半定量RT-PCR的實驗原理和方法步驟

半定量RT-PCR的實驗原理和方法步驟以下實驗步驟僅供參考：1樣品RNA的抽提①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。②兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。⑥溶解RNA沉淀溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40H用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。2RNA質(zhì)量檢測1）紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純度。①濃度測定A260下讀值為1表示40RgRNA/ml。樣品RNA濃度（四/ml）計算公式為：A260x稀釋倍數(shù)x40Rg/ml。具體計算如下：RNA溶于40RlDEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495r1的TE中，測得A260=RNA濃度=x100x40Rg/ml=840Rg/ml或Rg/Rl取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35Rl，剩余RNA總量為：35RlxRg/Rl=Rg②純度檢測RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍到。2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定①制膠1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10ml的10xMOPS電泳緩沖液和18ml的37%甲醛溶液M）。10xMOPS電泳緩沖液濃度成分MOPS，pH乙酸鈉EDTA灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25Rl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的IxMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。②準(zhǔn)備RNA樣品取3pgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10^g/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。③電泳上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm。④紫外透射光下觀察并拍照28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。3樣品cDNA合成①反應(yīng)體系序號反應(yīng)物劑量1逆轉(zhuǎn)錄buffer2H2上游引物H3下游引物H4dNTPH5逆轉(zhuǎn)錄酶MMLVW6DEPC水5山7RNA模版2H8總體積10H輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶H，37℃水浴60分鐘。③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。4梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的管家基因（出actin）實時定量PCR①B-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備陽性模板的濃度為1011,反應(yīng)前取3H按10倍稀釋（加水273并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。②反應(yīng)體系如下：標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系序號反應(yīng)物劑量1SYBRGreen1染料10H2陽性模板上游引物FH3陽性模板下游引物RW4dNTPH5Taq酶卬16陽性模板DNA5H7ddH20H8總體積50H輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。管家基因反應(yīng)體系：序號反應(yīng)物劑量1SYBRGreen1染料10H2內(nèi)參照上游引物FH3內(nèi)參照下游引物RH4dNTPH5Taq酶卬16待測樣品cDNA5H7ddH20H8總體積50H輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃2分鐘，然后93℃1分鐘，55℃2分鐘，共40個循環(huán)。5制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：序號反應(yīng)物劑量110xPCR緩沖液ul2MgCl2溶液ul3上游引物Ful4下游引物Rul5dNTP混合液3ul6Taq聚合酶1ul7cDNA1ul8加水至總體積為25ul輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）；72oC延伸5分鐘。②PCR產(chǎn)物與DNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。③將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋：將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋：設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1x1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。6待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR①所有cDNA樣品分別配置實時定量PCR反應(yīng)體系。體系配置如下：序號反應(yīng)物劑量1SYBRGreen1染料10ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP1ul5Taq聚合酶2ul6待測樣品cDNA5ul7ddH2O30ul8總體積50ul輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于RealtimePCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。7實時定量PCR使用引物列表引物設(shè)計軟件：PrimerPremier，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配)。8電泳各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與DNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量。另外，這項技術(shù)還可以用來檢測基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以