色譜法硅醇基效應(yīng)的消除流動(dòng)相方面的改進(jìn)課件

第四節(jié)含量測(cè)定生物堿類藥物由于品種多，結(jié)構(gòu)多變，性質(zhì)各異，可利用的含量測(cè)定方法也較多。原料藥物的含量測(cè)定，主要是利用整個(gè)分子的堿性，根據(jù)其堿性強(qiáng)弱以及存在形式的溶解行為，多采用非水溶液滴定法；制劑的含量測(cè)定方法主要有紫外分光光度法(包括酸性染料比色法)、色譜法、提取酸堿滴定法、熒光分光光度法等。ChP2015中收載的常見(jiàn)生物堿及其制劑的含量測(cè)定方法見(jiàn)表12-2。含量測(cè)定

(Assay)

非水溶液滴定法

非水溶液滴定法是在非水溶劑中進(jìn)行的酸堿滴定測(cè)定法。主要用來(lái)測(cè)定有機(jī)堿及其氫鹵酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽以及有機(jī)酸堿金屬鹽類藥物的含量。也用于測(cè)定某些有機(jī)弱酸的含量。一、非水溶液滴定法(弱堿性)溶劑種類（1）酸性溶劑：有機(jī)弱堿在酸性溶劑中可顯著地增強(qiáng)其相對(duì)堿度，最常用的酸性溶劑是冰醋酸。（2）堿性溶劑：有機(jī)弱酸在堿性溶劑中可顯著地增強(qiáng)其相對(duì)酸度，最常用的堿性溶劑是二甲基甲酰胺。（3）兩性溶劑：兼有酸堿兩種性能，最常用的是甲醇。（4）惰性溶劑：溶劑沒(méi)有酸堿性，如甲苯、三氯甲烷、丙酮。一、非水溶液酸堿滴定法

(一)原理與方法原理生物堿類藥物一般具有弱堿性，在水溶液中用酸滴定液進(jìn)行直接滴定時(shí)沒(méi)有明顯的滴定突躍，難于掌握終點(diǎn)，不能順利的滴定。而在酸性非水介質(zhì)(冰醋酸、醋酐)中，生物堿的堿性顯著增強(qiáng)，滴定突躍增大，滴定可順利進(jìn)行。

生物堿類藥物絕大多數(shù)都以鹽的形式供臨床使用，即供分析用的多為生物堿鹽類。其鹽的滴定，實(shí)際上是一個(gè)置換反應(yīng)，即用強(qiáng)酸滴定液置換出與生物堿結(jié)合的較弱的酸。式中BH+·A-表示生物堿鹽類，HA表示被置換出的弱酸。由于被置換出的HA酸性強(qiáng)弱不同，對(duì)滴定反應(yīng)的影響也不同，若置換出的HA酸性較強(qiáng)，則反應(yīng)不能定量的完成。因此在實(shí)際滴定中，必需根據(jù)具體情況，采取相應(yīng)的測(cè)定條件，設(shè)法將HA除去或減少其產(chǎn)生，使反應(yīng)順利完成。方法除另有規(guī)定外，精密稱取供試品適量[約消耗高氯酸滴定液(0.1mol/L)8ml]，加冰醋酸10～30ml使溶解。加各品種項(xiàng)下規(guī)定的指示液1～2滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定。終點(diǎn)顏色以電位滴定時(shí)的突躍點(diǎn)為準(zhǔn)，并將滴定的結(jié)果用空自試驗(yàn)校正。(二)測(cè)定條件的選擇適用的范圍及溶劑的選擇

主要應(yīng)用于pKb

>8的有機(jī)堿性藥物及其鹽的含量測(cè)定。條件選用適當(dāng)?shù)膒Kb為8~13的弱堿均可采用。對(duì)于堿性較弱的藥物pKb為8~10時(shí)，宜選用冰醋酸，pKb為10~12時(shí)，宜選用冰醋酸與醋酐混合溶劑，

pKb大于12時(shí)，就以醋酐為溶劑。酸根的影響在生物堿鹽的滴定中，與之成鹽的酸在冰醋酸中的酸性強(qiáng)弱對(duì)滴定能否順利進(jìn)行有關(guān)。各種酸在冰醋酸中的酸性強(qiáng)弱順序?yàn)?高氯酸>氫溴酸>硫酸>鹽酸>硝酸>磷酸>有機(jī)酸由此可見(jiàn)，如被置換出的是氫鹵酸，其在冰醋酸中的酸性較強(qiáng)，對(duì)滴定終點(diǎn)有影響，需要進(jìn)行處理。一般處理方法為在滴定反應(yīng)開(kāi)始前，預(yù)先在冰醋酸中加入醋酸汞的冰醋酸溶液，使氫鹵酸生成在冰醋酸中難解離的鹵化汞而排除干擾，然后再用高氯酸滴定液滴定。當(dāng)醋酸汞的量加入不足時(shí)，滴定終點(diǎn)仍不準(zhǔn)確，會(huì)使測(cè)定結(jié)果偏低，一般加入量以其理論量的1～3倍為宜。然而醋酸汞是劇毒的化學(xué)物質(zhì)，且嚴(yán)重污染環(huán)境，近年來(lái)生物堿類藥物氫鹵酸鹽的非水溶液滴定法逐漸改用醋酐代替冰醋酸作溶劑，并以電位法指示終點(diǎn)，以避免使用醋酸汞。終點(diǎn)指示方法一般指示終點(diǎn)的方法有電位法和指示劑法。結(jié)晶紫由堿性區(qū)域到酸性區(qū)域的顏色變化為紫、藍(lán)紫、藍(lán)綠、綠、黃。滴定液的穩(wěn)定性本法的溶劑冰醋酸具有揮發(fā)性，且膨脹系數(shù)較大，因此溫度和貯存條件等都影響滴定液的濃度。需校正注意事項(xiàng)①水分②高濃度的高氯酸與醋酐混合時(shí)容易引起爆炸，配制時(shí)應(yīng)先將高氯酸用冰醋酸稀釋后再加入醋酐。(三)應(yīng)用實(shí)例二、紫外-可見(jiàn)分光光度法基本原理UV

(二)酸性染料比色法也可分離出有機(jī)相，然后用堿化試劑堿化有機(jī)相，將離子對(duì)中的酸性染料釋放出來(lái)，用水提取In-，測(cè)定水中染料的吸光度，間接計(jì)算出堿性藥物的含量。本法具有專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度好、靈敏度高、試樣用量少等優(yōu)點(diǎn)，適用于小劑量生物堿類藥物及其制劑以及生物體內(nèi)生物堿類藥物的定量分析?！吨袊?guó)藥典》對(duì)硫酸阿托品、氫溴酸山莨菪堿的片劑和注射劑的含量測(cè)定均采用此法。BECDA有機(jī)試劑的選擇水分的影響水相最佳pH值的選擇酸性染料的選擇及其濃度酸性染料中雜質(zhì)的影響酸性染料比色法的影響因素測(cè)定條件與影響因素

水性最佳pH值：使得BH+和In-最多

酸性染料及其濃度：定量結(jié)合；對(duì)離子對(duì)的溶解性好；有較高的吸收度；足夠量即可

有機(jī)溶劑的選擇：提取效率高，氯仿最理想

水分的影響：影響結(jié)果，脫水劑或?yàn)V紙除去水分

酸性染料中的有色雜質(zhì)：有機(jī)溶劑萃取除去應(yīng)用示例硫酸阿托品片的含量測(cè)定精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2ml，分別置預(yù)先精密加入三氯甲烷10ml的分液漏斗中，各加溴甲酚綠溶液4ml，振搖提取后，靜置使分層；分取三氯甲烷液，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在420nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，計(jì)算，即得。測(cè)定法精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2ml，分別置預(yù)先精密加入三氯甲烷10ml的分液漏斗中，各加溴甲酚綠2.0ml，振搖提取兩分鐘后，靜止分層，分取澄清的三氯甲烷液，在420nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，計(jì)算，并將結(jié)果與1.027相乘，即得本品（C17H23NO3）2·H2SO4·H2O相當(dāng)標(biāo)示量的百分含量。百分標(biāo)示量式中Ax、AS分別為供試品和對(duì)照品溶液的吸光度；CS為對(duì)照品溶液的濃度mg/ml；m為樣品片粉質(zhì)量；W為平均片重。1.027為（C17H23NO3）2·H2SO4·H2O與（C17H23NO3）2·H2SO4·H2O的質(zhì)量換算系數(shù)。Fig.12-2TheUV-spectrumofatropinesulfatewithBTBions1.離子對(duì)2.染料空白（對(duì)照品平行測(cè)定，空白吸收可被扣除）3.阿托品（水溶液在420nm附近無(wú)吸收）適用范圍廣

分離模式多樣

檢測(cè)手段多樣靈敏

選擇和專屬性強(qiáng)

分離速度快重復(fù)性好

HPLC優(yōu)點(diǎn)各國(guó)藥典中采用HPLC法對(duì)莨菪類生物堿的含量和有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行直接分析測(cè)定的比例不斷增加。

三、色譜法硅醇基效應(yīng)的消除流動(dòng)相方面的改進(jìn)①在流動(dòng)相中加入含氮堿性競(jìng)爭(zhēng)試劑(或稱掃尾劑、改性劑)，可抑制或掩蔽固定相表面的游離硅醇基的活性，使生物堿易出峰，且峰形好，最常用的硅醇基抑制劑有二乙胺、三乙胺等。②在適當(dāng)?shù)膒H下使生物堿解離，再在流動(dòng)相中加入電荷相反的離子對(duì)試劑，生成離子對(duì)化合物而掩蔽生物堿的堿性基團(tuán)，這樣就避免與游離的硅醇基作用，使待測(cè)組分在非極性固定相中的分配與溶解度增大，從而改善其色譜保留與分離行為。③在流動(dòng)相中加入季銨鹽等掩蔽試劑，如在甲醇一水的流動(dòng)相中加入0.01mol/L的溴化四甲基胺，能在較短的保留時(shí)間內(nèi)獲得良好的分離，色譜峰重現(xiàn)性好，也不拖尾，而且甲醇水比例的改變和pH的變化都不影響峰形的對(duì)稱性，季銨鹽與固定相表面的硅羥基生成復(fù)合物而掩蔽了固定相表面的游離硅醇基。④在流動(dòng)相中加入電解質(zhì)緩沖鹽，通過(guò)改變流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，穩(wěn)定pH及促進(jìn)離子對(duì)相互作用，起到改善峰形和分離效果的作用。色譜保留常常較弱，從而影響到它們的含量或有關(guān)物質(zhì)HPLC測(cè)定的專屬性和準(zhǔn)確度。采用離子對(duì)高效液相色譜法，可以改善它們的色譜保留行為，并實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確測(cè)定。

在反相液相色譜條件下呈離子狀態(tài)的藥物，如有機(jī)堿類、有機(jī)酸類等調(diào)整流動(dòng)相的pH，抑制它們的解離，以改變色譜保留行為。但并不都能獲得滿意的結(jié)果。

固定相方面的改進(jìn)①選擇碳鏈較短的鍵合相硅膠填料，例如C8比C18好，原因可能是由于硅烷的碳鏈較短則覆蓋度更大，只有較少量的游離硅醇基;②采用端基封尾技術(shù)，即在C18鍵合反應(yīng)結(jié)束后，用短鏈氯硅烷(如三甲基氯硅烷)鍵合殘留的活性硅羥基。生物堿的色譜分離模式多樣，除了常采用的PR-HPLC，目前文獻(xiàn)報(bào)道也可見(jiàn)到采用正相色譜法、吸附色譜法或離子交換色譜法等各種方法。生物堿類成分進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定時(shí)，使用較多的是紫外檢測(cè)器，其他如電化學(xué)檢測(cè)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器等也適用于生物堿類成分的測(cè)定，如果化合物能產(chǎn)生熒光，還可以使用熒光檢測(cè)器。

(二)氣相色譜法氣相色譜法可用于某些具有揮發(fā)性、遇熱不分解的生物堿及其鹽類的分析，游離生物堿可直接進(jìn)樣，生物堿鹽一般會(huì)在高溫加熱下，快速解離成游離生物堿后再進(jìn)行色譜柱分析，但生物堿鹽類在高溫加熱解離后所生成的酸容易損傷色譜柱和檢測(cè)器，所以一般在測(cè)定前先用堿水堿化，再用有機(jī)溶劑提取分離，制得游離生物堿溶液后再進(jìn)樣分析。四、提取酸堿滴定法有些生物堿類藥物由于其樣品中其他組分對(duì)測(cè)定有干擾，測(cè)定前需經(jīng)過(guò)堿化、有機(jī)溶劑提取后再進(jìn)行酸堿滴定，稱為提取酸堿滴定法。本法適用于堿性較強(qiáng)(p