肺結(jié)核痰檢質(zhì)量控制培訓(xùn)資料

肺結(jié)核痰檢質(zhì)量控制萬建國各級各類試驗室職責(zé)：縣（區(qū)）級結(jié)核病試驗室在省、地（市）參比試驗室指導(dǎo)下，制訂本縣（市）結(jié)核病試驗室檢驗工作計劃。按照國家結(jié)核病試驗室質(zhì)量確保體系要求，做好本試驗室開展檢驗項目標(biāo)室內(nèi)質(zhì)控工作，負擔(dān)同級間試驗室（縣級）第一復(fù)檢者盲法復(fù)檢工作，在所屬地（市）級試驗室組織下，開展痰涂片鏡檢盲法復(fù)檢。按國家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化操作程序常規(guī)開展痰涂片鏡檢工作，依照實際情況有能力、具備條件能夠開展結(jié)核菌培養(yǎng)。接收上級試驗室督導(dǎo)、現(xiàn)場評定和定時培訓(xùn)。對轄區(qū)內(nèi)鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院查痰點工作提供技術(shù)支持。鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點在我國結(jié)核病防治工作中發(fā)揮著主要作用，它能夠方便結(jié)核病可疑癥狀者就醫(yī)，增加病人發(fā)覺。各地應(yīng)依照實際情況設(shè)置鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點。鄉(xiāng)鎮(zhèn)查痰點應(yīng)該按衛(wèi)生部要求開展工作，國家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化操作程序開展痰涂片鏡檢工作，并按要求送痰涂片至縣級進行復(fù)檢；接收上級試驗室培訓(xùn)、現(xiàn)場督導(dǎo)和技術(shù)指導(dǎo)。醫(yī)療機構(gòu)試驗室醫(yī)療機構(gòu)結(jié)核病試驗室在對應(yīng)級別臨床檢驗中心和上級結(jié)核病試驗室技術(shù)指導(dǎo)下，開展質(zhì)量有確保結(jié)核病試驗室檢驗工作，嚴(yán)格按攝影關(guān)各項標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化操作程序進行試驗室相關(guān)活動，并接收結(jié)核病試驗室質(zhì)量控制。涂片鏡檢試驗室基本要求：試驗室應(yīng)有試驗室分區(qū)（涂片染色區(qū)域和讀片鏡檢區(qū)域），布局應(yīng)該符合生物安全二級（BSL-2）要求；試驗室應(yīng)在靠近出口處設(shè)置洗手池；試驗室墻壁、天花板和地面應(yīng)平整、易清潔、不滲水、耐化學(xué)品和消毒劑腐蝕，地面應(yīng)防滑；試驗操作臺面應(yīng)能防水，耐腐蝕、耐熱；試驗室中廚柜和試驗臺應(yīng)牢靠，廚柜、試驗臺彼此之間應(yīng)保持一定距離，方便于清潔；對于試驗室中可開啟窗戶，應(yīng)安裝紗窗；試驗室內(nèi)應(yīng)確保工作照明，防止無須要反光和強光；應(yīng)有適當(dāng)消毒設(shè)備；在試驗室門口處應(yīng)設(shè)掛衣裝置，個人便裝與試驗室工作服分開放置；10、試驗室應(yīng)該裝備開展痰涂片檢驗所需要儀器和設(shè)備。檢驗對象及要求：痰涂片檢驗（一）痰盒推薦使用螺旋蓋、可密封、廣口塑料盒搜集痰標(biāo)本，參考規(guī)格：直徑4厘米，高度2厘米。醫(yī)務(wù)人員在容器上應(yīng)注明患者姓名、編號（門診序號或登記號）、檢驗項目、痰標(biāo)本序號1、2、3（1＝當(dāng)日即時痰，2＝夜間痰，3＝次日晨痰），然后交給患者。（二）標(biāo)本采集1、時間依照痰標(biāo)本采集時間，可將標(biāo)本分為三類：即時痰：就診時深呼吸后咳出痰液；晨痰：患者晨起立刻用清水漱口后，咳出第2口、第3口痰液；夜間痰：送痰前一日，患者晚間咳出痰液；2、痰采集方法宣傳教育對疑似肺結(jié)核病者，臨床醫(yī)護人員應(yīng)經(jīng)過解釋，使其充分了解標(biāo)本質(zhì)量對對應(yīng)檢驗項目標(biāo)主要性，示范并指導(dǎo)其掌握從肺部深處咳痰方法；如患者識字，可提供宣傳教育材料。3、地點因為當(dāng)患者咳嗽、咳痰時，易于產(chǎn)生含有結(jié)核菌氣溶膠，感染周圍人群機率較高，故采集痰標(biāo)本時應(yīng)在遠離人群開放空間進行，或在通風(fēng)良好室內(nèi)進行。患者留取痰標(biāo)本，應(yīng)由檢驗人員或經(jīng)培訓(xùn)專員目視檢驗標(biāo)本質(zhì)量（尤其是用于首次診療痰標(biāo)本）。合格痰標(biāo)本應(yīng)是患者深呼吸后，由肺部深處咳出分泌物，標(biāo)本量通常在3～5ml。干酪痰：標(biāo)本外觀以黃色（或奶酪色）、膿樣、團塊狀肺部分泌物為主，粘度較粘液痰低，制片時較易涂抹；涂片染色后鏡檢，可發(fā)覺大量膿性炎癥細胞、肺上皮脫落細胞。因為這類標(biāo)本是由肺部深處咳出，對肺結(jié)核診療最有價值，故AFB檢出率較高。血痰：這類標(biāo)本是因粘液痰或干酪痰標(biāo)本中混有血液而形成，顏色為褐色或深褐色、鮮紅色或伴有血絲；涂片染色后鏡檢除能夠觀察到粘液痰或干酪痰細胞特征外，含新鮮血液標(biāo)本中可見到被染色血細胞。因為含血標(biāo)本易干擾AFB鏡檢結(jié)果，故在制片時應(yīng)盡可能防止挑取含血標(biāo)本。粘液痰：標(biāo)本外觀以白色、粘稠度較高肺部和支氣管分泌物為主，制片時需仔細涂抹；涂片染色后鏡檢時，鏡下可見支氣管內(nèi)膜纖毛柱狀上皮細胞（細胞較長且形態(tài)不規(guī)則、細胞核和細胞質(zhì)著色均較深，細胞一端可見著色較淺纖毛），伴有少許肺上皮脫落細胞（多數(shù)為圓形、細胞核較小且著色較細胞質(zhì)深，核質(zhì)比大于1:3）、膿性炎癥細胞（卵圓形、細胞核占細胞百分比較大且著色較深，核質(zhì)比低于1:1）、口腔脫落細胞及口腔寄生菌。這類標(biāo)本AFB檢出率較唾液高。唾液：目視觀察標(biāo)本整體外觀，以透明或半透明水樣、粘度較低口腔分泌物為主，標(biāo)本中有時伴有氣泡；涂片染色鏡檢時，鏡下可見少許口腔上皮脫落細胞（形態(tài)不規(guī)則、細胞核著色較細胞質(zhì)深，核質(zhì)比靠近或大于1:2）和口腔內(nèi)寄生菌，有時可見食物殘渣。因為這類標(biāo)本進行AFB檢驗時檢出率很低，用于對患者確定診療時是不合格標(biāo)本。合格痰標(biāo)本通常為干酪痰、褐色血痰或含少許新鮮血液血痰、粘液痰。痰標(biāo)本不合格時，應(yīng)深入指導(dǎo)并要求病人重新送檢。進行細菌學(xué)檢驗時應(yīng)在登記本和檢驗匯報單上注明標(biāo)本性狀，以供分析結(jié)果時參考。直接涂片檢驗檢驗對象依照檢驗?zāi)繕?biāo)分為兩類：確定診療，發(fā)覺傳染源；療效評價，作為確定化療方案和治療效果評價指標(biāo)。（1）確定診療：凡因結(jié)核病癥狀求診及轉(zhuǎn)診可疑肺結(jié)核患者，均應(yīng)進行痰涂片檢驗。確定診療涂片檢驗應(yīng)采集3個合格痰標(biāo)本。就診當(dāng)初在門診留一份“即時痰”標(biāo)本，同時給患者2個痰盒，囑患者留取“夜間痰”和“晨痰”，于次日交驗。（2）療效評價：凡已確診、登記、治療肺結(jié)核患者，在化療期間按照要求應(yīng)定時查痰：①初治涂陽患者在療程強化期末、繼續(xù)期滿3個月和繼續(xù)期結(jié)束時（通常為治療后第2、5和6個月）；復(fù)治涂陽患者在療程強化期末、繼續(xù)期滿3個月和繼續(xù)期結(jié)束時（通常為治療后第2、5和8個月）分別搜集一份晨痰和即時痰進行涂片檢驗。②初、復(fù)治涂陽患者在療程強化期結(jié)束時，痰菌仍為陽性者，應(yīng)在1個月時增加痰涂片檢驗一次；若復(fù)治涂陽患者治療滿3個月時痰菌仍陽性，應(yīng)在治療滿5個月增加痰涂片檢驗一次。③確診、登記涂陰肺結(jié)核患者，即使患者因故未接收治療，也應(yīng)在登記后滿2和6個月時進行痰菌檢驗（一）玻片制備1、用于抗酸菌（AFB）檢驗載玻片要求（1）一張載玻片上只能涂抹一份痰標(biāo)本。（2）每張載玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片檢驗。（3）應(yīng)使用以95%乙醇擦拭（或浸泡）脫脂，經(jīng)干燥、清潔、無油污、無劃痕新載玻片制備涂片，在玻片反面一端1/3處注明試驗室序號及標(biāo)本序號（如使用載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號；如使用載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫）。2、制備涂片（1）小心打開承載痰標(biāo)本容器，預(yù)防產(chǎn)生氣溶膠或使標(biāo)本外溢。（2）仔細觀察標(biāo)本，使用折斷竹簽茬端，挑取痰標(biāo)本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05～0.1ml，于玻片正面右側(cè)2/3處，均勻涂抹成10×20mm卵圓形痰膜。痰膜朝上靜置自然干燥后（通常約需要30分鐘）進行染色鏡檢。（3）涂抹完成后痰標(biāo)本，在結(jié)果匯報前應(yīng)暫時保留。（4）為了確保檢驗人員安全，禁止在涂抹痰標(biāo)本同時，對載玻片進行加熱。（二）染色1、萋爾－尼爾遜染色法（Ziehl-Neelson），簡稱萋尼氏染色法（Z-N）（1）試劑配制：①石碳酸復(fù)紅染色液：堿性復(fù)紅儲存液：堿性復(fù)紅8g加95%酒精至100ml，充分振蕩使復(fù)紅溶解。5%石碳酸水溶液：40-50℃水浴加熱石碳酸使之融解，取5g石碳酸復(fù)紅工作液：10ml經(jīng)定性濾紙過濾堿性復(fù)紅儲存液與90ml5%石碳酸水溶液充分振蕩、混合均勻后，使用定性濾紙過濾。②5%鹽酸乙醇脫色液：5ml濃鹽酸（35%）與95ml95%乙醇混合。③亞甲蘭復(fù)染液：儲存液：0.3g亞甲蘭溶于50ml95%乙醇中，完全溶解后加蒸餾水至終體積100ml。亞甲蘭復(fù)染液：以蒸餾水3倍稀釋0.3%亞甲蘭儲存液，經(jīng)充分振蕩、混合均勻后，亞甲蘭終濃度為0.1%。使用定性濾紙過濾，即得亞甲蘭復(fù)染液。（2）染色步驟：①涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持10mm以上距離；火焰固定（在5秒鐘內(nèi)將玻片置于火焰上烤4次）。②滴加石碳酸復(fù)紅染液，蓋滿痰膜，火焰加熱至出現(xiàn)蒸汽后，脫離火焰，保持染色5分鐘。染色期間應(yīng)一直保持痰膜被染色液覆蓋，必要時可續(xù)加染色液。加溫時勿使染色液沸騰。③流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染色液，瀝去標(biāo)本上剩下水。④自痰膜上端外緣滴加脫色劑充滿痰膜，脫色3分鐘；如有必要，需流水洗去脫色液后，再次脫色至痰膜無可視紅色為止。⑤流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩下水。⑥滴加亞甲藍復(fù)染液，染色30秒鐘。⑦流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復(fù)染液，然后瀝去標(biāo)本上剩下水。待玻片干燥后鏡檢。⑧一張染色合格玻片，因為被亞甲蘭染色而呈亮藍色。將染色后玻片放置在報紙上，假如透過痰膜不能分辨報紙上文字，則表明該玻片涂抹過厚。2、熒光染色法AFB采取熒光染色法鏡檢，只限于那些每日工作量較大（日讀片數(shù)超出25張）、具備熒光顯微鏡、且鏡檢人員閱讀熒光染色玻片具備豐富經(jīng)驗試驗室開展。（1）試劑配制：①染色劑（金胺O染液）：金胺O▲ 1 g石碳酸 50 ml乙醇 100 ml補蒸餾水至 1000 ml▲金胺O（auramineO，分子式為C17H21N3·HCl）：用于AFB染色時必須使用最低染料含量約80％生物染色劑。②脫色劑：3%鹽酸乙醇（配制方法參考萋尼氏染色）。③復(fù)染劑：0.5%高錳酸鉀水溶液。（2）染色步驟：①玻片經(jīng)火焰固定后,滴加染色劑蓋滿玻片，染色30分鐘；流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩下水。②自痰膜上端外緣滴加脫色劑，充滿痰膜，脫色3分鐘或至無色,流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑。③滴加復(fù)染劑復(fù)染2分鐘，瀝去復(fù)染液，自然干燥，準(zhǔn)備鏡檢。（三）鏡檢1、萋尼氏染色玻片鏡檢使用10×目鏡雙目顯微鏡讀片。取染色完成且已干燥玻片，痰膜向上放置在玻片臺上并以卡尺固定。首先使用40×物鏡，轉(zhuǎn)動卡尺移動玻片至痰膜左端，將光線調(diào)整至適當(dāng)亮度，調(diào)整焦距至可見細胞形態(tài)；移開40×物鏡，在玻片上滴1～2滴鏡油，使用100×油鏡進行細致觀察。在淡藍色背景下，抗酸菌呈紅色；其它細菌和細胞呈藍色。為預(yù)防AFB交叉污染，禁止油鏡鏡頭直接接觸玻片上痰膜。因為香柏油（cedarwoodimmersionoil）能夠溶解復(fù)紅染料，使萋尼氏染色退色，而且輕易干燥凝結(jié)，對油鏡頭造成損害；故推薦使用專門用于100×油鏡、不干燥、不變硬鏡油（immersionoil）。讀片時，首先應(yīng)從左向右觀察相鄰視野；當(dāng)玻片移動至痰膜一端時，縱向向下轉(zhuǎn)換一個視野，然后從右向左觀察，依這類推。通常20mm痰膜，使用100×油鏡，每行可觀察約100個視野。仔細觀察完300個視野，通常需要5分鐘以上；每個工作日，一位鏡檢人員玻片閱讀量不要超出25張，且連續(xù)閱讀10～12張玻片后，應(yīng)休息20分鐘左右。2、熒光染色玻片鏡檢玻片放置在玻片臺上并以卡尺固定后，首先以10×目鏡、20×物鏡進行鏡檢，發(fā)覺疑為AFB桿狀熒光顆粒時，使用40×物鏡確認。在暗背景下，抗酸菌發(fā)出桿狀熒光。對應(yīng)波長光線激發(fā)染料產(chǎn)生可視光能力，伴隨時間而衰減。故熒光染色后涂片應(yīng)于當(dāng)日鏡檢；假如玻片數(shù)量過多，應(yīng)將涂片放置于4℃（四）結(jié)果匯報1、萋尼氏染色鏡檢結(jié)果分級匯報標(biāo)準(zhǔn)抗酸桿菌陰性（－）：連續(xù)觀察300個不一樣視野，未發(fā)覺抗酸桿菌。匯報抗酸桿菌菌數(shù)：1～2條抗酸桿菌/300視野。抗酸桿菌陽性（1＋）：3～9條抗酸桿菌/100視野?？顾釛U菌陽性（2＋）：1～9條抗酸桿菌/10視野?？顾釛U菌陽性（3＋）：1～9條抗酸桿菌/每視野?？顾釛U菌陽性（4＋）：≥10條抗酸桿菌/每視野。2、熒光染色鏡檢結(jié)果分級匯報標(biāo)準(zhǔn)熒光染色抗酸桿菌陰性（-）：0條/50視野。熒光染色抗酸桿菌陽性（匯報抗酸菌數(shù)）：1～3條/50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（1+）：