氨基酸分析基本原理與應用

目錄一、氨基酸分析儀二、基本原理及特點三、樣品的制備四、影響氨基酸分析的各種因素五、應用當前第1頁\共有26頁\編于星期五\19點日立L-8900氨基酸分析儀當前第2頁\共有26頁\編于星期五\19點（一）氨基酸分析儀的構(gòu)成1、輸液單元（泵與管路）2、進樣單元（自動進樣器）3、分離單元（離子交換柱、柱溫箱）4、反應單元（反應柱、反應溫度加熱設備）5、檢測單元（分光光度計）6、程序控制、數(shù)據(jù)處理（工作站）當前第3頁\共有26頁\編于星期五\19點（二）氨基酸分析儀的特點1、高靈敏度：以蛋白水解液標準為例可檢測到3pmoL。2、快速、高分辨率：水解氨基酸分析時間只有30分鐘，生理體液110分鐘。3、柱后衍生技術（實時混合）：與氨基酸反應前才將兩種反應液進行實時混合，有效的延長了反應液的使用期限、且不需要額外的制冷裝置存放。4、氨氣排除系統(tǒng)：增加了除氨柱，能很好的排除氨在分析過程中對基線及峰形的干擾。當前第4頁\共有26頁\編于星期五\19點二、基本原理氨基酸RHCCOOH__NH2__組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸除甘氨酸外、都有一個不對稱碳原子，即а-碳原子。а-碳原子有四個不同取代基：羧基、氨基、氫原子和R基團，不同氨基酸的R基團不同。每種氨基酸有D-構(gòu)型和L-構(gòu)型，蛋白質(zhì)中的氨基酸都是L-構(gòu)型。當前第5頁\共有26頁\編于星期五\19點（一）氨基酸的分類它的分類有兩種：1、按氨基酸具有的酸性和堿性基團的多少分類：中性氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸。2、按人體營養(yǎng)的需求又可分為必需氨基酸、半必需氨基酸及非必需氨基酸。當前第6頁\共有26頁\編于星期五\19點（二）氨基酸的化學反應與茚三酮反應：茚三酮與氨基酸一起加熱，形成深蘭紫色復合物，最大吸收波長為570nm。茚三酮與羥脯氨酸反應不釋放NH3，直接生成黃色化合物，吸收波長在440nm。當前第7頁\共有26頁\編于星期五\19點（三）氨基酸分析儀基本分析原理1、離子交換柱2、離子交換樹脂3、離子交換原理當前第8頁\共有26頁\編于星期五\19點1、離子交換柱氨基酸分析儀的中心部件就是離子交換柱，主要靠它把具有共性而又有差別的各種氨基酸混合物分離開來進行定量。日立氨基酸分析儀交換柱為磺酸型陽離子樹脂分離柱。當前第9頁\共有26頁\編于星期五\19點2、離子交換樹脂用作氨基酸分離柱的固定相一般都是固體的合成離子交換劑。一般氨基酸分析儀所用的離子交換樹脂是強酸型陽離子交換樹脂，它是由苯乙烯和二乙烯聚合而成的。作為理想的離子交換劑應符合下列要求：機械強度好不溶解且具有很好的化學穩(wěn)定性均勻球狀顆粒當裝入柱子后應有良好的通透性交換容量大離子交換基應是單一的官能性的當前第10頁\共有26頁\編于星期五\19點3、離子交換原理緩沖液（流動相）中的樣品離子與離子交換劑（固定相）間離子交換過程可分為以下幾步：首先離子通過擴散作用，到達分離柱樹脂的表面。（這個過程進行的非?？欤╇x子進一步擴散到交換位置以致進入樹脂內(nèi)部交換位置。這決定于樹脂的交聯(lián)度和溶液的深度。這個過程是整個離子交換反應的關鍵。當前第11頁\共有26頁\編于星期五\19點在交換位置上進行離子交換，這個平衡是瞬間的。被交換的離子帶的電荷越多，它與樹脂的結(jié)合越緊密，被其它離子取代就越困難。被交換的離子通過樹脂擴散到表面。用洗脫液洗脫，被交換的離子擴散到溶液中去。當前第12頁\共有26頁\編于星期五\19點氨基酸與樹脂間的交換主要決定于帶有相反電荷之間的引力作用。陽離子樹脂本身帶有負電荷，兩者正負吸引而結(jié)合，并且氨基酸所帶正電荷越多，結(jié)合得越緊密，被Na離子置換就越困難。所以，堿性氨基酸結(jié)合力最強，其次為芳香族氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸結(jié)合力最弱。當前第13頁\共有26頁\編于星期五\19點所以，用不同離子強度、PH值的緩沖液依次將氨基酸按吸附力的不同洗脫下來，被洗脫下來的氨基酸與茚三酮反應液在加熱條件下反應（135℃），生成可在分光光度計中570nm的藍紫色物質(zhì)（仲氨生成淺黃色物質(zhì)，440nm檢測）外標法定量。當前第14頁\共有26頁\編于星期五\19點（四）氨基酸分析儀與HPLC法的比較當前第15頁\共有26頁\編于星期五\19點三、樣品的制備（一）蛋白質(zhì)的水解（二）游離氨基酸樣品的制備（三）生理體液樣品的前處理當前第16頁\共有26頁\編于星期五\19點（一）蛋白質(zhì)的水解

用于全氨基酸測定的樣品，凡是以蛋白質(zhì)形式存在的都要進行水解處理，水解方法有三種：1、酸水解法：標準水解法，水解徹底，但色氨酸被破壞。2、堿水解法：用NaOH作為水解劑，色氨酸不被破壞，但有消旋作用，絲氨酸、蘇氨酸等被破壞。3、酶水解法：水解條件溫和，無需特殊設備，氨基酸不受破環(huán)，但水解時間長，而且不易水解完全。當前第17頁\共有26頁\編于星期五\19點（二）游離氨基酸樣品的制備游離氨基酸的樣品在分析前必需進行磨碎、脫脂、提取、脫鹽、去蛋白、脫色等處理。在進行分析前建議使用C18小柱處理一下。當前第18頁\共有26頁\編于星期五\19點（三）生理體液樣品的處理生理體液的樣品首先要除去樣品中的蛋白質(zhì)，獲得游離氨基酸。除去蛋白質(zhì)化學方法為：

1、苦味酸法2、三氯乙酸法3、乙醇沉淀法4、磺基水楊酸法（常用的方法）當前第19頁\共有26頁\編于星期五\19點四、影響氨基酸分析的各種因素樣品中氨基酸濃度的影響緩沖液PH值、鈉離子濃度的影響柱溫的影響氨的影響氧的影響光源的影響（鎢燈）當前第20頁\共有26頁\編于星期五\19點（一）樣品中氨基酸濃度的影響每種儀器都有其比較合適的進樣量，進樣濃度都有一定的范圍。濃度太大太小都不適宜，尤其是將高濃度的樣品注入儀器中會造成儀器管路的堵塞。最好進樣分析前將樣品稀釋到比較合適的濃度。當前第21頁\共有26頁\編于星期五\19點（二）緩沖液PH值與鈉離子濃度的影響色譜圖中各種氨基酸分離的特別好而沒有峰丟失，緩沖液的PH值和鈉離子起著重要的作用。如PH值和鈉離子濃度不當會出現(xiàn)氨基酸出峰提前錯后以及重疊現(xiàn)象。當前第22頁\共有26頁\編于星期五\19點（三）柱溫的影響柱溫不穩(wěn)定或不準確會出現(xiàn)基線漂移或分離度不好影響分離效果以及準確定量。當前第23頁\共有26頁\編于星期五\19點（四）氨的影響緩沖液、樣品、流路系統(tǒng)混入氨進可使基線在堿性氨基酸出峰處將基線抬高，影響堿性氨基酸分離效果和準確定量。當前第24頁\共有26頁\編于星期五\19點（五）氧的影響反應液中的茚三酮最忌氧，茚三酮氧化后