冠心病痰瘀證候與E選擇素G98T及S128R基因多態(tài)性的關(guān)系研究

冠心病痰瘀證候與Ｅ選擇素Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多態(tài)性的關(guān)系研究【摘要】【目的】從基因多態(tài)性角度探討冠心病痰瘀證的實(shí)質(zhì)?！痉椒ā咳脒x１０７例研究對(duì)象，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性核苷酸分型技術(shù)檢測(cè)血清E選擇素Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型，同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清Eselectin濃度。【結(jié)果】冠心病痰瘀證組EselectinＧ９８Ｔ的ＧＧ基因型、Ｇ等位基因，EselectinＳ１２８Ｒ的ＳＲ基因型、Ｒ等位基因頻率高于正常組，但經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者之間差異無(wú)顯著性意義。冠心病痰瘀證型組患者血清Eselectin水平高于正常組?！窘Y(jié)論】冠心病痰瘀證可能與Ｅ選擇素Ｇ９８Ｔ的Ｇ等位基因、Ｅ選擇素Ｓ１２８Ｒ的Ｒ等位基因有一定的相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】冠狀動(dòng)脈疾?。惶底C；血瘀；E選擇素/血液

冠心病是嚴(yán)重影響人類健康生活的疾病之一，炎癥在冠心病的形成發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。遺傳流行病學(xué)研究顯示冠心病的發(fā)病有遺傳因素的作用，目前相繼發(fā)現(xiàn)一些基因多態(tài)性影響脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、血栓形成及血管收縮與舒張等病理生理過(guò)程，與冠心病發(fā)生的危險(xiǎn)性增加關(guān)系密切。痰瘀證候是冠心病的常見(jiàn)證候。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法檢測(cè)冠心病痰瘀證候患者的血清Ｅ選擇素Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型，以期發(fā)現(xiàn)其中的內(nèi)在聯(lián)系。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1研究對(duì)象

11資料來(lái)源研究對(duì)象均來(lái)源于２００６年２月～２００７年３月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科臨床確診為冠心病心絞痛和急性心肌梗死的住院病例；同時(shí)設(shè)立正常組作為對(duì)照。所有研究對(duì)象均為漢族廣東省常住人口。

12診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照１９７９年國(guó)際心臟病學(xué)會(huì)及世界衛(wèi)生組織關(guān)于缺血性心臟病的診斷［１］；辨證標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》［２］中的胸痹心痛辨證分型及沈紹功等［３］《中醫(yī)心病診斷療效標(biāo)準(zhǔn)與用藥規(guī)范》。具體中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)痰濁證組：胸脘悶痛痞滿，口黏乏味，納呆脘脹，苔膩或黃或白滑，脈滑或數(shù)。血瘀證組：胸脘刺痛固定，面晦唇青，怔忡不寧，舌質(zhì)紫暗或見(jiàn)紫斑或舌下脈絡(luò)紫脹，脈澀或結(jié)代。痰瘀證組：胸痛或胸脘痞滿，舌質(zhì)紫暗，或有瘀點(diǎn)、瘀斑，舌苔厚膩，脈弦或滑。同時(shí)具備以上四大主癥者可辨證為痰瘀證。

13一般資料入選研究對(duì)象共１０７例，其中正常組２０例，男６例，女１４例，平均年齡為歲，體質(zhì)量指數(shù)為kg/m2。冠心病組８７例，其中痰瘀證組５５例，男３８例，女１７例，平均年齡為歲，體質(zhì)量指數(shù)為kg/m2；血瘀證組２０例，男１１例，女９例，平均年齡為歲，體質(zhì)量指數(shù)為kg/m2；痰濁證組１２例，男８例，女４例，平均年齡為歲，體質(zhì)量指數(shù)為kg/m2。各組在年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)方面比較差異無(wú)顯著性意義,具有可比性。

2研究方法

21標(biāo)本收集選擇血清／全血作為觀察樣本，病人入院后次日凌晨６時(shí)進(jìn)行采血，標(biāo)本放置于冰箱，并于當(dāng)日對(duì)所需血清標(biāo)本進(jìn)行以3000r/min離心10min，取上清液，置于-３０℃冰箱保存，全血標(biāo)本置于-７０℃冰箱保存。

22檢測(cè)指標(biāo)及方法Eselectin濃度采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定，由本院實(shí)驗(yàn)中心完成；采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性基因分析法檢測(cè)EselectinＧ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型，由中山大學(xué)組織配型中心完成。血清Eselectin酶聯(lián)免疫法測(cè)定具體操作方法：血清標(biāo)本置于室溫下解凍；按說(shuō)明準(zhǔn)備試劑、標(biāo)準(zhǔn)品及樣本；每孔加入100μL測(cè)定稀釋液；每孔加入１００μL標(biāo)準(zhǔn)品或已稀釋的樣本。室溫下在振蕩機(jī)上以r/min進(jìn)行振蕩，孵育15h；抽吸清洗６次，將微孔在吸水紙上扣干；每孔加入１００μL酶聯(lián)物，室溫下振蕩孵育３０min；每孔加入１００μL顯色液，室溫避光孵育1h；每孔加入５０μL終止液，３０min內(nèi)在４５0nm處讀Ｄ值；以Ｄ值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)血清樣品的Ｄ值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多態(tài)性的關(guān)系研究EselectinＧ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型檢測(cè)的ＰＣＲＲＦＬＰ基因分析法：使用試劑：ＤＮＡ分子標(biāo)準(zhǔn)ＤＬ２０００Marker、QIAampDNABloodMiniKit(Qiagen公司產(chǎn)品）、TaqDNAPolymerase、DNTPs、HphI限制性內(nèi)切酶、PstI限制性內(nèi)切酶;外周血白細(xì)胞ＤＮＡ的提取：全部受試者均取外周靜脈血2mL，ＥＤＴＡ抗凝，采用QiagenDNA抽提試劑盒提取基因組ＤＮＡ，步驟①?。保祄L離心管，注明名字及編號(hào)；②管底加ProteaseK20μL，全血２００μL，BufferAL200μL，混勻后５６℃水?。保癿in;③取無(wú)水乙醇２００μL加入管中，混勻，轉(zhuǎn)移入SpinColumn,8000r/min離心５min;④棄濾液，SpinColumn轉(zhuǎn)移入清潔收集管中，加ＡＷ１液５００μL，8000r/min離心５min；⑤棄濾液，SpinColumn轉(zhuǎn)移入另一清潔管中，加ＡＷ２液５００μL，8000r/min離心５min；⑥棄濾液，SpinColumn轉(zhuǎn)移入已標(biāo)名字的１５mL離心管中，加BufferAE或蒸餾水２００μL，8000r/min離心５min；-２０℃保存?zhèn)溆?。聚合酶鏈反?yīng)：①引物序列：引物序列參考文獻(xiàn)［９］并結(jié)合PrimerExpressSoftware20版設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表１，全部引物由Invitrogen公司合成。②反應(yīng)體系：１０倍PCRBuffer５μL、１０mmoldNTPs１μL、上下游引物各１０pmol、Taq酶３Ｕ、膜板５μL、加無(wú)菌去離子水至５０μL。③反應(yīng)條件：９３℃３min預(yù)變性，９３℃３0s，各外顯子參照上述退火溫度，共３５個(gè)循環(huán)，７2℃延伸１０min。反應(yīng)后檢測(cè)，?。甫蘈ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物用２0g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，ＰＣＲ產(chǎn)物在２0g/L瓊脂糖中電泳檢測(cè)后-２０℃保存?zhèn)溆?。④結(jié)果：ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)２0g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，片段大小符合預(yù)先設(shè)計(jì)。ＰＣＲ限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析：①HphI反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)混合物10μL(約1μgofDNA)，10倍NEBBuffer2μL，HphI1μL，加水、無(wú)核酸酶試劑至20μL，溫和震蕩，短暫離心數(shù)秒。３７℃酶切過(guò)夜。取10μL酶切產(chǎn)物用２0g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳；②PstI反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)混合物10μL(約1μgofDNA)，１０倍HBuffer２μL，PstI1μL，加水、無(wú)核酸酶試劑至２０μL，溫和震蕩，短暫離心數(shù)秒。３７℃酶切4h。取10μL酶切產(chǎn)物用２0g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

表1PCR引物序列

Table1PCRprimersequence基因PCR引物(5→3)退火溫度(℃)長(zhǎng)度(bp)G98TTGCCCAAAATCTTAGGATGCAAGCCCAGGGAAGAACACAT59332S128RAGTAATAGTCCTCCTCATCATGACCATCTCAAGTGAAGAAAGA55186

2３統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用ＳＰＳＳ１１５軟件包進(jìn)行分析。分類資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用±s表示，兩組以上均數(shù)的組間比較采用OnewayANOVA檢驗(yàn)，用Bonferroni方法進(jìn)行兩兩比較?；蛐秃偷任换蝾l率采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)，研究對(duì)象與HardyWeinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因頻率的組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

3結(jié)果

３１各組Eselectin水平比較表２結(jié)果顯示，冠心病各證型組患者血清Eselectin水平均高于正常組，但各證型組間比較，差異無(wú)顯著性意義。表2各組Eselectin水平比較①Ｐ＜００１，與正常組比較３2各組EselectinG98T及Ｓ１２８Ｒ基因型比較將符合納入標(biāo)準(zhǔn)且資料完備的８２例應(yīng)用ＰＣＲＲＦＬＰ測(cè)定基因型，其中正常組１６例，痰瘀組４５例，血瘀組１３例，痰濁組８例，因血瘀組和痰濁組檢測(cè)例數(shù)較少，故將其合并為非痰瘀組，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

３２1Eselectin的Ｇ９８Ｔ酶切結(jié)果見(jiàn)圖１。

322Eselectin的S128R酶切結(jié)果見(jiàn)圖2。

323各組Eselectin的G98T基因型和等位基因的頻率分布表3結(jié)果顯示，冠心病痰瘀組GG基因型、G等位基因頻率高于正常組，GT基因型、T等位基因頻率低于正常組，并符合HardyWeinberg平衡，但兩者之間差異無(wú)顯著性意義。各組之間的基因型分布、等位基因頻率比較差異無(wú)顯著性意義。HphI酶切Ｎ(p/%)

組別Ｎ基因型ＧＧＧＴ等位基因ＧＴ正常組16115275痰瘀組４５３９６８４６非痰瘀組２１１９２４０２

324各組Eselectin的S128R基因型和等位基因的頻率分布表４結(jié)果顯示，冠心病痰瘀組ＳＲ基因型、Ｒ等位基因頻率高于正常組，ＳＳ基因型、Ｓ等位基因頻率低于正常組，并符合HardyWeinberg平衡，但兩者之間差異無(wú)顯著性意義。各組之間的基因型分布、等位基因頻率比較差異無(wú)顯著性意義。表４各組Eselectin的Ｓ１２８Ｒ基因型和等位基因的頻率分布

４討論

冠心病屬中醫(yī)胸痹心痛范疇，主要病機(jī)為痰瘀互結(jié)，心脈痹阻，其病位在心脈，發(fā)病多與肝、脾、腎三臟功能失調(diào)有關(guān)，如腎虛、肝郁、脾失健運(yùn)等，病理變化主要表現(xiàn)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，以痰瘀痹阻為標(biāo)實(shí)的特點(diǎn)。曹洪欣等［４］研究認(rèn)為冠心病的病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以心陽(yáng)虛為主；標(biāo)實(shí)除血瘀、痰濁、氣滯外，痰瘀互結(jié)與冠心病直接相關(guān)。痰瘀互結(jié)證是冠心病的常見(jiàn)證候，痰瘀互結(jié)是冠心病發(fā)病的重要病理因素，痰瘀同治法是治療冠心病的常用法則。本課題組的臨床研究共收集冠心?。梗蠢?，其中痰瘀證占５８５％，是冠心病的主要證型，這與文獻(xiàn)報(bào)道的資料相符合［５］。冠心病是一種多因素、多基因遺傳疾病，且與環(huán)境因素密切相關(guān)；遺傳因素在冠心病人群中可能起著不可忽視的重要作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，炎癥在冠心病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后過(guò)程中起著重要的作用。炎癥反應(yīng)的激活可能是引起斑塊不穩(wěn)定而導(dǎo)致急性冠脈綜合征的主要因素。Eselectin參與多種白細(xì)胞以ＣＤ４記憶性Ｔ細(xì)胞亞群的黏附與聚集，它在免疫、炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化的形成過(guò)程中起著重要作用［６-７］。楊立森等［８］的研究表明，冠心病患者血清Eselectin水平增高，反映了病情的嚴(yán)重程度，可作為可疑胸痛患者的輔助鑒別診斷手段。有研究證實(shí)Eselectin基因第２和第４外顯子分別存在Ｇ／Ｔ和Ｓ／Ｒ多態(tài)性，這兩種多態(tài)性可能影響Eselectin基因表達(dá)和功能，并可能與心血管疾病，尤其是與冠心病發(fā)病有密切關(guān)系［９-１０］。文獻(xiàn)報(bào)道，在人粥樣硬化斑塊處，Eselectin的表達(dá)增加［１１］，冠心病患者血清可溶性Eselectin也有不同程度的升高［１２］。通常認(rèn)為Eselectin水平的變化反映了細(xì)胞表面成分的翻轉(zhuǎn)和蛋白質(zhì)的水解，可作為疾病活動(dòng)的標(biāo)志。林帆等［１３］研究顯示了EselectinＳ１２８Ｒ多態(tài)性與冠心病的發(fā)生有關(guān)，Ｒ等位基因可能是冠心病的危險(xiǎn)因素。李艷等［１４］研究表明EselectinＳ１２８Ｒ基因多態(tài)性與冠心病的發(fā)病有關(guān)聯(lián)，并可影響血清Eselectin水平，Ｒ等位基因可能是冠心病發(fā)病的遺傳易感基因；Eselectin基因Ｇ９８Ｔ多態(tài)性在冠心病發(fā)病中可能不起直接作用。EselectinＳ１２８Ｒ經(jīng)ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為１８６bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶PstI酶切片段的情況，基因型有3種：ＳＳ型，ＳＲ型，ＲＲ型。本研究結(jié)果顯示，EselectinＳ１２８Ｒ的基因型為ＳＲ基因型、ＳＳ基因型，未發(fā)現(xiàn)ＲＲ基因型。其中正常組ＳＳ基因型攜帶者占８７５％，ＳＲ基因型攜帶者占１２５％，Ｓ等位基因頻率為９３７５％，Ｒ等位基因頻率為６２５％；冠心病痰瘀組ＳＳ基因型攜帶者占８２２％，ＳＲ基因型攜帶者占１７８％，Ｓ等位基因頻率為９１１％，Ｒ等位基因頻率為８９％。冠心病痰瘀組EselectinＳ１２８Ｒ的ＳＲ基因型、Ｒ等位基因頻率高于正常組，并符合HardyWeinberg平衡，但兩者之間差異無(wú)顯著性意義。EselectinＧ９８Ｔ經(jīng)ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為３３２bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶HphI酶切片段的情況，基因型為ＧＧ型，ＧＴ型，ＴＴ型。本研究結(jié)果顯示，EselectinＧ９８Ｔ的基因型為ＧＧ基因型、ＧＴ基因型，未發(fā)現(xiàn)ＴＴ基因型。其中正常組ＧＧ基因型攜帶者占６８８％，ＧＴ基因型攜帶者占３１２％，Ｇ等位基因頻率為８４４％，Ｔ等位基因頻率為１５６％；冠心病痰瘀組ＧＧ基因型攜帶者占８６７％，ＧＴ基因型攜帶者占１３３％，Ｇ等位基因頻率為９３３％，Ｔ等位基因頻率為６７％。冠心病痰瘀組EselectinＧ９８Ｔ的ＧＧ基因型、Ｇ等位基因頻率高于正常組，并符合HardyWeinberg平衡，但兩者之間差異無(wú)顯著性意義。目前，關(guān)于冠心病與EselectinＧ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多態(tài)性的研究報(bào)道不少，但尚未能形成統(tǒng)一的意見(jiàn)，這可能與冠心病為多基因遺傳疾病存在一定的關(guān)聯(lián)，不同基因的多態(tài)性在冠心病的發(fā)病過(guò)程可能有著直接或間接的聯(lián)系。然而，關(guān)于冠心病中醫(yī)證型與EselectinＧ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多態(tài)性的研究報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)。本研究初步探討了冠心病痰瘀證與EselectinＧ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多態(tài)性的關(guān)系，推測(cè)冠心病痰瘀證可能與EselectinＧ９８Ｔ的Ｇ等位基因及EselectinＳ１２８Ｒ的Ｒ等位基因有關(guān)。因本研究樣本量少，未得出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但這將為冠心病痰瘀證的研究提供了新的思路。

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