因素的調(diào)節(jié)，因而是動(dòng)態(tài)可變的。能夠揭示不同物種、不同個(gè)體、不同細(xì)胞、不同發(fā)育階段及不同生理病理狀態(tài)下的基因差異表達(dá)信息。35PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Transcriptomics）：研究細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的類型與拷貝數(shù)；比較不同功能狀態(tài)下mRNA表達(dá)的變化，搜尋與功能狀態(tài)變化緊密相關(guān)的重要基因群。36PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄組研究的主要目的發(fā)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)錄本種類確定基因結(jié)構(gòu)確定基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因37PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)主要包括:表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）表達(dá)系列分析（SAGE）基因芯片(Chip)高通量測(cè)序技術(shù)(NGS)38PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA_Seq的重要分支RNA_Seq是指針對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的測(cè)序技術(shù)，主要有以下分支：轉(zhuǎn)錄組分析表達(dá)譜分析小RNA分析降解組測(cè)序針對(duì)mRNA的測(cè)序轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是針對(duì)特定樣品特定時(shí)期的轉(zhuǎn)錄mRNA的測(cè)序技術(shù)，重點(diǎn)在對(duì)翻譯蛋白的mRNA的測(cè)序研究。39PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的特點(diǎn)應(yīng)用對(duì)象靈活廣泛針對(duì)不同物種，不同個(gè)體，不同時(shí)期，都可以在mRNA水平準(zhǔn)確的分析性狀或功能差異，結(jié)構(gòu)變異等信息。研究范圍多樣化從未知基因組物種，到研究成熟的人體病變組織，小鼠組織等特異組織，均可通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)行研究。研究深度多樣化從大規(guī)模功能轉(zhuǎn)錄本發(fā)掘到特定基因的可變剪接的不同功能分析，都可以定位研究。40PPT學(xué)習(xí)交流表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)測(cè)定及分析1、什么是EST?2、EST的應(yīng)用

3、EST序列測(cè)定及分析過(guò)程41PPT學(xué)習(xí)交流(2)什么是表達(dá)序列標(biāo)簽?

（expressedsequencetag,EST）

從已建好的cDNA庫(kù)中隨機(jī)取出一個(gè)克隆，從5′末端或3′末端進(jìn)行一輪單向自動(dòng)測(cè)序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列?；蚪M表達(dá)為RNA的序列:mRNA和功能RNA1、表達(dá)序列與表達(dá)序列標(biāo)簽概念(1)什么是表達(dá)序列?42PPT學(xué)習(xí)交流EST的獲得途徑43PPT學(xué)習(xí)交流cDNA文庫(kù)構(gòu)建非標(biāo)準(zhǔn)化的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。（可用于基因表達(dá)量的分析）◆經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化或扣除雜交處理的cDNA文庫(kù)。（富集表達(dá)豐度較低的基因）◆Oligod(T)cDNA文庫(kù)。（非翻譯區(qū)由于不含有編碼序列，與編碼區(qū)保守序列相比所受到的選擇壓力比較小，因而其多態(tài)性程度比較高，便于多態(tài)性位點(diǎn)的選擇以用于遺傳圖譜的構(gòu)建。）◆隨機(jī)引物cDNA文庫(kù)。（所獲得的EST在基因功能的鑒定時(shí)具有更多的信息含量，并且在構(gòu)建EST數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)更有優(yōu)勢(shì)，同時(shí)有利于利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)聚類完整的基因和閱讀框的尋找，便于利用更敏感的蛋白質(zhì)比較來(lái)尋找同源基因。）44PPT學(xué)習(xí)交流cDNA文庫(kù)構(gòu)建常見(jiàn)問(wèn)題RNA得率低mRNA分離效率低cDNA產(chǎn)物少原因：多糖、多酚、內(nèi)源性核酸蛋白酶、miRNA等45PPT學(xué)習(xí)交流原因多糖-糖蛋白(核酸蛋白酶，植物血凝素等)、多酚類等次生代謝產(chǎn)物在RNA分離時(shí)，經(jīng)常與RNA共沉降，導(dǎo)致RNA丟失?；?qū)е路蛛x后的RNA嚴(yán)重不純，影響mRNA分離的得率。內(nèi)源性核酸酶存在較多的情況下，可降解雙鏈DNA、RNA或者DNA-RNA雜合體，致使RNA易降解，轉(zhuǎn)錄后的DNA接頭無(wú)法連接，是cDNA得率低的原因之一。miRNA的存在導(dǎo)致mRNA的降解46PPT學(xué)習(xí)交流大規(guī)模EST序列測(cè)定的開(kāi)始1983年：Costanzo等提出EST概念的雛形1991年：Adams測(cè)定了三種人腦組織共609條EST，宣布

了cDNA大規(guī)模測(cè)序的時(shí)代的開(kāi)始代1991年：Okubo等提出大規(guī)模cDNA測(cè)序的研究戰(zhàn)略1993年：Venter等創(chuàng)立現(xiàn)在的EST技術(shù)1993年：Boguski&Schuler提出以EST為界標(biāo)的人類基因組轉(zhuǎn)錄圖譜計(jì)劃47PPT學(xué)習(xí)交流

●●93年前ESTs數(shù)據(jù)收錄于GenBank，EBI和DDBJ?！?993年NCBI(NationalCenterofBiotechnologyInformation)建立了一個(gè)專門的EST數(shù)據(jù)庫(kù)dbEST來(lái)保存和收集所有的EST數(shù)據(jù)?！?5年中期GenBank中EST的數(shù)目超過(guò)了非EST的數(shù)目?！瘳F(xiàn)在GenBank中EST的數(shù)目已經(jīng)超過(guò)了三千五百萬(wàn)，約占GenBank中序列數(shù)的60%.48PPT學(xué)習(xí)交流EST數(shù)量排名前10的物種Organism ESTsHomosapiens(human) 8,301,471Musmusculus+domesticus(mouse)4,852,146Zeamays(maize) 2,018,798Bostaurus(cattle) 1,620,962Arabidopsisthaliana(thalecress) 1,559,485Daniorerio(zebrafish) 1,527,299Glycinemax(soybean) 1,481,930Xenopustropicalis(westernclawedfrog)1,422,983Oryzasativa(rice) 1,271,375Cionaintestinalis（玻璃海鞘）1,249,11049PPT學(xué)習(xí)交流EST技術(shù)流程體內(nèi)：翻譯體外研究：反轉(zhuǎn)錄連接，轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化效率問(wèn)題（基因芯片）文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)已經(jīng)成熟測(cè)序采樣問(wèn)題（SAGE）測(cè)序成本已經(jīng)大大降低大數(shù)據(jù)量分析理念已經(jīng)形成50PPT學(xué)習(xí)交流ESTs的應(yīng)用ESTs與基因識(shí)別

ESTs已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于基因識(shí)別，因?yàn)镋STs的數(shù)目比GenBank中其它的核苷酸序列多，研究人員更容易在EST庫(kù)中搜尋到新的基因(Boguskietal.,1994).

在同一物種中搜尋基因家族的新成員(paralogs)。

在不同物種間搜尋功能相同的基因(orthologs)。

已知基因的不同剪切模式的搜尋?！咀ⅲ翰贿^(guò)很難確定一個(gè)新的序列是由于交替剪切產(chǎn)生的或是由于cDNA文庫(kù)中污染了基因組DNA序列(Wolfsbergetal.,1997)】51PPT學(xué)習(xí)交流ESTs與基因圖譜的繪制

EST可以借助于序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence-taggedsites)用于基因圖譜的構(gòu)建.STS本身是從人類基因組中隨機(jī)選擇出來(lái)的長(zhǎng)度在200-300bp左右的經(jīng)PCR檢測(cè)的基因組中唯一的一段序列。來(lái)自mRNA的3’非翻譯區(qū)的ESTs更適合做為STSs，用于基因圖譜的繪制。其優(yōu)點(diǎn)主要包括：●由于沒(méi)有內(nèi)含子的存在，因此在cDNA及基因組模板中其PCR產(chǎn)物的大小相同；●與編碼區(qū)具有很強(qiáng)的保守性不同，3’UTRs序列的保守性較差，因此很容易將單個(gè)基因與編碼序列關(guān)系非常緊密的相似基因家族成員分開(kāi)。（JamesSikela等，1991年）52PPT學(xué)習(xí)交流ESTs與基因預(yù)測(cè)由于EST來(lái)源于cDNA，因此每一條EST均代表了文庫(kù)建立時(shí)所采樣品特定發(fā)育時(shí)期和生理狀態(tài)下的一個(gè)基因的部分序列。使用合適的比對(duì)參數(shù)，大于90％的已經(jīng)注釋的基因都能在EST庫(kù)中檢測(cè)到(Baileyetal.,1998)。ESTs可以做為其它基因預(yù)測(cè)算法的補(bǔ)充，因?yàn)樗鼈儗?duì)預(yù)測(cè)基因的交替剪切和3‘非翻譯區(qū)很有效。53PPT學(xué)習(xí)交流ESTs與SNPs

來(lái)自不同個(gè)體的冗余的ESTs可用于發(fā)現(xiàn)基因組中轉(zhuǎn)錄區(qū)域存在的SNPs。最近的許多研究都證明對(duì)ESTs數(shù)據(jù)的分析可以發(fā)現(xiàn)基因相關(guān)的SNPs(Buetowetal.,1999;Gargetal.,1999;Marthetal.,1999;Picoult-Newbergetal.,1999)。應(yīng)注意區(qū)別真正的SNPs和由于測(cè)序錯(cuò)誤(ESTs為單向測(cè)序得來(lái)，錯(cuò)誤率可達(dá)2％)而引起的本身不存在的SNPs。解決這一問(wèn)題可以通過(guò)：●提高ESTs分析的準(zhǔn)確性?！駥?duì)所發(fā)現(xiàn)的SNPs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。54PPT學(xué)習(xí)交流利用ESTs大規(guī)模分析基因表達(dá)水平

因?yàn)镋ST序列是從某以特定的組織的cDNA文庫(kù)中隨機(jī)測(cè)序而得到，所以可以用利用未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化和差減雜交的cDNA文庫(kù)EST分析特定組織的基因表達(dá)譜。標(biāo)準(zhǔn)化的cDNA文庫(kù)和經(jīng)過(guò)差減雜交的cDNA文庫(kù)則不能反應(yīng)基因表達(dá)的水平。◆

CGAP

為研究癌癥的分子機(jī)理，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所NCI的癌癥基因組解析計(jì)劃(CancerGenomeAnatomyProject,CGAP)構(gòu)建了很多正常的或是癌癥前期的和癌癥后期的組織的cDNA文庫(kù)，并進(jìn)行了大規(guī)模的EST測(cè)序，其中大部分的文庫(kù)未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化或差減雜交處理?！艋虮磉_(dá)系列分析(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)

基因表達(dá)系列分析是一種用于定量，高通量基因表達(dá)分析的實(shí)驗(yàn)方法(Velculescuetal.,1995)。SAGE的原理就是分離每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的特定位置的較短的單一的序列標(biāo)簽（約9-21個(gè)堿基對(duì)），這些短的序列被連接、克隆和測(cè)序，特定的序列標(biāo)簽的出現(xiàn)次數(shù)就反應(yīng)了對(duì)應(yīng)的基因的表達(dá)豐度。◆

DNA微陣列或基因芯片的研究高密度寡核苷酸cDNA芯片或cDNA微陣列是一種新的大規(guī)模檢測(cè)基因表達(dá)的技術(shù)，具有高通量分析的優(yōu)點(diǎn)。在許多情況下，cDNA芯片的探針來(lái)源于3'EST(Dugganetal.,1999)，所以EST序列的分析有助于芯片探針的設(shè)計(jì)。55PPT學(xué)習(xí)交流ESTs數(shù)據(jù)的不足ESTs很短，沒(méi)有給出完整的表達(dá)序列；低豐度表達(dá)基因不易獲得。由于只是一輪測(cè)序結(jié)果，出錯(cuò)率達(dá)2%-5%；有時(shí)有載體序列和核外mRNA來(lái)源的cDNA污染或是基因組DNA的污染；有時(shí)出現(xiàn)鑲嵌克?。恍蛄械娜哂?，導(dǎo)致所需要處理的數(shù)據(jù)量很大。56PPT學(xué)習(xí)交流EST數(shù)據(jù)庫(kù)1993年前：EST收錄于GenBank，EBI和DDBJ1993年NCBI建立dbEST57PPT學(xué)習(xí)交流常用的EST數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)名稱網(wǎng)址說(shuō)明dbEST綜合UniGene綜合GeneIndices綜合58PPT學(xué)習(xí)交流（1）dbEST（databaseofEST）

Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的一部分描述：Publication文件：文獻(xiàn)文件，文獻(xiàn)發(fā)表信息Library文件：文庫(kù)文件，實(shí)驗(yàn)信息Contact文件：聯(lián)系人文件，聯(lián)系信息EST文件：EST數(shù)據(jù)文件，核心數(shù)據(jù)59PPT學(xué)習(xí)交流（2）UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的一部分一條紀(jì)錄為一個(gè)genecluster簡(jiǎn)介查詢UniGene通過(guò)NCBIFtp下載：使用dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索60PPT學(xué)習(xí)交流（3）GeneIndices數(shù)據(jù)庫(kù)

TheInstituteofGenomicResearchDatabase（TIGR）中的一個(gè)子庫(kù)

簡(jiǎn)介數(shù)據(jù)構(gòu)成42類動(dòng)物47類植物15類原生生物10類真菌61PPT學(xué)習(xí)交流EST數(shù)據(jù)分析方法隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行5′或3′端測(cè)序序列前處理聚類和拼接基因注釋及功能分類62PPT學(xué)習(xí)交流去除低質(zhì)量的序列（如使用Phred）應(yīng)用BLAST、RepeatMasker或Crossmatch屏蔽數(shù)據(jù)組中不屬于表達(dá)基因的贗象序列(artifactualsequences)

●

載體序列()

●重復(fù)序列(RepBase，)

●污染序列(如核糖體RNA、細(xì)菌或其他物種的基因組DNA等)去除其中的嵌合克隆最后去除長(zhǎng)度小于100bp的序列（1）序列前處理63PPT學(xué)習(xí)交流聚類目的：將來(lái)自同一個(gè)基因或同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的具有重疊部分(over-lapping)的ESTs整合至單一的簇(cluster)中聚類作用：

●產(chǎn)生較長(zhǎng)的一致性序列(contigs)，用于注釋●降低數(shù)據(jù)的冗余，糾正錯(cuò)誤數(shù)據(jù)?！窨梢杂糜跈z測(cè)選擇性剪切。ESTs聚類的數(shù)據(jù)庫(kù)主要有三個(gè)：●UniGene()●TIGRGeneIndices()●STACK()（2）ESTs的聚類64PPT學(xué)習(xí)交流ESTs的聚類和拼接

聚類的目的就是將來(lái)自同一個(gè)基因或同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的具有重疊部分(over－lapping)的ESTs整合至單一的簇(cluster)中。聚類作用：產(chǎn)生較長(zhǎng)的一致性序列(consensussequence)，用于注釋。降低數(shù)據(jù)的冗余，糾正錯(cuò)誤數(shù)據(jù)。可以用于檢測(cè)選擇性剪切?；虮磉_(dá)譜分析ESTs聚類的數(shù)據(jù)庫(kù)主要有三個(gè)：

UniGene()TIGRGeneIndices()STACK()

65PPT學(xué)習(xí)交流不嚴(yán)格的和嚴(yán)格的聚類(looseandstringentclustering)◆looseclustering●產(chǎn)生的一致性序列比較長(zhǎng)●表達(dá)基因ESTs數(shù)據(jù)的覆蓋率高●含有同一基因不同的轉(zhuǎn)錄形式，如各種選擇性剪接體●每一類中可能包含旁系同源基因(paralogousexpressedgene)的轉(zhuǎn)錄本●序列的保真度低◆stringentclustering●產(chǎn)生的一致性序列比較短●表達(dá)基因ESTs數(shù)據(jù)的覆蓋率低●因此所含有的同一基因的不同轉(zhuǎn)錄形式少●序列保真度高

66PPT學(xué)習(xí)交流(ESTclusteringtutorial,)有參照的和無(wú)參照的聚類(Supervisedandunsupervisedclustering)◆Supervisedclustering

根據(jù)已知的參考序列(如全長(zhǎng)mRNA、已拼接好的一致性序列)聚類?！?/p>

Unsupervisedclustering

沒(méi)有根據(jù)參考序列進(jìn)行分類。

67PPT學(xué)習(xí)交流Cluster的連接利用cDNA克隆的信息和5’,3’端Reads的信息，不同的Cluster可以連接在一起。68PPT學(xué)習(xí)交流聚類問(wèn)題錯(cuò)拼poly(A),Linker-to-linker,GeneFamilies,repeat漏拼Lowquality,Linker-to-linker,repeat選擇性剪切polyAlinker69PPT學(xué)習(xí)交流（3）序列注釋和分析一級(jí)序列同源性比對(duì)：使用BLAST等工具蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)搜索基因功能分類：GeneOntology

表達(dá)量比較分析：不同組織或發(fā)育階段基因表達(dá)量比較通路分析可變剪切分析70PPT學(xué)習(xí)交流

較好匹配InterproScanNtBlastnESTsequencesNrBlastx完成注釋無(wú)理想匹配較好匹配完成注釋無(wú)理想匹配較好匹配無(wú)理想匹配Newsequences域的注釋后續(xù)分析常用的基因注釋流程71PPT學(xué)習(xí)交流BLASTBasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)結(jié)合了動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法和間接的啟發(fā)式算法的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)把數(shù)據(jù)庫(kù)檢索建立在嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)之上，是目前最常用的同源檢索工具。局部比對(duì)軟件比對(duì)比較精確細(xì)致用來(lái)做同源序列比對(duì)，進(jìn)行基因功能注釋耗時(shí)較長(zhǎng)72PPT學(xué)習(xí)交流BLAST簡(jiǎn)介命令及參數(shù)簡(jiǎn)介比對(duì)類型，5種不同的比對(duì)程序在線比對(duì)和本地比對(duì)程序名查詢序列類型查詢數(shù)據(jù)庫(kù)類型應(yīng)用blastp蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)使用取代矩陣尋找較遠(yuǎn)

關(guān)系blastn核酸核酸尋找較高分值的匹配，

對(duì)較遠(yuǎn)關(guān)系不太適用blastx核酸（翻譯）蛋白質(zhì)用于分析新的cDNA序列

或ESTtblastn蛋白質(zhì)核酸（翻譯）用于尋找數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有

標(biāo)注的編碼區(qū)tblastx核酸（翻譯）核酸（翻譯）用于更進(jìn)一步的分析EST73PPT學(xué)習(xí)交流BLAST結(jié)果簡(jiǎn)介BLAST比對(duì)結(jié)果詳解7474PPT學(xué)習(xí)交流nr&ntnr（Non-redundantproteinsequences）包含GenBank所有編碼序列，以及PDB，swissprot，PIR，PRF數(shù)據(jù)庫(kù)的所有編碼序列的一個(gè)非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)完整度高，氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)。nt（Nucleotidecollection）包含GenBank和PDB中（不包含EST，STS，GSS）的所有核苷酸序列信息，存在冗余的數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)完整度高。75PPT學(xué)習(xí)交流UniprotUniprot（UniversalProteinResource）UniProt是一個(gè)集中收錄蛋白質(zhì)資源并能與其它資源相互聯(lián)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，也是目前為止收錄蛋白質(zhì)序列目錄最廣泛、功能注釋最全面的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。整合三大數(shù)據(jù)庫(kù)：Swissprot、TrEMBL、PIR（ProteinInformationResource）。數(shù)據(jù)庫(kù)組成：UniprotKB（知識(shí)庫(kù)）、Uniprotarc（歸檔）、Uniref（參考資料庫(kù)）。76PPT學(xué)習(xí)交流Uniprot簡(jiǎn)介UniProtKBProteinknowledgebase,consistsoftwosections:Swiss-Prot,whichismanuallyannotatedandreviewed.TrEMBL,whichisautomaticallyannotatedandisnotreviewed.Includescompleteandreferenceproteomesets.UniRefSequenceclusters,usedtospeedupsequencesimilaritysearches.UniParcSequencearchive,usedtokeeptrackofsequencesandtheiridentifiers.Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)的最重要組成部分UniprotKB（Uniprotknowledgebase）77PPT學(xué)習(xí)交流UniProtKB/Swiss-ProtUniProtKB/Swiss-Prot主要收錄人工注釋的序列及其相關(guān)文獻(xiàn)信息和經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分析的序列。這些注釋都是由專業(yè)的生物學(xué)家給出的，準(zhǔn)確性無(wú)需置疑。注釋結(jié)果全面翔實(shí)，注釋包括對(duì)蛋白質(zhì)功能、酶學(xué)特性、剪接異構(gòu)體、相關(guān)疾病信息的注釋等等。注釋結(jié)果無(wú)冗余。78PPT學(xué)習(xí)交流UniprotKB/TrEMBLUniprotKB/TrEMBL主要收錄的則是高質(zhì)量的經(jīng)計(jì)算機(jī)分析后進(jìn)行自動(dòng)注釋和分類的序列。由于大規(guī)模測(cè)序產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)無(wú)法通過(guò)Swissprot的嚴(yán)謹(jǐn)注釋思路來(lái)進(jìn)行注釋。TrEMBL存儲(chǔ)了比較全面完整的物種編碼序列信息。存在冗余。79PPT學(xué)習(xí)交流Uniprot注釋途徑網(wǎng)頁(yè)提交序列本地BLAST80PPT學(xué)習(xí)交流COG81PPT學(xué)習(xí)交流

82PPT學(xué)習(xí)交流KEGG注釋途徑網(wǎng)絡(luò)提交任務(wù)blast83PPT學(xué)習(xí)交流KEGG注釋結(jié)果BLAST比對(duì)結(jié)果根據(jù)比對(duì)結(jié)果提取代謝通路圖根據(jù)基因?qū)?yīng)的KO號(hào)可以從KEGG官網(wǎng)得到對(duì)應(yīng)的PATHWAY圖片84PPT學(xué)習(xí)交流KEGG注釋結(jié)果85PPT學(xué)習(xí)交流InterproscanInterproscanInterPro是一個(gè)關(guān)于蛋白家族(proteinfamilies)、功能保守區(qū)域(domains)和功能位點(diǎn)(funtionalsites)的數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)包括了PROSITE,PRINTS,Pfam,ProDom等知名蛋白結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)及保守域的數(shù)據(jù)庫(kù)。86PPT學(xué)習(xí)交流Interproscan87PPT學(xué)習(xí)交流

基因注釋數(shù)據(jù)庫(kù)注釋上的基因所占比例TIGROGI(ver17)712694.3TIGRPseudoMolecule(ver5)615181.4NCBIUNIGENE(ver62)671488.8NCBInrproteindatabase583177.293-11BGI_Scan585477.5Uniprotproteindatabase362848.0TIGRtoGO456560.4KEGGAutomaticAnnotationServer94512.5一共有7250(95.9%)的unigenes被注釋。

88PPT學(xué)習(xí)交流

技術(shù)路線cDNA文庫(kù)構(gòu)建隨機(jī)測(cè)序得到EST序列讀取與處理序列拼接和注釋表達(dá)豐度和功能分析表達(dá)譜特征分析表達(dá)量在不同文庫(kù)中的分布表達(dá)譜的比較分析差異表達(dá)基因鑒定與分類功能分析作用機(jī)理分析Q-PCR驗(yàn)證89PPT學(xué)習(xí)交流

EST軟件平臺(tái)EST序列庫(kù)/序列的質(zhì)量檢查測(cè)序量監(jiān)控聚類和拼接檢查（借助于基因組信息）全長(zhǎng)ORF尋找發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)基因研究表達(dá)基因概況的主要實(shí)驗(yàn)手段（DNAchip、proteomics的先驅(qū)）功能分類表達(dá)量分析交替剪接檢測(cè)EST特有信息90PPT學(xué)習(xí)交流Microarray和GeneChip大規(guī)模表達(dá)譜或全景式表達(dá)譜（globalexpressionprofile）：是生物體（組織、細(xì)胞）在某一狀態(tài)下基因表達(dá)的整體狀況。微陣列或基因芯片（DNAchip）:利用光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平板印刷以及固相表面化學(xué)合成等技術(shù)，在固相表面合成成千上萬(wàn)個(gè)寡核苷酸探針，并與放射性同位素或熒光物標(biāo)記的來(lái)自不同細(xì)胞、組織或整個(gè)器官的DNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA進(jìn)行雜交，然后用特殊的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)每個(gè)雜交點(diǎn)進(jìn)行定量分析。91PPT學(xué)習(xí)交流SpottedMicroarrayscDNAArraysOligoArrays

InSituOligoSynthesisPhotosynthesisPlanersurfaceMicrofluidicschipE-fieldsynthesisIntegratedChips

IntegrateduF,microarrayanddetectionchipswithPCR,fluorescenceore-detectionMicrofluidicsPlasticsCeramicsSiliconOthermaterials不同的生物芯片技術(shù)平臺(tái)點(diǎn)樣芯片原位合成芯片微流體芯片整合型芯片92PPT學(xué)習(xí)交流基因芯片的探針93PPT學(xué)習(xí)交流TaggedRNAfragmentsflushedoverarrayLaseractivationoffluorescenttagsOpticalscanningofhybridizationintensities基因芯片的雜交實(shí)驗(yàn)94PPT學(xué)習(xí)交流Experimentaloverview:HybridizationWashingScancy5channelScancy3channel“Overlayimages”Quantifypixelintensities.CellpopulationACellpopulationBRNAextractionAABBReversetranscriptionAABBKlenowlabelincorporationSampleBlabelledwithcy3dyeSampleAlabelledwithcy5dye95PPT學(xué)習(xí)交流圖像掃描Cy5Cy396PPT學(xué)習(xí)交流LimitofDetection:1in30,000transcripts

~20transcripts/cellRed–increaseofCy5sampletranscriptsGreen–increaseofCy3sampletranscriptsYellow–equalabundance97PPT學(xué)習(xí)交流差異表達(dá)基因篩選原理：采用cy3/cy5的ratio值對(duì)差異基因進(jìn)行判斷，或采用統(tǒng)計(jì)方法對(duì)差異基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。方法：倍數(shù)法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.598PPT學(xué)習(xí)交流

基因芯片或微陣列技術(shù)流程….….Clone反轉(zhuǎn)錄（可選）讀取光密度聚類分析（非同源功能注釋）標(biāo)記雜交反轉(zhuǎn)錄EST分析………….………….………….GeneChip0.10.060.050.04…000.070.01…表達(dá)量矩陣G1,G3,G5G2,G4G6,G9…利用EST，SAGE分析結(jié)果制作芯片（研究已發(fā)現(xiàn)的基因）連接，轉(zhuǎn)化Ricegenome-wideDNAchip(60,000+預(yù)測(cè)基因)

果蠅基因芯片…原位合成

99PPT學(xué)習(xí)交流高通量測(cè)序轉(zhuǎn)錄組研究策略100PPT學(xué)習(xí)交流高通量測(cè)序中重要名詞解釋1、測(cè)序深度：測(cè)序得到的總堿基數(shù)與待測(cè)基因組大小的比值。假設(shè)一個(gè)基因組大小為7M，測(cè)序總堿基數(shù)為70M，則測(cè)序深度為10×。2、覆蓋度：測(cè)序獲得的序列占整個(gè)基因組的比例。由于基因組中高GC含量，重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，測(cè)序最終拼接組裝的序列往往無(wú)法覆蓋所有的區(qū)域，這些區(qū)域就叫做Gap。二者的關(guān)系：測(cè)序深度與基因組覆蓋度之間是一個(gè)正相關(guān)的關(guān)系，測(cè)序帶來(lái)的錯(cuò)誤率或假陽(yáng)性結(jié)果會(huì)隨著測(cè)序深度的提升而下降。當(dāng)測(cè)序深度在10～15X以上時(shí)，基因組覆蓋度和測(cè)序錯(cuò)誤率控制均得以保證。101PPT學(xué)習(xí)交流RNA-seq技術(shù)路線文庫(kù)制備測(cè)序短序列定位計(jì)數(shù)102PPT學(xué)習(xí)交流WorkflowofRNA-Seq樣品檢測(cè)文庫(kù)制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析103PPT學(xué)習(xí)交流TotalRNA樣品檢測(cè)

Agilent2200檢測(cè)OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

新型安捷倫2200TapeStation

系統(tǒng)是新一代測(cè)序（NGS）、生物微陣列芯片分析和qPCR工流程以及蛋白質(zhì)純化和抗體生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)生物樣品進(jìn)行質(zhì)量控制（QC）的理想解決方案。●

可擴(kuò)展的通量—16聯(lián)或96孔微量滴定板●

快速得到結(jié)果—平均每個(gè)樣品只需一分鐘便可獲得結(jié)果●

使用簡(jiǎn)單—可直接使用的ScreenTape預(yù)制膠條簡(jiǎn)化了工作流程●

樣品用量少—每次運(yùn)行僅需要不到2ul樣品104PPT學(xué)習(xí)交流真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過(guò)的磁珠與生物素吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3′的polyA與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。磁珠通過(guò)MPC（磁分離器）從溶液中分離出來(lái)。mRNA與磁珠結(jié)合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。鏈霉親合素包被磁珠+生物素標(biāo)記Oligo（dT）25+poly（A）105PPT學(xué)習(xí)交流原核mRNA的純化AmbionMICROExpressKitLNA扣鎖型探針106PPT學(xué)習(xí)交流mRNA反轉(zhuǎn)錄---fragment+RT純化過(guò)的mRNA樣品加入1μl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1μl的stopbuffer終止反應(yīng)。加入沉淀劑（NaAc糖原無(wú)水乙醇）沉淀產(chǎn)物。RTdscDNA107PPT學(xué)習(xí)交流末端修復(fù)(防止自連）cDNA3′末端加AAdapter連接108PPT學(xué)習(xí)交流第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成↓↓第二天末端修復(fù)↓↓加接頭膠回收3’端加A第三天PCRPCR膠回收↓↓

文庫(kù)制備↓↓文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)：Aligent2100：片段大小、純度、濃度qPCR：片段大小、濃度手工檢測(cè)：跑膠驗(yàn)證。109PPT學(xué)習(xí)交流ApplicationRNA-Seq(單端測(cè)序---Quantification)RNA-Seq

(雙端測(cè)序---Transcriptome)Expression-profiling√√AlternativeSplicing－√FusionGene－√SNPdetection－√HiSeq2500ApplicationsofRNA-Seq110110PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄組分析的兩種策略左邊是先比對(duì)，再通過(guò)表達(dá)量和junction信息得到轉(zhuǎn)錄本，這種方法能夠檢測(cè)到低表達(dá)量的轉(zhuǎn)錄本；右邊是對(duì)mRNA-seq的reads直接進(jìn)行denovo組裝，得到轉(zhuǎn)錄本，但對(duì)于低表達(dá)量的轉(zhuǎn)錄本不易發(fā)現(xiàn)。111PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄組分析的兩種策略有Reference的轉(zhuǎn)錄組分析以比對(duì)為基礎(chǔ)，分析有基因組的樣品的可變剪接信息，以及預(yù)測(cè)可變剪接帶來(lái)的功能差異，同時(shí)定量不同樣品的mRNA表達(dá)豐度進(jìn)行差異基因的相關(guān)分析。無(wú)Reference的轉(zhuǎn)錄組分析通過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)組裝大規(guī)模發(fā)掘?qū)?yīng)物種的轉(zhuǎn)錄本信息，對(duì)組裝得到轉(zhuǎn)錄本做功能注釋分析，同時(shí)定量轉(zhuǎn)錄本的不同豐度進(jìn)行差異分析。112PPT學(xué)習(xí)交流兩種分析思路原始數(shù)據(jù)Reference基因組Gff基因結(jié)構(gòu)注釋差異基因分析及功能注釋分析有參考基因組無(wú)參考基因組聚類得到UnigeneUnigene的差異表達(dá)及功能注釋分析TopHat+Cufflinks的可變剪接分析測(cè)序數(shù)據(jù)組裝113PPT學(xué)習(xí)交流有參考基因組分析可變剪接根據(jù)軟件對(duì)基因可變剪接結(jié)果做預(yù)測(cè)結(jié)合相關(guān)基因的功能進(jìn)行深入的研究（性狀相關(guān)..）原始數(shù)據(jù)Reference基因組Gff基因結(jié)構(gòu)注釋TopHat+Cufflinks的可變剪接分析114PPT學(xué)習(xí)交流可變剪接簡(jiǎn)介一個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中經(jīng)過(guò)不同的剪接處理得到不同的mRNA從而產(chǎn)生不同的蛋白，是生物性狀多樣化的重要原因。115PPT學(xué)習(xí)交流可變剪接類型外顯子跳過(guò)內(nèi)含子滯留互斥外顯子可變5’剪接可變3’剪接保守剪接類型116PPT學(xué)習(xí)交流可變剪接分析軟件TopHat針對(duì)高通量RNA_Seq的序列剪接檢測(cè)軟件，采用短序列比對(duì)軟件Bowtie進(jìn)行序列比對(duì)和剪接檢測(cè)。Cufflinks利用Tophat的檢測(cè)結(jié)果和測(cè)序Reads的比對(duì)情況組裝構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本并進(jìn)行表達(dá)豐度分析的軟件。117PPT學(xué)習(xí)交流新基因的發(fā)現(xiàn)新的編碼區(qū)域的定位通過(guò)比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)原本無(wú)基因注釋的區(qū)域出現(xiàn)了編碼mRNA的序列新基因的功能注釋分析對(duì)新基因的序列做功能注釋118PPT學(xué)習(xí)交流無(wú)參考基因組分析數(shù)據(jù)的組裝Orf預(yù)測(cè)SSR分析通過(guò)BLAST做基因功能注釋分析原始數(shù)據(jù)聚類得到Unigene測(cè)序數(shù)據(jù)組裝119PPT學(xué)習(xí)交流測(cè)序數(shù)據(jù)組裝組裝基本原理基于測(cè)序reads之間的overlap進(jìn)行的序列組裝組裝軟件簡(jiǎn)介TrinityTransabyssSOAP-Trans120PPT學(xué)習(xí)交流Trinity簡(jiǎn)介TrinityTrinity是一個(gè)組裝構(gòu)建無(wú)Reference全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的組裝軟件，專門針對(duì)高通量RNA測(cè)序設(shè)計(jì)的，組裝效果較好。121PPT學(xué)習(xí)交流基因表達(dá)聚類分析轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的應(yīng)用導(dǎo)致基因表達(dá)數(shù)據(jù)爆炸性增長(zhǎng)。如何對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從中提取有意義的生物學(xué)信息，已成為轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究熱點(diǎn)和技術(shù)瓶頸。聚類分析技術(shù)能將待處理的對(duì)象分配到相應(yīng)的聚類中，使得同一聚類中的對(duì)象差別較小，不同聚類之間的對(duì)象差別較大。聚類分析技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，非常適合大批量分析基因群的功能。

122PPT學(xué)習(xí)交流有參考基因組序列信息分析流程123PPT學(xué)習(xí)交流Reads在基因組上的分布124PPT學(xué)習(xí)交流基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定出酵母3’和5’UTR區(qū)域125PPT學(xué)習(xí)交流

鑒定基因可變剪接exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA126PPT學(xué)習(xí)交流鑒定融合基因127PPT學(xué)習(xí)交流新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistributionPaired-End(PE)Reads128PPT學(xué)習(xí)交流SNP分析129PPT學(xué)習(xí)交流DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolution

revealshighcomplexityofthericetranscriptomeRiceTranscriptomeMaterial

callus

rootatseedlingstage（14d）

shootatseedlingstage（14d）

flagleaves（2stages）

panicle（3stages）Methods

RNASeq（paired-end&singleend）

DGE

smallRNA（18-30nt）基因功能注釋基因結(jié)構(gòu)分析鑒定出大量新轉(zhuǎn)錄本可變剪接鑒定基因融合鑒定130PPT學(xué)習(xí)交流無(wú)參考基因組生物信息分析Unigene功能注釋Unigene的GO分類Unigene代謝通路分析預(yù)測(cè)編碼蛋白框（CDS）Unigene表達(dá)差異分析Unigene在樣品間的差異GO分類和Pathway富集性分析131PPT學(xué)習(xí)交流Denovoreads組裝流程132PPT學(xué)習(xí)交流UnigeneGO分類133PPT學(xué)習(xí)交流UnigeneCOG功能分類134PPT學(xué)習(xí)交流基因表達(dá)差異分析N1:totaltagNumberinsampleAN2:totaltagNumberinsampleBX:GeneexpressionlevelinsampleAy:GeneexpressionlevelinsampleBReference:AudicS.etal.Thesignificanceofdigitalgeneexpressionprofiles.GenomeRes.19977(10):986-995

135PPT學(xué)習(xí)交流Unigenepathway富集性分析136PPT學(xué)習(xí)交流Pathway富集性分析列表137PPT學(xué)習(xí)交流138PPT學(xué)習(xí)交流GenomeRes2010Case

實(shí)驗(yàn)材料收集：

葉片，花序,果實(shí),根時(shí)間點(diǎn)：0,4,8,12,16,20和24h將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的樣品均勻混合測(cè)序策略：

Illumina測(cè)序，1Gdata139PPT學(xué)習(xí)交流1.Highlight2.Heat3.Cold4.Salt5.Drought抗逆相關(guān)可變剪接140PPT學(xué)習(xí)交流外包膜蛋白16(AT2G28900)Intron-retentionControlLowTemperatureResistance低溫脅迫相關(guān)的AS低溫脅迫下這個(gè)內(nèi)含子和對(duì)照相比被保留了下來(lái)，揭示了可變剪接有重要功能。141PPT學(xué)習(xí)交流AS調(diào)節(jié)機(jī)制CCA1生物鐘相關(guān)基因，例如調(diào)節(jié)氣孔的開(kāi)關(guān)等142PPT學(xué)習(xí)交流RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）生物信息分析內(nèi)容測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估篩選差異表達(dá)基因表達(dá)模式聚類分析GO功能富集分析Pathway富集分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析143PPT學(xué)習(xí)交流RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）信息分析流程144PPT學(xué)習(xí)交流RNA-Seq與基因芯片優(yōu)缺點(diǎn)比較技術(shù)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)RNA-seq1）檢測(cè)基因數(shù)比基因芯片多25%2）定量準(zhǔn)，可重復(fù)性高（重復(fù)相關(guān)系數(shù)≥0.99）3）數(shù)字化信號(hào)，無(wú)背景噪音，無(wú)交叉雜交4）高、低豐度基因均可檢測(cè)5）不受研究物種限制，模式生物和非模式生物均可檢測(cè)6）數(shù)據(jù)可與時(shí)俱進(jìn)，即隨數(shù)據(jù)庫(kù)更新而更新7）具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼容1）樣本要求量比基因芯片多2）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分析基礎(chǔ)，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊(yùn)含的豐富信息基因芯片1）平臺(tái)應(yīng)用較早2）信息分析軟件較多3）有些平臺(tái)要求樣品量少1）檢測(cè)靈敏度較低、重復(fù)性差、檢測(cè)閾值較狹窄2）有背景噪音，假陽(yáng)性率＞1%3）受物種限制，只能檢測(cè)部分模式生物4）受基因拷貝數(shù)限制，無(wú)法檢測(cè)出低豐度基因5）只能檢測(cè)已知轉(zhuǎn)錄本，無(wú)法檢測(cè)出新轉(zhuǎn)錄本6）受數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)或比較舊的版本的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)設(shè)計(jì)的，可能出現(xiàn)注釋不準(zhǔn)確的情況145PPT學(xué)習(xí)交流casePlantPhysiology2010取樣：

選取在成熟季節(jié)開(kāi)花后5,10,和15個(gè)星期葡萄分別代表葡萄果實(shí)成熟中的三個(gè)時(shí)期（postsetting,ve′raison和ripening）數(shù)據(jù)量：

超過(guò)59Mreads數(shù)據(jù)，

長(zhǎng)度在36-44bp之間運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)對(duì)葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中復(fù)雜轉(zhuǎn)錄特征的研究。146PPT學(xué)習(xí)交流表二reads在基因組上的分布情況表一

測(cè)序數(shù)據(jù)葡萄RNA-Seq單端測(cè)序147PPT學(xué)習(xí)交流漿果發(fā)育三個(gè)階段共有、特有基因表達(dá)分布圖基因表達(dá)量分布148PPT學(xué)習(xí)交流表達(dá)簇的分類分布情況差異表達(dá)的基因GO功能注釋---分成了19個(gè)功能類群---按照基因在三個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)趨勢(shì)進(jìn)行分類，分成8個(gè)cluster。將基因的表達(dá)和它調(diào)控的一個(gè)生理功能聯(lián)系在了一起。149PPT學(xué)習(xí)交流RNA-Seq對(duì)漿果標(biāo)記基因的驗(yàn)證用RNA-Seq的數(shù)據(jù)去驗(yàn)證已報(bào)到的十個(gè)漿果成熟期的mark基因。事實(shí)上從其它方法得到的數(shù)據(jù)去驗(yàn)證了RNA-Seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。150PPT學(xué)習(xí)交流RNA-Seq結(jié)果與RT-PCR具有高度一致性RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果151PPT學(xué)習(xí)交流152轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)橫向比較TechnologyTilingArraycDNAorESTsequesingTranscriptomeSequencingPrincipleHybridizationSangersequencingNext-GensequencingResolutionFromseveralto100SinglebaseSinglebaseThroughputHighLowHighRelianceongenomicsequenceYesNoInsomecasesBackgroundnoiseHighLowLowApplicationSimutaneouslymaptranscribedregionsandgeneexpressionYesLimitedforexpressionYesDynamicrangetoquantifygeneexpressionlevelUptoafew-hundredfoldNotpractical>8,000-foldAbilitytodistinguishdifferentisoformsandallelicexpressionLimitedYesYes152PPT學(xué)習(xí)交流RNA-seq的生物學(xué)重復(fù)和標(biāo)準(zhǔn)至少有兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，除非“短時(shí)間梯度取樣”(overlappingtimepointswithhightemporalresolution)不需要技術(shù)重復(fù)對(duì)基因注釋較好的物種，只定量比較研究，可用reads大于20M；用于注釋基因組的轉(zhuǎn)錄組，大于>100M最好有濃度不同長(zhǎng)度不同的絕對(duì)定量control(Spike-in)，以評(píng)估m(xù)apping質(zhì)量、測(cè)序均勻性和RNA-seq定量效果“3端/5端比值”是衡量RNA完整性的關(guān)鍵指標(biāo)(理想值是1)，也要進(jìn)行計(jì)算評(píng)估樣品處理流程，文庫(kù)構(gòu)建流程，測(cè)序機(jī)器，測(cè)序類型，分析軟件，樣品評(píng)估關(guān)鍵指標(biāo)，rpkm值關(guān)鍵結(jié)果完備。

153PPT學(xué)習(xí)交流RNA-seq的優(yōu)勢(shì)不局限于已知的基因組序列信息，適用于未知基因組序列的物種的高通量轉(zhuǎn)錄組研究相對(duì)于芯片技術(shù)，背景信號(hào)值低，沒(méi)有檢測(cè)上限，對(duì)于基因表達(dá)譜有非常寬的檢測(cè)范圍。在有內(nèi)參的情況下，在定量方面顯示出了較高的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。不需要克隆的步驟，操作簡(jiǎn)單，需要的樣本量少，可以在單細(xì)胞的水平上進(jìn)行表達(dá)譜分析通量高，成本比Tillingarray或者大規(guī)模的EST測(cè)序要低。154PPT學(xué)習(xí)交流RNA-seq的挑戰(zhàn)文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中大片段的RNA必須經(jīng)過(guò)片段化處理，會(huì)引入一定的偏倚。PCR會(huì)造成表達(dá)量的變化。海量短序列數(shù)據(jù)的比對(duì)或拼接情況復(fù)雜，對(duì)重復(fù)序列和多匹配序列的精確定位存在明顯問(wèn)題。高等真核生物可變剪接和反式剪接的鑒定仍有相當(dāng)?shù)恼`差。測(cè)序深度的確定因物種、器官、組織、時(shí)期而變，很難有統(tǒng)一公式直接計(jì)算。155PPT學(xué)習(xí)交流轉(zhuǎn)錄組學(xué)的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組（三代測(cè)序儀）單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（singlecelltranscriptome）表觀轉(zhuǎn)錄組（Epitranscriptome）全轉(zhuǎn)錄組的RNA編輯156PPT學(xué)習(xí)交流MicroRNA研究157PPT學(xué)習(xí)交流MicroRNA簡(jiǎn)介(1)長(zhǎng)度為21nt左右核苷酸的內(nèi)源性單鏈小分子RNA(2)存在65nt左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體(3)基因座位于蛋白質(zhì)基因間隔區(qū)(4)其DNA序列在近源物種間高度保守158PPT學(xué)習(xí)交流miRNA具有十分重要的調(diào)控功能，它們主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。通過(guò)與靶mRNA特異性的堿基配對(duì)引起靶mRNA的降解（植物中較為常見(jiàn)）或者抑制其翻譯（動(dòng)物中較為常見(jiàn)），從而影響了靶mRNA的表達(dá)。159PPT學(xué)習(xí)交流目前發(fā)現(xiàn)miRNA是一個(gè)龐大的小分子調(diào)控RNA家族，廣泛存在于各種動(dòng)植物中，參與細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、形態(tài)建成以及疾病發(fā)生等一系列重要的生命過(guò)程。最近發(fā)現(xiàn)一系列與腫瘤發(fā)生相關(guān)的和人類病毒編碼的miRNA，揭示miRNA在哺乳動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用。160PPT學(xué)習(xí)交流(1)由長(zhǎng)的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA)經(jīng)Drosha酶作用生成70nt左右的miRNA前體(pre-miRNA)，該過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞核(2)將pre-miRNA經(jīng)Dicer酶作用加工為成熟miRNA，該過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。microRNA的加工成熟161PPT學(xué)習(xí)交流首先由基因組轉(zhuǎn)錄形成長(zhǎng)鏈RNA分子——pri-miRNA162PPT學(xué)習(xí)交流約60%的microRNA為獨(dú)立轉(zhuǎn)錄表達(dá)；約15%miRNA為成簇存在而共同轉(zhuǎn)錄；其余還有約25%的miRNA定位于功能基因內(nèi)含子，隨基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。163PPT學(xué)習(xí)交流Pri-miRNA經(jīng)雙鏈RNA核酸酶Drosha酶作用，加工形成70-100nt長(zhǎng)度的pre-miRNA164PPT學(xué)習(xí)交流Pre-miRNA在Exportin5介導(dǎo)作用下轉(zhuǎn)運(yùn)出胞核至胞質(zhì)中進(jìn)行下一步加工165PPT學(xué)習(xí)交流Pre-miRNA在胞質(zhì)中經(jīng)雙鏈RNA核酸酶Dicer酶作用加工形成單鏈成熟miRNA分子166PPT學(xué)習(xí)交流miRNA發(fā)揮作用過(guò)程19-23nt的成熟miRNA形成后與其他蛋白共同組成RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）參與RNA干擾途徑167PPT學(xué)習(xí)交流miRNA形成RISC復(fù)合體后可與特定的靶mRNA結(jié)合，這種結(jié)合不要求嚴(yán)格的互補(bǔ)配對(duì)。結(jié)合后導(dǎo)致靶mRNA翻譯的抑制翻譯抑制168PPT學(xué)習(xí)交流5’endofthesmallRNA,2–8,knownasthe“seedregion”donothaveacomplex

secondarystructureandarelocatedinaccessibleregionsofthe

RNAmicroRNA識(shí)別靶位點(diǎn)169PPT學(xué)習(xí)交流microRNA作用機(jī)制170PPT學(xué)習(xí)交流171PPT學(xué)習(xí)交流miRNAandCancer172PPT學(xué)習(xí)交流MiRNA控制植物性狀173PPT學(xué)習(xí)交流miRNA與siRNA的聯(lián)系：均為Dicer的產(chǎn)物長(zhǎng)度均為22nt左右，5’端是磷酸基，3’端是羥基均需Argonaute家族蛋白的存在同為RISC的組分二者進(jìn)化關(guān)系上可能的兩種推論：siRNA是miRNA的補(bǔ)充miRNA在進(jìn)化過(guò)程中替代了siRNA沉默機(jī)制有重疊174PPT學(xué)習(xí)交流miRNA的加工成熟過(guò)程與RNAi技術(shù)中常用的siRNA有許多相似之處——均經(jīng)過(guò)Dicer酶對(duì)雙鏈RNA的識(shí)別加工而形成單鏈RNA分子。175PPT學(xué)習(xí)交流miRNAsiRNA產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)RNA的固有組分之一（正常）RNAi的活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后誘導(dǎo)而產(chǎn)生（異常）來(lái)源內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)基因或病毒RNA（外源）直接來(lái)源發(fā)夾狀pre-miRNA長(zhǎng)dsRNA結(jié)構(gòu)單鏈雙鏈，3‘端有2個(gè)非配對(duì)堿基，通常為UU互補(bǔ)性不完全互補(bǔ)，存在錯(cuò)配現(xiàn)象完全互補(bǔ)對(duì)靶RNA特異性相對(duì)較低，一個(gè)突變不影響miRNA的效應(yīng)較高，一個(gè)突變即引起RNAi沉默效應(yīng)的改變途徑miRNA途徑RNAi途徑對(duì)RNA的影響在RNA代謝的各個(gè)層面進(jìn)行調(diào)控降解靶mRNA功能調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，在蛋白質(zhì)合成水平發(fā)揮作用，與mRNA的穩(wěn)定性無(wú)關(guān)抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用,影響mRNA的穩(wěn)定性miRNA與siRNA的區(qū)別176PPT學(xué)習(xí)交流microRNA研究的興起與發(fā)展miRNA發(fā)展中遇到的問(wèn)題：在各種生物中尋找miRNA發(fā)現(xiàn)miRNA的靶基因揭示miRNA的功能miRNA？目前靶基因檢測(cè)工作成為miRNA功能研究的瓶頸177PPT學(xué)習(xí)交流miRNA的獲取miRNA分子的序列短小1）在基因組中存在較多的互補(bǔ)序列2）在不同生物體內(nèi)與靶基因結(jié)合的方式也不盡相同3）通常與多種蛋白相互作用這使得建立一個(gè)有效而且普遍適用的研究方法異常困難。到目前為止,miRBase上公布的miRNA總數(shù)將近3000種?，F(xiàn)在已知靶基因的miRNA多是通過(guò)基因克隆和生物信息學(xué)篩選的方法發(fā)現(xiàn)的。178PPT學(xué)習(xí)交流miRNA的獲取——系統(tǒng)生物學(xué)篩選隨著生物全基因組測(cè)序的完成,利用計(jì)算機(jī)對(duì)基因組序列進(jìn)行搜索可以大大提高miRNA的鑒定效率。所以,人們根據(jù)目前已知的miRNA基因序列總結(jié)它們的特征和規(guī)律,編寫了一些計(jì)算機(jī)程序,通過(guò)對(duì)生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索,可以找到那些可能為miRNA的基因序列,然后通過(guò)Northernblotting來(lái)篩選真正的miRNA基因。生物信息學(xué)方法是依據(jù)在不同的物種中，其成熟的miRNA具有較大的序列同源性以及前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的保守性這一特征在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索新的miRNA基因。該方法根據(jù)比較基因組學(xué)原理并結(jié)合生物信息軟件在已測(cè)序基因組中進(jìn)行搜索比對(duì)，根據(jù)同源性的高低再進(jìn)行RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將符合條件的候選miRNA