特異性沉默Eca109細胞系stathmin基因siRNA表達載體的構(gòu)建

特異性沉默Eca109細胞系stathmin基因siRNA表達載體的構(gòu)建【摘要】目的構(gòu)建并篩選特異性沉默stathmin基因的pSUPERS逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及穩(wěn)定表達的細胞克隆。方法用DNA重組技術(shù)，將64nt能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向stathmin小發(fā)夾RNA的寡核苷酸序列，定向克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPEREGFP，應用脂質(zhì)體將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPERS轉(zhuǎn)染細胞系Eca109，G418篩選建立穩(wěn)定產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞克隆，RTPCR檢測轉(zhuǎn)染細胞stathminmRNA的表達。結(jié)果重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，可見4692nt和285nt條帶；測序結(jié)果表明插入序列正確；重組載體轉(zhuǎn)染Eca109細胞，可表達綠色熒光蛋白，經(jīng)G418篩選得到抗性細胞克隆，轉(zhuǎn)染細胞stathminmRNA的表達較對照組明顯減弱。結(jié)論特異性沉默stathmin基因的pSUPERS逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及穩(wěn)定表達的細胞系構(gòu)建和篩選成功。

【關鍵詞】小干擾RNA；stathmin基因；pSUPEREGFP載體；Eca109細胞

Abstract：ObjectiveToconstructandidentifyarecombinantretroviralvectorpSUPERSthattargetstathmingeneandastablevirusproducingcell64ntencodedtargetingstathmingeneshRNAsequencewasclonedintoaretroviralvectorpSUPEREGFPwithDNArecombinanttechnique.TherecombinantvectorwasidentifiedbytheelectrophoresisanalysisofrestrictionenzymedigestionandDNAsequencing.ThepackagingcellEca109wastransfectedwiththisrecombinantplasmidusingliposomebasedtransfectionandthestableintergrantwasselectedbyusingG418expressionofstathminmRNAwasdetectedbyRTPCRintransfectedEca109cellelectrophoresisofEcoRⅠandHindⅢdigestedproductsshowedtwoDNAfragments,4692ntand285nt,respectively.Theresultofsequencedemonstratedthat64nthadbeeninsertedintothevector.Greenfluorescentproteinwasobservedaftertransfection.G418resistantcloneswerealsoselected.ComparingwithcontrolgroupstheexpressionofstathmingenewasinhibitedobviouslyintreatedgroupswithpSUPERrecombinantretroviralvectorpSUPERSthatspecificsilencestathmingeneandastablevirusproducingpackagingcelllineweresuccessfullyconstructedandidentified.

Keywords：SmallinterferingRNA;stathmingene;pSUPEREGFPvector;Eca109cells

0引言

食管癌是常見的惡性腫瘤之一。某些基因的異常表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關。Stathmin為一種高度保守的細胞內(nèi)蛋白，在多種惡性腫瘤細胞中高表達，研究表明[1,2]通過應用反義核酸、單克隆抗體、核酶、stathmin蛋白抑制劑及絲氨酸位點突變體等方法封閉該基因表達，可使細胞受阻于G2／M期，同時使惡性腫瘤表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)。stathmin成為惡性腫瘤生物治療的新靶點。RNA干擾是最新的基因敲除技術(shù)，具有高效性和特異性，能夠降解相應的細胞內(nèi)mRNA，使基因轉(zhuǎn)錄后沉默。本研究應用含H1啟動子的逆轉(zhuǎn)錄載體pSUPEREGFP構(gòu)建了stathmin基因的siRNA表達載體pSUPERS，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Eca109細胞，以特異性沉默目的基因的表達，觀察小干擾RNA對靶基因表達的抑制作用，探討腫瘤基因治療的新模式。

1材料與方法

材料

細胞系和質(zhì)粒人食管癌細胞Eca109、大腸桿菌JM109為鄭州大學腫瘤中心保存;pSUPEREGFP質(zhì)粒由鄭州大學基礎醫(yī)學院丁一教授惠贈，靶向stathmin的64ntoligos由上海生物工程公司合成。

試劑限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶和Trizol試劑購自Promega公司;DNAMarker、DNAPurificationkit和RTPCR檢測試劑盒購自大連寶信生物工程公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectine2000和G418購自美國Invitrogene公司。

方法

靶向stathmin基因寡核苷酸的設計應用美國OligoEngine公司提供的雙鏈RNA設計軟件，選擇合適的19nt靶序列，通過Blast搜索確認與人的其他基因序列無同源性。該19nt的序列分別為：5′GAAAGACGCAAGTCCCATG3′，5′ACGAGAGCACGAGAAAGAA3′，由上海生物工程公司合成兩條64nt的互補單鏈，序列見表1。

表1兩條64nt的互補單鏈序列

載體的選擇選用pSUPEREGFP質(zhì)粒為載體，經(jīng)BglⅡ和HindⅢ兩酶切后與合成的64nt的寡核苷酸雙鏈連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSUPERS。該質(zhì)粒含有H1啟動子，可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shRNA;質(zhì)粒的報告基因綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因用于陽性克隆的篩選。

寡核苷酸與pSUPEREGFP載體的連接將合成的64nt正義和反義鏈分別溶于三蒸水中，終濃度為3μg/μl;各取1μl，加入48μl退火緩沖液，依次94℃4min，80℃4min，70℃10min，37℃20min，最終緩慢冷卻至室溫進行退火反應。用BglⅡ和HindⅢ雙酶切pSUPEREGFP載體8h。酶切產(chǎn)物于8g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，用DNAPurificationkit回收4913nt的大片段，得到線性化載體。用T4DNA連接酶分別進行連接反應，重組載體分別命名為pSUPERS1、pSUPERS2。

連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化應用1×TSS兩步法，將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至新鮮制備的JM109感受態(tài)細菌中，LB平板上培養(yǎng)10~14h，選取10~20個中等大小菌落，在含LB液體培養(yǎng)基中37℃振搖10h，堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA。

重組載體的酶切鑒定用EcoRⅠ和HindⅢ酶切重組質(zhì)粒及對照空質(zhì)粒，各取10μl酶切產(chǎn)物于15g/L瓊脂糖凝膠電泳。對照空質(zhì)粒雙酶切后應觀察到227nt條帶，插入64nt寡核苷酸鏈，陽性克隆酶切后應觀察到285nt條帶。

測序鑒定為進一步驗證序列的準確性，采用推薦的載體測序引物送北京三博生物公司測序，測序結(jié)果應包括64nt的插入序列，引物序列為:5′GCGTGAATTCGAACGCTGAC3′。

重組載體轉(zhuǎn)染細胞系Eca109Eca109細胞采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫孵箱中貼壁培養(yǎng)。當細胞鋪滿培養(yǎng)板底70%時，利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒pSUPERS導入Eca109細胞，48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。使用g/L的胰蛋白酶消化細胞，以1∶5傳代培養(yǎng)，24h后換含G418的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，2~3d后改用G418培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，直至陽性克隆形成。成功轉(zhuǎn)染的細胞應呈綠色熒光。

轉(zhuǎn)染細胞stathminmRNA表達的檢測收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的不同處理組Eca109細胞3×106個，以Trizol試劑提取細胞總RNA。采用AMV一步法RTPCR試劑盒檢測stathminmRNA的表達。stathmin上游引物：5′ATGGCTTCTTCTGATATCCA3′，stathmin下游引物:5′GTTCACTTCTATTGCCTTCT3′；以βactin為內(nèi)參照，上游引物：5′CCGAGCGCGGCTACAGCTTCA3′，下游引物：5′GAAGCATTTGCGGTGGACGAT3′。產(chǎn)物經(jīng)15g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果并攝像。

2結(jié)果

EGFP載體的酶切pSUPEREGFP空載體經(jīng)BglⅡ單酶切后載體線性化，大小為4919nt；EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，觀察到4692nt和227nt的線性片段；BglⅡ和HindⅢ雙酶切，觀察到4913nt線性片段，切出的另一6nt片段未能顯示。結(jié)果與理論值一致，見圖1。

M:DL15000分子量標準;A:pSUPEREGFP載體BglⅡ單酶切;B:pSUPEREGFP載體EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切;C:pSUPEREGFP載體BglⅡ、HindⅢ雙酶切

圖1pSUPEREGFP載體酶切鑒定

S重組載體的酶切鑒定隨機挑取LB平板上的菌落搖菌后提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和HindⅢ酶切鑒定。重組質(zhì)粒pSUPERS用HindⅢ單酶切后線性化，觀察到4977nt大小的片段；重組質(zhì)粒pSUPERS雙酶切后觀察到4692nt和285nt的線性片段。結(jié)果與理論值一致，見圖2。

M:DL15000分子量標準;A:pSUPERS載體HindⅢ單酶切;B,C:pSUPERS1,pSUPERS2載體EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切

圖2pSUPERS重組載體酶切鑒定

靶序列測序鑒定重組質(zhì)粒pSUPERS1、pSUPERS2的測序結(jié)果與設計合成的靶向stathmin的64nt寡核苷酸序列完全一致，表明靶向stathmin基因的pSUPERS1、pSUPERS2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建成功。

S重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的篩選重組質(zhì)粒pSUPERS經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Eca109細胞，48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到有綠色熒光出現(xiàn)。經(jīng)G418篩選，獲得陽性細胞克隆，見圖3。

轉(zhuǎn)染細胞stathminmRNA表達的檢測經(jīng)RTPCR擴增后，凝膠成像可見內(nèi)參βactin擴增片段為545nt，各組電泳條帶無明顯變化。stathmin擴增片段為270nt，pSUPERS穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞stathminmRNA的相對表達量較pSUPEREGFP空載體對照組、空白對照組明顯減弱，見圖4。

M:DL2000分子量標準;A:空白對照組;B:pSUPEREGFP空載體對照組;C,D:pSUPERS1、pSUPERS2載體轉(zhuǎn)染組

圖4轉(zhuǎn)染細胞stathminmRNA表達的檢測

3討論

基因沉默是目前腫瘤基因治療的一個重要方法，它是在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷基因的異常表達，使腫瘤細胞進入正常分化軌道或引起細胞凋亡。RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，采用合成的1923ntsiRNA直接轉(zhuǎn)染或shRNA經(jīng)載體介導轉(zhuǎn)染靶細胞可誘導RNAi，對靶基因mRNA產(chǎn)生特異性降解作用[4,5]。制備siRNA的方法主要有化學合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、制備siRNA混合物、siRNA表達盒子和siRNA表達載體法。前三種方法的作用時間都比較短。siRNA表達盒子是PCR引發(fā)siRNA表達模板，SECs依次包含RNA聚合酶啟動子、編碼shRNA的模板和RNA聚合酶終止點。將帶有RNA聚合酶啟動子和終止子的PCR引物與合成的DNA模板進行PCR擴增，即可得到大量SECs。siRNA表達載體法是由polⅢ啟動體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，另有4~5個T組成的轉(zhuǎn)錄終止位點。polⅢ總是在距啟動子固定的位置開始轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄終止點的第2個U處終止，非常精確。由于質(zhì)粒可以在細胞內(nèi)復制擴增，這種抑制基因表達的效果可持續(xù)幾周甚至更長，適用于較長周期的研究。食管癌是常見的惡性腫瘤、預后較差，目前對于食管癌的基礎研究及臨床治療仍是醫(yī)學研究熱點之一。stathmin基因是從淋巴瘤中篩選出的特征性表達基因，為一種高度保守的胞內(nèi)蛋白，在細胞周期過程中可被蛋白激酶磷酸化，阻斷stathmin磷酸化將使細胞分裂停止于G2/M期。細胞內(nèi)微管相關蛋白磷酸化過程中stathmin是重要調(diào)節(jié)因子[10]，直接影響細胞分裂及增殖。stathmin在多種惡性腫瘤細胞中高表達，封閉該基因表達，可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型。本研究采用基因工程技術(shù)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染體系構(gòu)建了針對stathmin基因的shRNA轉(zhuǎn)錄載體pSUPERS。攜帶靶序列的pSUPERS載體是帶有新霉素抗性基因和綠色熒光蛋白編碼基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該載體帶有依賴RNA聚合酶Ⅲ的H1啟動子，可轉(zhuǎn)錄生成針對靶基因的shRNA，在體內(nèi)加工生成雙鏈的小干擾RNA，進而降解相應的靶mRNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒能感染分裂期細胞，使目的基因穩(wěn)定地整合到靶細胞基因組而長期表達，且不產(chǎn)生輔助病毒，具有很好的安全性。通過脂質(zhì)體將pSUPERS逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染Eca109細胞，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染成功。經(jīng)G418篩選，獲得了可長期產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的Eca109細胞克隆，持續(xù)表達針對stathmin基因的shRNA，使靶基因的mRNA降解。為更深入地探討stathmin基因沉默對食管癌Eca109細胞凋亡和增殖分化的影響，進而應用于食管癌的生物治療奠定了實驗基礎。

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