演示文稿第二章目的基因連接及導入

（優(yōu)選）第二章目的基因連接及導入當前第1頁\共有49頁\編于星期四\3點二、目的基因與載體的連接（接）質(zhì)粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。當前第2頁\共有49頁\編于星期四\3點

（主要有以下4種連接方式）

1)

粘性末端連接

2）平頭末端連接

3）人工接頭法

4）同源多聚尾連接法當前第3頁\共有49頁\編于星期四\3點工具酶：基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、逆轉(zhuǎn)錄等相關的各種酶類。幾種重要的工具酶

活性限制性核酸內(nèi)切酶

識別特異堿基序列，切割DNADNA連接酶

催化DNA5ˊ-磷酸與3ˊ-羥基形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶

以DNA為模板合成DNA逆轉(zhuǎn)錄酶

以RNA為模板合成cDNA堿性磷酸酶

切除5－末端磷酸T4多聚核苷酸激酶

催化核酸5'-羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

催化3'-端合成同聚尾當前第4頁\共有49頁\編于星期四\3點DNA連接酶

E.coliDNA連接酶只能催化互補粘性末端之間的連接DNA連接酶（DNAligase）能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3‘-OH末端與5’-P末端之間形成磷酸二酯鍵，使末端連接。

T4DNA連接酶催化互補粘性末端和平末端之間的連接，但平末端之間連接的效率比較低。當前第5頁\共有49頁\編于星期四\3點

將目的基因和載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生相同粘性末端，再通過DNA連接酶作用將兩者連接起來，構(gòu)成重組DNA分子。

用同一種或兩種限制性內(nèi)切酶酶切DNA連接酶重組質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點

（一）粘性末端連接當前第6頁\共有49頁\編于星期四\3點有些限制酶只能將目的基因和載體DNA切割成平端，此時在T4DNA連接酶的作用下同樣能連接起來。

質(zhì)粒產(chǎn)生平末端的內(nèi)切酶DNA連接酶產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶核酸酶S1目的基因重組質(zhì)粒核酸酶S1

本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點?。ǘ┢筋^末端連接當前第7頁\共有49頁\編于星期四\3點（三）人工接頭法

合成連接子→與DNA平頭末端連接→限制酶切割,產(chǎn)生粘性末端→連接，構(gòu)建重組DNA。當前第8頁\共有49頁\編于星期四\3點用接頭連接

用同一種限制性內(nèi)切酶酶切DNA連接酶重組質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因++DNA連接酶接頭(linker)

本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點！當前第9頁\共有49頁\編于星期四\3點（四）同源多聚尾連接法當前第10頁\共有49頁\編于星期四\3點尾接法

DNA連接酶重組質(zhì)粒質(zhì)粒目的基因內(nèi)切酶末端轉(zhuǎn)移酶

+dGTP末端轉(zhuǎn)移酶

+dCTP

本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點當前第11頁\共有49頁\編于星期四\3點基因與載體的平末端連接方法有哪些？(1)T4DNA連接酶法

連接平末端DNA分子的方法有2種，一種是直接用T4DNA連接酶連接，另一種是先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA連接酶進行連接。T4DNA連接酶同一般的大腸桿菌DNA連接酶不同。T4DNA連接酶除了能夠封閉具有3’-OH和5’-P末端的雙鏈DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高濃度酶的條件下,它還能夠連接具有完全配對堿基的平末端DNA分子,但其連接效率比粘性端要低的多。當前第12頁\共有49頁\編于星期四\3點（2）同聚物加尾法

5’特意的核酸外切酶處理目的基因及質(zhì)粒的平末端，移去幾個末端核苷酸。運用末端核苷酰轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账幔ㄍㄟ^脫氧核苷三磷酸前體）加到DNA分子單鏈延伸末端的3’-OH基因上,它并不需要模板鏈的存在,它一個一個加上核苷酸,構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴,長度可達100個核苷酸。在載體中加入dTTP和末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，在載體3’－OH末端延伸形成單鏈PolyT尾巴。將兩者混合發(fā)生互補連接，缺口用DNA連接酶封閉。當前第13頁\共有49頁\編于星期四\3點3）用化學合成的銜接物連接DNA分子用化學合成法合成一段10－12個核苷酸，具有限制酶識別位點的寡核苷酸片段，磷酸化后，通過T4DNA連接酶，將片段分別于載體5’端和目的基因片段5’連接起來。用相應的限制性內(nèi)切酶處理，產(chǎn)生互補的粘性末端。

4）T-A克隆法：

TagDNA聚合酶在擴增目的基因DNA的同時，還能不依賴模版在產(chǎn)物3’末端加上兩個游離的A。只要載體切口除人工加上的游離T，PCR產(chǎn)物即可于載體連接。當前第14頁\共有49頁\編于星期四\3點T-A克隆T-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的TPCR過程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個A當前第15頁\共有49頁\編于星期四\3點1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_____

____________。3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同當前第16頁\共有49頁\編于星期四\3點質(zhì)粒單酶切點的基因連接如何降低本底和防止自我環(huán)化和提高連接效率？

目的基因片斷與載體由相同的單一限制性核酸內(nèi)切酶（如EcoRI）消化酶切后,兩者的兩端均具有相同的粘性末端,稱為單酶切點的粘性末端,又稱全同源性粘性末端⑴高背景

載體經(jīng)單一限制性核酸內(nèi)切酶切割后,載體分子易于自我環(huán)化,既不利于目的基因的重組連接,大大降低陽性克隆效率,又可使非重組性載體造成高背景。為了防止載體的自我環(huán)化，通常用堿性磷酸酶去除載體粘性末端的

5’-P以抑制DNA的自我環(huán)化。在連接反應中,具有5’-P的目的基因DNA片斷可有效地與去磷酸化質(zhì)粒DNA載體通過粘性末端發(fā)生互補連接,盡管產(chǎn)生的重組DNA分子于連接點含有兩個缺口的開環(huán)分子,盡管在轉(zhuǎn)化時其轉(zhuǎn)化效率高于線性低于閉和環(huán),但轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,在菌體內(nèi)其缺口可獲得修復。當前第17頁\共有49頁\編于星期四\3點⑵雙向插入

經(jīng)單一限制核酸內(nèi)切酶（如EcoRI）切割的目的基因和載體,因二者的粘性末端是相同的,因此在連接反應中,目的基因可發(fā)生雙向插入,載體對目的基因表達是有方向的,而目的基因可雙向與之相連,這種連接若以克隆目的基因片段為目的沒有影響,若以表達為目的,我們就要對插入的片段進行方向鑒定,因目的基因由起始密碼子向終止密碼子方向表達是定向轉(zhuǎn)錄的,一旦啟動子與目的基因編碼順序方向相反就不能正確轉(zhuǎn)錄目的基因的mRNA。若構(gòu)建表達DNA重組體選用雙酶切切割目的基因和載體，可使目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組,以便定向克隆。(YL)當前第18頁\共有49頁\編于星期四\3點第六節(jié)重組DNA導入受體細胞基因工程之當前第19頁\共有49頁\編于星期四\3點

在目的基因與載體連接成重組DNA分子以后，下面的重要工作主要是將其導入受體細胞進行擴增和篩選，獲得大量的重組DNA分子，這就是外源基因的無性繁殖，即克隆(cloning)。

由于外源基因與載體構(gòu)成的重組DNA分子性質(zhì)不同、宿主細胞不同，將重組DNA導入宿主細胞的具體方法也不相同。轉(zhuǎn)—重組DNA導入宿主細胞當前第20頁\共有49頁\編于星期四\3點

受體細胞：也叫宿主細胞，是指在轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、雜交中接受外源基因的細胞。分為原核受體細胞(最主要是大腸桿菌)、真核受體細胞

(最主要是酵母菌)、動物細胞和昆蟲細胞(其實也是真核受體細胞)。

具有接受外源DNA的能力；為限制性內(nèi)切酶缺陷型菌珠或為DNA重組型菌珠；在標記上和載體對應；有利于表達；不適宜在人體或非培養(yǎng)條件下生存，有利于安全。受體細胞條件當前第21頁\共有49頁\編于星期四\3點原核生物細胞是較為理想的受體細胞：①沒有細胞壁，便于外源DNA的進入；②沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，便于外源DNA與染色體DNA重組；③基因組小，遺傳背景簡單，便于外源基因的遺傳分析；④容易獲得一致性的實驗材料，培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，易重復。當前第22頁\共有49頁\編于星期四\3點表達真核生物基因存在一定的缺陷，很多真核生物基因往往不能在原核生物細胞內(nèi)表達出具有生物活性的功能蛋白。需要進行適當?shù)男揎棶斍暗?3頁\共有49頁\編于星期四\3點酵母作為受體細胞，除了真核生物細胞共有的特性外，還具有以下優(yōu)點：①基因結(jié)構(gòu)相對簡單，其基因表達調(diào)控機制研究比較清楚，便于基因工程操作；②培養(yǎng)簡單，適于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低廉；③可以分泌表達，便于產(chǎn)物的提取和加工；④不產(chǎn)生毒素，是安全的受體細胞。真核生物細胞-酵母受體細胞當前第24頁\共有49頁\編于星期四\3點植物細胞作為受體細胞，除了真核細胞共有的特性外，最突出的優(yōu)點就是其體細胞的全能性，一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。不足之處是植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，不利于攝取重組DNA分子。當前第25頁\共有49頁\編于星期四\3點動物細胞同樣可以作為受體細胞。早期多采用生殖細胞、受精卵細胞或胚細胞作為受體細胞，近年來干細胞成為新的研究熱點。當前第26頁\共有49頁\編于星期四\3點原核生物細胞，大腸桿菌優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，便于操作分析缺點：表達蛋白可能沒有活性真核生物細胞，酵母優(yōu)點：表達蛋白加工具有活性缺點：操作相對麻煩當前第27頁\共有49頁\編于星期四\3點

大腸桿菌是目前基因工程中最常用的受體細胞。通常采用的是大腸桿菌的感受態(tài)細胞，即在冰浴中用一定濃度的CaCl2處理對數(shù)生長期的大腸桿菌，以獲得高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亞礬、二硫蘇糖醇(DTT)或用氯化己胺鈷處理制備感受態(tài)細胞。

感受態(tài)是指受體細胞能吸收外源DNA分子而有效地作為轉(zhuǎn)化受體的某些生理狀態(tài)。一般受體細胞在對數(shù)生長期轉(zhuǎn)化能力最強。當前第28頁\共有49頁\編于星期四\3點1、直接導入法：（1）顯微注射法：利用微量注射器在顯微鏡下直接把目的基因注入宿主細胞。（2）電擊法：借助電擊儀高壓脈沖把目的基因打入宿主細胞。（3）直接吸收法：把目的基因和宿主細胞混在一起，讓其吸收。（4）基因槍法：在金屬微粒上涂一層目的基因，然后發(fā)射到宿主細胞中?；?qū)敕椒ó斍暗?9頁\共有49頁\編于星期四\3點又稱之為直接顯微注射。一般是用微吸管吸取供體DNA溶液，在顯微鏡下準確地插入受體細胞核中，并將DNA注射進去。此法常用于轉(zhuǎn)基因動物的基因轉(zhuǎn)移。（1）微注射技術：是將外源基因直接注射到真核細胞內(nèi)的方法；將外源基因通過毛細玻璃管，再顯微鏡下注釋到受精卵的細胞核內(nèi)的方法。當前第30頁\共有49頁\編于星期四\3點（2）電轉(zhuǎn)化法也有人稱做高壓電穿孔法（簡稱電穿孔法），即在受體細胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，使質(zhì)膜形成納米大小的微孔，DNA能直接通過這些微孔，或者作為微孔閉合時所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布而進入細胞質(zhì)中。該法可用于真核細胞(如動物細胞和植物細胞)和原核細胞(轉(zhuǎn)化大腸桿菌和其他細菌等)的外源DNA的直接導入。

電穿孔法具有簡便、快速、效率高等優(yōu)點

電擊的處理方式對轉(zhuǎn)化率有著決定性的作用，有兩種不同的處理方式：一種是較低的電壓，處理較長的時間（350V/cm54s）；另一種是高電壓，短時間處理（1－1.25kV/cm,10s)。一般常用第二種處理方式。當前第31頁\共有49頁\編于星期四\3點1.磷酸鈣沉淀法

利用磷酸鈣-DNA共沉淀，把外源基因與λ噬菌體DNA的重組分子導入大腸桿菌和哺乳動物細胞，簡稱磷酸鈣沉淀法。細胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNA的能力，幾乎所有的雙鏈DNA都可以通過這種方法導入細胞，而且可在電子顯微鏡下清楚地看到細胞吞噬DNA-磷酸鈣復合顆粒。此法的轉(zhuǎn)染效率遠遠不如體外包裝法。（3）直接吸收法：當前第32頁\共有49頁\編于星期四\3點Ca2+誘導DNA對大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化的可能原因：①在0℃的Cacl2低滲溶液中，細菌細胞發(fā)生膨脹，同時Cacl2使細胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導大腸桿菌形成感受態(tài)。②Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復合物，并黏附在細菌細胞膜的外表面上。當42℃熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供了進入細胞的通道。當前第33頁\共有49頁\編于星期四\3點當前第34頁\共有49頁\編于星期四\3點該法重復性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細胞。對這種感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，每μg質(zhì)粒DNA可以獲得5×106～2×l07個轉(zhuǎn)化茵落，完全可以滿足質(zhì)粒的常規(guī)克隆的需要Mg2+對DNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用Mgcl2與Cacl2共同處理大腸桿菌細胞，可以提高DNA的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)和二硫蘇糖醇(DDT)等進一步處理細胞，能誘導高頻感受態(tài)細胞的形成，轉(zhuǎn)化效率可提高100～1000倍，且對大小質(zhì)粒分子均可進行有效的轉(zhuǎn)化。但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，通常很少采用。當前第35頁\共有49頁\編于星期四\3點（4）基因槍技術又稱高速微型子彈射擊法、微彈射擊法、高速粒子轟擊法基本原理：將DNA吸附在微型子彈(1μm)的表面通過放電或機械加速，使子彈射入完整的細胞或組織內(nèi)?；咀龇ǎ合葘⑼庠碊NA溶液與鎢、金等金屬微粒(直徑0.5-5μm)共同保溫，使DNA吸附于金屬顆粒表面，然后放電加速金屬顆粒，使之以400m/s的速度直接噴射受體細胞，外源遺傳物質(zhì)隨金屬顆粒進入細胞內(nèi)部。當前第36頁\共有49頁\編于星期四\3點基因槍轉(zhuǎn)化的操作步驟靶細胞或組織的預處理微粒子彈的制備裝備基因槍轟擊過渡培養(yǎng)進行篩選培養(yǎng)或直接分化再生植株PDS-1000|HeSystem當前第37頁\共有49頁\編于星期四\3點無宿主限制：農(nóng)桿菌介導法只對雙子葉植物敏感，限制了它的應用范圍。而基因槍沒有物種限制。靶受體類型廣泛：可以是原生質(zhì)體，葉片，懸浮細胞，莖或根切段，種子胚，愈傷組織，花粉等。操作簡單快速基因槍法轉(zhuǎn)化的優(yōu)點有：便攜式基因槍當前第38頁\共有49頁\編于星期四\3點1.體外包裝轉(zhuǎn)染法

又稱感染，將目的基因放在載體上，感染到要表達的細胞中,

并在宿主菌體內(nèi)擴增和表達外源基因。常用的載體是質(zhì)粒、λ噬菌體、科斯質(zhì)粒。

2、間接導入法當前第39頁\共有49頁\編于星期四\3點2.脂質(zhì)體介導法

脂質(zhì)體(又叫做人工膜泡)作為體內(nèi)或體外輸送載體的方法，一般都需要將DNA或RNA包囊于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細胞膜的融合，通過融合導入細胞。

這種方法具有許多方面的優(yōu)點,包括可保護DNA在導入細胞之前免受核酸酶的降解作用,降低了對細胞的毒性效應,適用的植物種類廣泛,重復性高,包裝在脂質(zhì)體內(nèi)的DNA可穩(wěn)定地貯藏等。當前第40頁\共有49頁\編于星期四\3點

人們很早就發(fā)現(xiàn)雙子葉植物常發(fā)生一種冠癭瘤病，該病在法國、東歐和意大利的葡萄和果樹上曾大面積發(fā)生。

1907年Smith和Townsent