廈大微生物課件第七章微生物遺傳變異與育種

Chap.7

微生物遺傳變異和育種

當(dāng)前第1頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

微生物遺傳學(xué)研究意義1）微生物學(xué)的主要分支2）為生命遺傳現(xiàn)象的解釋提供依據(jù)3）是分子生物學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)學(xué)科4）促進(jìn)工業(yè)微生物菌種的選育

當(dāng)前第2頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)§.1遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)

一、證明遺傳物質(zhì)的三個(gè)典型實(shí)驗(yàn)

----細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)----噬菌體感染實(shí)驗(yàn)----植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)

當(dāng)前第3頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)1、細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)----動(dòng)物試驗(yàn)(Grifith,1928)當(dāng)前第4頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)----細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)S（死）+R（活）S（少量活）+R（活）S（無細(xì)胞提取液）+R（活）S（少量活）+R（活）當(dāng)前第5頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)----細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)（Avery，1944）當(dāng)前第6頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)當(dāng)前第7頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)2．噬菌體感染實(shí)驗(yàn)(Hershey;Chase,1952)當(dāng)前第8頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)3．植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)(Fraenkel-Conrat,1956)當(dāng)前第9頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式（一）真核與原核微生物遺傳物質(zhì)比較

當(dāng)前第10頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●原核與真核微生物基因組大小當(dāng)前第11頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)細(xì)菌染色體數(shù)目與形狀當(dāng)前第12頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●細(xì)菌染色體結(jié)構(gòu)當(dāng)前第13頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)真核微生物染色體結(jié)構(gòu)(示核小體）

當(dāng)前第14頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)真核生物基因結(jié)構(gòu)當(dāng)前第15頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)真核微生物基因表達(dá)控制當(dāng)前第16頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)（二）原核生物的質(zhì)粒

質(zhì)粒：游離于染色體外，獨(dú)立復(fù)制，環(huán)狀、共價(jià)、閉合dsDNA分子，即cccDNA。當(dāng)前第17頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●質(zhì)粒的特點(diǎn)1）大小：大質(zhì)粒：>60kb、1/cell小質(zhì)粒：10-20/cell當(dāng)前第18頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)2）自主復(fù)制能力：型復(fù)制、滾環(huán)復(fù)制當(dāng)前第19頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

數(shù)量控制：嚴(yán)緊型；松弛型當(dāng)前第20頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)3）轉(zhuǎn)移性：Tra區(qū)基因：附加體：某些質(zhì)粒既可整合進(jìn)宿主染色體，又可與染色體脫離，稱之~。當(dāng)前第21頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)4）質(zhì)粒的消除：

----理化因子----原生質(zhì)體誘導(dǎo)法當(dāng)前第22頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)5）不相容性：

兩種親緣關(guān)系相近的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地存在于同一個(gè)細(xì)胞中。（G-菌的部分不相容群）當(dāng)前第23頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●質(zhì)粒的遺傳表型1） F質(zhì)粒（致育因子）Tra基因：編碼轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白；合成性纖毛

當(dāng)前第24頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)2）R質(zhì)粒（抗藥因子）----RTF基因（抗性轉(zhuǎn)移因子）----抗性決定子（抗抗生素、抗藥、抗種金屬）當(dāng)前第25頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)3）Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）----產(chǎn)大腸桿菌素細(xì)菌素：由細(xì)菌質(zhì)粒編碼產(chǎn)生的只能抑制或殺滅近緣細(xì)菌或同種不同菌株的蛋白質(zhì)。Col質(zhì)粒類型：----非接合型：松弛型----接合型：嚴(yán)緊型當(dāng)前第26頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)4）Ti質(zhì)粒：合成冠癭堿、大型質(zhì)粒5）Ri質(zhì)粒：產(chǎn)生根毛、大型質(zhì)粒當(dāng)前第27頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)7）降解質(zhì)粒：降解、接合當(dāng)前第28頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)8）致病性質(zhì)粒：溶血素、腸毒素（S.aureus）9）共生固氮質(zhì)粒：----結(jié)瘤基因（nod）----固氮基因（nif）10）隱蔽質(zhì)粒：---未有明確表型當(dāng)前第29頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●工程質(zhì)粒----pBR322主要特點(diǎn)：1）分子量小2）穩(wěn)定、松弛型復(fù)制3）可大量擴(kuò)增4）容易分離5）可攜帶小于10kb外源DNA 6）帶有2個(gè)選擇標(biāo)記;7）多個(gè)單一酶切位點(diǎn)8）容易轉(zhuǎn)化當(dāng)前第30頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●利用選擇標(biāo)記鑒別攜帶外源片段的轉(zhuǎn)化子(雙抗菌素對照篩選）當(dāng)前第31頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)建議讀物當(dāng)前第32頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

§.2基因突變和誘變育種

一、基因突變●野生型菌株：從自然界分離獲得的菌株，稱之為~?！窕九囵B(yǎng)基(MM)：滿足野生型菌株生長最低營養(yǎng)要求的合成培養(yǎng)基。當(dāng)前第33頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)（一）突變類型●營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株由于突變而喪失了某種營養(yǎng)合成能力，而無法在基本培養(yǎng)基上生長的變異類型。

表示：基因：his+，his-；表型：His+，His-當(dāng)前第34頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●抗性突變型：野生型菌株由于突變而產(chǎn)了對某些化學(xué)藥物或致死物理因子抗性變異類型。表示：基因：

strr、strs；tetr、tets；

表型：Strr，Strs當(dāng)前第35頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

●條件致死突變型：某些菌株或病毒經(jīng)基因突變后，在某種條件可生長并實(shí)現(xiàn)表型，而在另一條件卻無法生長繁殖的突變類型。(如溫度敏感突變株：Ts）●形態(tài)突變株●抗原突變株●產(chǎn)量突變株當(dāng)前第36頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●突變株類型劃分：----選擇性突變株：營養(yǎng)缺陷型、抗性突變型、條件致死突變型----非選擇突變株：形態(tài)、抗原、產(chǎn)量突變型當(dāng)前第37頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)（二）突變率及其撿出●突變率：某一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生突變的幾率。常用單位群體中每一世代產(chǎn)生的突變株的數(shù)目來表示。當(dāng)前第38頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●突變株的撿出及突變率的計(jì)算撿出方法：1）選擇性突變株----營養(yǎng)缺陷型----抗藥性突變回復(fù)突變:當(dāng)前第39頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)（三）基因突變的自發(fā)性與不對稱性

●突變的自發(fā)性：基因可自發(fā)產(chǎn)生突變。（輻射、自身有害物質(zhì)、堿基配對錯(cuò)誤）●突變的不對應(yīng)性：突變性狀與引起突變的環(huán)境因素?zé)o直接對應(yīng)關(guān)系。當(dāng)前第40頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)

(Lederberg)當(dāng)前第41頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)（四）基因突變及其機(jī)制1、誘發(fā)突變(點(diǎn)突變,畸變)1)點(diǎn)突變(1)堿基置換---轉(zhuǎn)換---顛換當(dāng)前第42頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●可能的突變型：錯(cuò)義突變無義突變同義突變當(dāng)前第43頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

●相關(guān)的誘變劑－－直接引起置換：

亞硝酸、亞硝基胍、羥胺、烷化劑－－間接引起置換：堿基類似物（5－BU,5-AU)當(dāng)前第44頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)(2）移碼突變DNA序列中插入或缺失少數(shù)核苷酸，從而使該處后面遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生改變的突變。當(dāng)前第45頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)2）染色體畸變

DNA分子的大段損傷，包括缺失、重復(fù)、插入、易位（轉(zhuǎn)座）和倒拉等。●轉(zhuǎn)座：DNA分子通過非同源重組方式，從染色體的某一部位轉(zhuǎn)移到另一部位的現(xiàn)象。

當(dāng)前第46頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●轉(zhuǎn)座因子凡具有轉(zhuǎn)座作用的DNA序列均稱之~。

特點(diǎn)：---轉(zhuǎn)座作用---末端重復(fù)序列---轉(zhuǎn)座酶基因當(dāng)前第47頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●轉(zhuǎn)座因子類型插入序列轉(zhuǎn)座子(或稱復(fù)合轉(zhuǎn)座子）轉(zhuǎn)座噬菌體當(dāng)前第48頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

a）插入序列(IS)b）轉(zhuǎn)座子(Tn)當(dāng)前第49頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●轉(zhuǎn)座機(jī)理當(dāng)前第50頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●轉(zhuǎn)座子的遺傳效應(yīng)和生物學(xué)意義（復(fù)制型轉(zhuǎn)座）遺傳效應(yīng)1）插入突變2）DNA重排意義：進(jìn)化，獲得突變株，抗藥性鑒定必須基因當(dāng)前第51頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

（五）紫外線對DNA的損傷及其修復(fù)1．損傷的機(jī)理：

形成胸腺嘧啶二聚體2、修復(fù)作用

1）光復(fù)活作用光解酶-二聚體復(fù)合物為光激活

當(dāng)前第52頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)2.暗修復(fù)作用：

當(dāng)前第53頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)3、重組修復(fù)4、SOS修復(fù)當(dāng)前第54頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

二、

突變與育種（一）自發(fā)突變與育種(定向培育）（二）誘變育種當(dāng)前第55頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)1、基本原則（應(yīng)考慮的問題）1）誘變劑的選擇(有效性,安全性，簡便性)當(dāng)前第56頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●誘變劑誘變效果測定（回復(fù)突變率的測定）---艾姆氏試驗(yàn)(檢測三致物質(zhì)）當(dāng)前第57頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)2）出發(fā)菌株3）誘變菌株的狀態(tài)----處理單胞（孢）懸液----選擇單倍體或單核細(xì)胞4）劑量：低劑量；(表示方法)5）提高檢出效率----利用形態(tài)特征----鑒別培養(yǎng)基當(dāng)前第58頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●利用鑒別培養(yǎng)基檢出突變株----蛋白酶高活性菌株的檢出（酪蛋白為N源，加HgCl2觀察透明圈）----淀粉酶高活性菌株的檢出（淀粉為C源，加I2液觀察透明圈）----有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的檢出（培養(yǎng)基加CaCO3觀察透明圈）當(dāng)前第59頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)6）設(shè)計(jì)高效的篩選方案----初篩（數(shù)量、定性）----復(fù)篩（質(zhì)量、定量）7）創(chuàng)新性的篩選方法當(dāng)前第60頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)2、營缺型的篩選（1）三種基本培養(yǎng)基●基本培養(yǎng)基[-]:滿足野生型菌株生長最低營養(yǎng)要求的組合培養(yǎng)基?！裢耆囵B(yǎng)基[+]：滿足所有營缺型菌株生長營養(yǎng)要求的天然或半組合培養(yǎng)基。●補(bǔ)充培養(yǎng)基[A]，[B]：滿足相應(yīng)營缺型菌株生長營養(yǎng)要求的組合或半組合培養(yǎng)基。當(dāng)前第61頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)（2）三類遺傳型個(gè)體●野生型：從自然界分離獲得的菌株不論營養(yǎng)狀況如何，均稱為~。（A+B+）●營缺型：野生型菌株經(jīng)誘變由于代謝障礙，而必須添加某種物質(zhì)才能生長的突變株。

（A+B-）（A-B+）●原養(yǎng)型：營缺型回復(fù)突變后的菌株。

（A+B+）當(dāng)前第62頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

基本基完全基補(bǔ)充基野生型+++營缺型—++原養(yǎng)型+++當(dāng)前第63頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)（3）篩選步驟

1）誘變2）淘汰野生型：抗生素法、菌絲過濾法3）檢出：夾層培養(yǎng)法；限量補(bǔ)充法逐個(gè)檢出法；影印平板法

當(dāng)前第64頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●夾層培養(yǎng)法當(dāng)前第65頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)（4）鑒定缺陷型(生長譜法)1）制備基本培養(yǎng)基；2）加充分洗滌菌懸液；3）加待測營養(yǎng)物；4）觀察生長。當(dāng)前第66頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●定位（點(diǎn)）誘變盒式誘變寡核苷酸引物誘變當(dāng)前第67頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)Strainimprovementforfermentationandbiocatalysisprocessesbygeneticengineeringtechnology建議讀物當(dāng)前第68頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)§.3基因重組

●基因重組（遺傳重組）：兩個(gè)獨(dú)立基因組內(nèi)的遺傳物質(zhì)，通過一定的途徑轉(zhuǎn)移到一起，形成新的穩(wěn)定的基因組過程。當(dāng)前第69頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●遺傳工程

----基因重組技術(shù)經(jīng)典、同源、生物自然屬性、體內(nèi)----DNA重組技術(shù)：分子水平、同--異源、體外當(dāng)前第70頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)一、原核生物的基因重組（一）轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收供體菌游離的DNA片段而獲得部分遺傳性狀的現(xiàn)象。當(dāng)前第71頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)1、轉(zhuǎn)化的基本條件（1）感受態(tài)：受體菌最容易接受外源DNA片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。影響因素：---遺傳因素（感受態(tài)因子;種屬的特異性；）---外部因素（CAMP、聚乙二醇、二價(jià)陽離子---低溫低滲CaCl處理、培養(yǎng)條件）

當(dāng)前第72頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

●轉(zhuǎn)化頻率：0.1～1%（很低），最高10%，質(zhì)粒

為良好的轉(zhuǎn)化因子?！駶舛龋?0-5ug/ml●結(jié)構(gòu)：一般轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈DNA，少數(shù)為

線狀單鏈DNA?！翊笮。好恳晦D(zhuǎn)化DNA片段分子量約1×107，約占染色體組0.3%，平均15個(gè)基因。（2）轉(zhuǎn)化因子當(dāng)前第73頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●轉(zhuǎn)化因子非交換當(dāng)前第74頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)2、轉(zhuǎn)化過程

1）酶解和吸收單鏈2）同源區(qū)配對、整合3）復(fù)制4）形成轉(zhuǎn)化子當(dāng)前第75頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)3.轉(zhuǎn)染(Tranfection)提純的病毒DNA或RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞并增殖出正常的病毒后代現(xiàn)象。IfDNAfromavirusisusedasthecloningvector,theprocessiscalledtransfection.

(Introductiontomicrobiology,JohnL.Ingraham)當(dāng)前第76頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介,使受體細(xì)胞獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。當(dāng)前第77頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)1、普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)

完全缺陷噬菌體對供體任何DNA小片段進(jìn)行“誤包”,而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，包括完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種類型。當(dāng)前第78頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

●完全轉(zhuǎn)導(dǎo)(形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子)感染復(fù)數(shù)：感染的噬菌體數(shù)/被感染細(xì)胞數(shù)當(dāng)前第79頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)：(僅形成一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)子,產(chǎn)生小菌落)●經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入受體菌的供體菌DNA片段，在受體菌內(nèi)不交換、整合、復(fù)制，也不迅速消失，僅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯、性狀表達(dá)轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。

當(dāng)前第80頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)２、局限轉(zhuǎn)導(dǎo)部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌少數(shù)特定的基因攜帶到受體菌中并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。

A、低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（ＬＦＴ）１）噬菌體感染２）誘導(dǎo)裂解３）不正常切離（低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物）（dgal、dbio）４）形成局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子當(dāng)前第81頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)B、高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（ＨＦＴ）1）概念●低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)(LFT)裂解物：溶源噬菌體感染后，帶少數(shù)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的細(xì)胞裂解物?！耠p重溶源菌：同時(shí)感染有正常噬菌體和缺陷噬菌體的受體菌。(來源：LFT裂解物以高的感染復(fù)數(shù)感染宿主)當(dāng)前第82頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●雙重溶源菌當(dāng)前第83頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)2）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：在局限轉(zhuǎn)導(dǎo)中，用雙重溶源菌誘導(dǎo)后產(chǎn)生的高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌可獲得的高達(dá)50%的轉(zhuǎn)導(dǎo)子，稱之~。3）過程：1）雙重溶源菌2）誘導(dǎo)，獲得高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物3）高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物低m.o.i感染受體菌當(dāng)前第84頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)（3）溶源轉(zhuǎn)變

溫和噬菌體感染宿主后，宿主通過溶源化而獲得免疫性以外新性狀的現(xiàn)象。●白喉毒素：白喉?xiàng)U菌的?-噬菌體帶有“TOX”基因當(dāng)前第85頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)（三）接合

●接合：通過細(xì)胞間的直接接觸,由質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象.●接合子：通過接合而獲得新的遺傳性狀的受體細(xì)胞。當(dāng)前第86頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)●存在方式:四種接合型菌株1、F-當(dāng)前第87頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)

2、F+菌株Orit：起始子當(dāng)前第88頁\共有102頁\編于星期四\16點(diǎn)3、Hfr菌株：高頻重組菌株，F(xiàn)+整合在染色體上成為附加體的狀態(tài)，若與F-接合，有很高的重組頻率。1）細(xì)胞接觸2）Hfr斷裂、轉(zhuǎn)移、復(fù)制3）接合中斷4）形成接合子當(dāng)前第89頁\共有102頁\編于星期四\16