第四章酶的分離純化

第三章

酶的分離純化與保存酶的分離純化是酶學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)之一。針對(duì)化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的酶而言，其分離純化的方法主要沿用蛋白質(zhì)分離提純的方法。酶的分離純化又有其自身特點(diǎn)：難點(diǎn)：目標(biāo)酶在細(xì)胞中含量少優(yōu)勢(shì)：可通過測(cè)定酶活性的方法進(jìn)行示蹤酶的分離純化是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)酶的分離純化，就是將酶從細(xì)胞或者其他含酶的原料中釋放出來，再與雜質(zhì)分開，而獲得符合研究和使用要求的酶制品的過程細(xì)胞結(jié)構(gòu)與酶分布胞內(nèi)酶：在細(xì)胞中，酶在核糖體上合成后，即轉(zhuǎn)運(yùn)到各個(gè)作用部位，并不斷補(bǔ)充和更新胞外酶：合成后穿過質(zhì)膜，定域到質(zhì)膜外表面、周質(zhì)空間、外膜及細(xì)胞外環(huán)境中的酶不同的酶分離純化的方法不同：胞內(nèi)產(chǎn)物需經(jīng)細(xì)胞破碎，細(xì)胞碎片分離等步驟；胞外產(chǎn)物則將細(xì)胞去除后，對(duì)余下的液體即可進(jìn)行初步純化選用技術(shù)前，需考慮：1.目標(biāo)酶分子特性及其他物理、化學(xué)性質(zhì)2.酶分子和雜質(zhì)的主要性質(zhì)差異3.酶的使用目的和要求4.技術(shù)實(shí)施的難易程度5.分離成本的高低6.是否造成環(huán)境污染不同酶的分離、提純方法，主要根據(jù)：

酶分子之間各種選擇性的差異

分子大小和形狀

酸堿性質(zhì)

溶解度

吸收性質(zhì)

對(duì)其他分子的生物學(xué)親和力等等

酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。酶的分離純化可以分為三個(gè)階段1、粗蛋白：多使用鹽析沉淀法，可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)；2、部分純化：使用各種層析法；3、均質(zhì)酶：目標(biāo)酶的進(jìn)一步精制純化，常用電泳或者色譜法。主要過程：細(xì)胞破碎酶的提取離心分離過濾沉淀層析電泳萃取濃縮干燥結(jié)晶保存。。。一、酶分子制備的前處理1、生物材料的選擇選擇目的酶含量高的選擇容易取材的利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和基因工程重組DNA技術(shù)。目前，酶的來源大都為來自微生物

材料選定后要盡可能保持新鮮，盡快加工處理，如暫不提取，應(yīng)冰凍保存，且動(dòng)物材料則需深度冷凍保存：動(dòng)物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛?。如果所要求的成分在?xì)胞內(nèi)，則要先破碎細(xì)胞。植物要先去殼、除脂。微生物材料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開。2、細(xì)胞的破碎將細(xì)胞和組織破碎，使酶分子（胞內(nèi)酶）充分釋放到溶液中，并不丟失生物活性。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同如動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專門的細(xì)胞破碎方法。

機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎（酶解破碎）自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理機(jī)械鄰法（臨注意休預(yù)冷境）：搗碎為法：10覆00輕0r廊pm研磨賓法：勻漿錘法：禾研桿卷和管澤壁間選只有圓幾百啦微米DY佛89爛-I型絨電動(dòng)危玻璃柏勻漿久機(jī)物理斧法：反復(fù)罰凍融鴿法：桑時(shí)間我長(zhǎng)，沖需加撿蛋白浩酶抑述制劑嘩（PM緊SF、ED船TA等）超聲然波處屠理法昆：處談理時(shí)糊間盡植量短葉，避份免局四部過詞熱使艙得酶旋失活滲透錘壓法票：冷熱擦交替它法：JY捐92肉-I這I祝D超聲鬧波細(xì)胞柿粉碎敬機(jī)高壓先細(xì)胞僵破碎篇機(jī)化學(xué)爹與生盤物化鎖學(xué)方自法自溶蠅法：?jiǎn)枥觅惣?xì)胞縣自身匆酶系螞，保殘持一捧定pH和溫蚊度條那件，勒使細(xì)塌胞破恩壞有機(jī)撥溶劑私處理董法：毀通過廟有機(jī)甜溶劑決對(duì)細(xì)尖胞膜壯的作州用，隆使得年細(xì)胞跨破碎拋（Tw闖ee桶n,恢Tr番it忍on，氯勞仿等物）酶解凱法：碰根據(jù)遇細(xì)胞劣外層完結(jié)構(gòu)達(dá)特點(diǎn)械，加帝適當(dāng)綢的酶斗破壞膝細(xì)胞梢壁，膏并在千低滲延溶液助中使桐細(xì)胞留破碎如：遇霉菌基：幾旁丁質(zhì)邊酶,酵母艘細(xì)胞播：β－葡假聚糖量酶

動(dòng)物細(xì)菌植物

∣研磨∣超聲波∣纖維素酶

∣勻漿∣溶菌酶∣

↓搗碎機(jī)↓化學(xué)溶劑(甲苯)↓

提取液

3.生物己大分己子的船提取梢（抽惱提）“提取”是在宇分離章純化經(jīng)之前犬將經(jīng)估過預(yù)仰處理柔或破攪碎的俱細(xì)胞督置于梢溶劑逢中，針使被閣分離修的生由物大條分子汪充分仙地釋麻放到場(chǎng)溶劑喚中，木并盡就可能比保持樣原來誼的天公然狀達(dá)態(tài)不還丟失翻生物棉活性殺的過筐程。酶的塞定位頌不同于，其簡(jiǎn)提純予難度勞也不綿相同“固素相轉(zhuǎn)伯入液污相”承，或尖“從初細(xì)胞付內(nèi)的甩生理圖狀況挑轉(zhuǎn)入裁外界鎖特定邀的溶爆液中椒”?！嗨粕硐嗳苊柑嵝烊r(shí)偷首先移應(yīng)根袍據(jù)酶的瞎結(jié)構(gòu)偵和溶吐解性效質(zhì)，絡(luò)選擇伏適當(dāng)嬌的溶貴劑。一般模說來承，極鴨性物膚質(zhì)易耐溶于其極性被溶劑紗中（水疫、稀兄酸、寫稀堿于、稀擋鹽溶碌液等所），非斃極性圾物質(zhì)繩易溶成于非喝極性糖的有生機(jī)溶貓劑中外，酸連性物摘質(zhì)易秒溶于亂堿性倆溶劑春中，凈堿性事物質(zhì)復(fù)易溶貧于酸無性溶樹劑中提高威溫度啄，降堪低溶盆液粘紗度、吼增加些擴(kuò)散困面積樸、縮盜短擴(kuò)姑散距障離，圈增大藏濃度穩(wěn)差等靜都有暑利于效提高拆酶分資子的飼擴(kuò)散講速度購(gòu)，從被而增頂大提萬取效陷果。為了腿提高諷酶的遲提取苗率并停防止設(shè)酶的料變性用失活遍，在他提取欄過程兩中還萍要注義意控田制好旋溫度儀、pH值等寄提取侍條件驅(qū)。⑴鹽溶粥液提各?。阂话阃ひ缘望}剝?nèi)芤?0助.0恨5-幼0.肯2m航ol墳/L船)為主狡。稀軍鹽溶芽液和頸緩沖勿液對(duì)爐蛋白中質(zhì)的夫穩(wěn)定河性好嘗，溶工解度甚大，起是提婆取蛋賄白質(zhì)碰和酶濤最常臨用的斥溶劑柔。鹽溶乳：在亂低鹽筐濃度獲條件樣下，熱酶的挑溶解晴度隨羞鹽濃搏度增偏大而請(qǐng)?jiān)龃篼}析粘：當(dāng)假鹽濃獄度達(dá)辛到一榜定界侮限后按，酶區(qū)的溶刻解度使隨著蜘鹽濃頃度增閑大而篇降低大多匆數(shù)蛋樣白類概酶都主溶于吩水，義而且品在低撐濃度火的鹽槐存在才的條際件下左，酶眨的溶管解度落隨鹽陸濃度要的升卸高而許增加權(quán)，這碎稱為咳鹽溶路現(xiàn)象藥。(2暮)稀酸壩（堿閥）溶初液提城取在偏者離等沒電點(diǎn)0.秒5左右黃，溶趴解度市增大根據(jù)形等電腿點(diǎn)，鹿選擇廉合適曉的pH注意陵，不都能采忌用極叛端pH值，芒操作旗時(shí)要坑注意墻避免仇局部血過酸星或過區(qū)堿(3書)變性厭劑的蜜使用如：劣脲、衛(wèi)胍等膜（胃蛋白凝）酶屆，包罵涵體謊形式接的酶疤等有變技性劑笛，蛋堂白結(jié)爪構(gòu)松擔(dān)散，顧易于肅溶解去除瓜變性閱劑，尚又可江恢復(fù)日原來笨構(gòu)象典型揀的抽名提液漏組成離子艘強(qiáng)度沿調(diào)節(jié)朋劑：輩蔗糖犬、KC勝l、Na針Cl等pH緩沖麥劑：談各種欄緩沖炒液溫度茅效應(yīng)察劑：DM鑰SO、甘潮油蛋白蹦酶抑孤制劑愉：PM鵝SF、亮砌肽素抗氧板化劑:D溫TT籃,巰基麗乙醇重金擱屬絡(luò)女合劑蔥：ED搬TA增溶蹲劑：Tr彩it捧on葬-1晌00（4）有機(jī)煌溶劑利提取一些端和脂患類結(jié)睛合比白較牢慰固或守分子幣中非廚極性肅側(cè)鏈魂較多棵的蛋摸白質(zhì)晴和酶墻。常用贈(zèng)的有嘩機(jī)溶昆劑有誕乙醇煮、丙思酮、炕異丙均醇、霞正丁榆酮等伴，這令些溶嫂劑可勉以與盈水互霧溶或番部分金互溶狀，同碗時(shí)具命有親囑水性膜和親冒脂性崗，因趴此常判用來添提取同與脂殿結(jié)合衣較牢駱或含漢非極格性側(cè)鹿鏈較恩多的允蛋白偉質(zhì)、亂酶和妄脂類挎。酶的次主要辮提取踩方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對(duì)象鹽溶液0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶二、記酶分籃離純鬧化的漲基本纖技術(shù)遇（簡(jiǎn)藍(lán)介）溶解燒度：殿鹽析深、沉位淀分子拐大小欣：離陵心、揮凝膠紐奉層析逃、過超濾電荷是：離商子交鄙換層畝析、額電泳親和貓性：搖親和丑層析萃取結(jié)晶等等(一)沉淀——根據(jù)梢不同睛物質(zhì)躍在溶硬劑中融的厚溶解僅度不徑同而渴分離沉淀邊是溶奔液中繪的溶筍質(zhì)由乞液相帽變成痰固相求析出距的過雕程溶解塞度的膽大小踩與溶餐質(zhì)和柜溶劑鼻的化水學(xué)性飲質(zhì)及傘結(jié)構(gòu)姑有關(guān)賭，溶遙劑組簽分的脫改變鋒或加烤入某卵些沉史淀劑風(fēng)以及段改變前溶液蒸的pH值、鵝離子爪強(qiáng)度撿和極閃性都籮會(huì)使辣溶質(zhì)荒的溶糕解度丸產(chǎn)生率明顯特的改愁變。+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化筒膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液李中蛋弟白質(zhì)董的聚緣瑞沉酶分錘子制沾備中盲最常護(hù)用的滔幾種喂沉淀戰(zhàn)方法⑴中性灰鹽沉惠淀（賴鹽析征法）吊：⑵有機(jī)睜溶劑犁沉淀寬：⑶選擇言性沉走淀⑷等電剝點(diǎn)沉佛淀：⑸有機(jī)帥聚合童物沉岔淀：聚乙貿(mào)二醇中性桶鹽的臭親水娛性大磁于蛋姥白質(zhì)紅和酶反分子件的親浪水性萄，所額以加泛入大瘡量中相性鹽藝后，詳奪走涉了水梁分子呼，破壞毒了水突膜，暴唐露出核疏水啦區(qū)域巨，同動(dòng)時(shí)又中和潔了電攔荷，破塘壞了扔親水勻膠體包，蛋琴白質(zhì)肅分子頓即形襖成沉穗淀。優(yōu)點(diǎn)北是：①成本歐低，鬧不需線要特居別昂皮貴的叛設(shè)備云。②操作萌簡(jiǎn)單片、安油全。③對(duì)許覽多生干物活豎性物花質(zhì)具拼有穩(wěn)以定作未用。1、中緞性鹽妻沉淀在鹽饞濃度賴達(dá)到柴某一扛界限藏后，轉(zhuǎn)酶的愿溶解串度隨思鹽濃薪度升賀高而雀降低莊，這肆稱為壘鹽析球現(xiàn)象呼。中性憑鹽的惡選擇常用透的中冒性鹽粱有硫拿酸銨嬸、硫冠酸鈉嶼、硫爸酸鉀德、硫禿酸鎂偵、氯犯化鈉忍、磷洋酸鈉新等，裁其中白最重竄要的宗是（NH4）2SO4：①溶解夸度大歌：尤其禾是在突低溫屠時(shí)仍諸有相翼當(dāng)高頃的溶電解度盼（酶慣和各擾種蛋幸白質(zhì)交通常爪是在份低溫狂下穩(wěn)笛定，洗鹽析丑操作啊也要看求在縫低溫返下（0～4℃）進(jìn)章行）

0℃20℃80℃100℃（NH4）2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101②分離體效果盲好：有的企提取湯液加償入適昆量硫升酸銨苗鹽析膜，一梯步就腹可以撐除去75％的棄雜蛋依白，溪純度訓(xùn)提高栗了四寇倍。③不易覆引起琴變性，有哪穩(wěn)定改酶與增蛋白冊(cè)質(zhì)結(jié)呆構(gòu)的廉作用。有慌的酶恥或蛋董白質(zhì)棍用2～3m攻ol現(xiàn)/L的(N縮慧H4)2SO4保存笛可達(dá)耀數(shù)年炕之久坑。④可以淚分級(jí)沉淀:半飽瞞和硫存酸銨凈溶液返可沉芒淀血常漿球閱蛋白喝，而供飽和份硫酸漁銨溶約液可察沉淀尤血漿管清蛋澡白。⑤價(jià)格佛便宜舅，廢血液不辱污染材環(huán)境擋。影響蟲鹽析現(xiàn)的因?qū)铀佧}飽難和度亮的影欠響不同扛的蛋捆白質(zhì)概，所參需的借飽和僑度不緊同蛋白縣質(zhì)濃鼓度的添影響在相類同的假鹽析沾條件殘下，浪蛋白境質(zhì)濃榆度越苦大越岡易沉默淀蛋白淹質(zhì)的鄉(xiāng)豐濃度儀愈高場(chǎng)，其挪它蛋遇白質(zhì)鋒的共渡沉作昏用也禾愈強(qiáng)蹄，分愚辨率蓋降低炸，一掩般常柱將蛋略白質(zhì)駐濃度渴控制割在2～3％丈為宜pH的影其響但硫諸酸銨城具腐朝蝕性蝦且緩違沖能技力差辦，飽段和溶居液的pH值在4.意5～5.謠5之間飾，使航用時(shí)監(jiān)多用雖濃氨騙水調(diào)紡整到pH反7左右遞。進(jìn)產(chǎn)行鹽漫析時(shí)幼的pH，要野選擇天在被屆鹽析營(yíng)的蛋頑白質(zhì)遼的pI附近溫度炎的影廉響在高緣瑞鹽濃蔑度下價(jià)，它且們的熔溶解等度隨翁溫度參的升撐高反鴉而降引低。其另外俯，高阻溫還創(chuàng)易導(dǎo)蹄致蛋茄白質(zhì)克變性慣。蛋永白質(zhì)蘭的鹽啞析一嘗般在悼室溫妻下進(jìn)條行。注意殿事項(xiàng)年：添加這固體音時(shí)，脂要加兔粉末陸狀的胳鹽并且顆緩慢駕分批醒添加并緩情緩攪戶拌，訓(xùn)避免半局部沖濃度云過高且注浪意不沉要產(chǎn)什生泡州沫2、有科機(jī)溶淡劑沉臉淀有機(jī)脹溶劑究對(duì)于質(zhì)許多妹蛋白脅質(zhì)（兼酶）爺、核薦酸、興多糖功和小額分子座生化罰物質(zhì)肚都能縫發(fā)生掌沉淀災(zāi)作用查，是構(gòu)較早親使用勤的沉頁(yè)淀方去法之冒一。有機(jī)粱溶劑晶之所穩(wěn)以能嗎使酶裕沉淀華析出媽。主遠(yuǎn)要是播由于怖有機(jī)尺溶劑港的存藥在會(huì)繡使溶薪液的絲式介電恒常數(shù)掙降低驕。例兩如，20勺℃時(shí)水支的介飛電常踢數(shù)為80，而82％乙窯醇水益溶液怖的介王電常注數(shù)為40。溶液暢的介病電常腦數(shù)降目低，蚊就使罵溶質(zhì)閑分子季間的頓靜電叢引力裙增大憂，互猾相吸莫引而謀易于潔凝集臉，同刻時(shí)，炭對(duì)于鞋具有點(diǎn)水膜摘的分畢子來彩說，捷有機(jī)頁(yè)溶劑蠻與水腹互相繁作用縫，使旁溶質(zhì)溝分子殿表面軍的水六膜破襯壞，焦也使幼其溶壩解度掏降低鞭而沉拿淀析熔出。常用隨于酶勤的沉就淀分蚊離的勒有機(jī)借溶劑吸有乙首醇、歸丙酮柴、異疤丙醇殃、甲糞醇等基本框原理有機(jī)失溶劑建沉淀斑主要趟是降低龜水溶傍液的體介電付常數(shù)，減尚小溶繡劑的洞極性加，削等弱溶凍劑分修子與搜蛋白茄質(zhì)分質(zhì)子間場(chǎng)的相適互作培用力判，增右加了乞蛋白貞質(zhì)分仇子間密的相傍互作澤用，濱導(dǎo)致把蛋白漸質(zhì)溶攏解度井降低獎(jiǎng)而沉肢淀。由于減使用追的有面機(jī)溶駱劑與芽水互禽溶，滲它們園在溶買解于初水的侮同時(shí)艘從蛋朝白質(zhì)秤分子償周圍店的水驕化層活中奪冤走了搬水分葡子，破壞壯了蛋業(yè)白質(zhì)刻分子?jì)尩乃異u膜，因堅(jiān)而發(fā)澤生沉錘淀作霉用溶液惑介電悠常數(shù)殼的減疫少就圓意味夏著溶渣質(zhì)分裙子異膀性電航荷庫(kù)撓侖引拴力的趴增加頭，使帶電搖溶質(zhì)待分子圣更易巡壽互相皺吸引戀而凝街集，從賢而發(fā)今生沉溉淀。優(yōu)點(diǎn)俱：①分辨窄能力曉比鹽舅析法吧高，眠即一叉種蛋斷白質(zhì)裹或其趟他溶班質(zhì)孫只在近一個(gè)辭比較弄窄的積有機(jī)理溶劑膏濃度貪范圍成內(nèi)沉砌淀。②沉淀糾不用賓脫鹽械，過賓濾比號(hào)較容鴉易（末如有蟻必要期，可錯(cuò)用透超析袋兆脫有繼機(jī)溶系劑）躺。缺點(diǎn)館：對(duì)津某些所具有遵生物某活性冰的大押分子盯容易寇引起圈變性哥失活特，操撇作需雀在低竟溫下粱進(jìn)行刷。3、選衛(wèi)擇性名變性術(shù)沉淀配法利用墻蛋白傳質(zhì)、術(shù)酶與吧核酸族等生繡物大桶分子越與非鞋目的泉生物釋大分夕子在物理輕化學(xué)亭性質(zhì)等方療面的段差異版，選御擇一精定的勤條件緞使雜固蛋白洋等非目器的物榨變性哪沉淀而得動(dòng)到分豪離提事純，融稱為攝選擇醫(yī)性變押性沉斜淀法唯。方法劑：加脫熱、賀大幅扁度改獎(jiǎng)變pH，加默有機(jī)啟溶劑食（丙言酮、冤乙醇商等）艱、加慎重金英屬離旬子如Ag+、Cu2＋、Pb2＋等、遞加有俯機(jī)酸梳如三堵氯乙源酸、舍水楊諸酸、狐苦味軍酸、摘鞣酸穿、過菌氯酸需等及吃表面梅活性婦劑。4、等摸電點(diǎn)脖沉淀攜法等電錯(cuò)點(diǎn)沉末淀法光是利傍用具惜有不引同等緣瑞電點(diǎn)請(qǐng)的兩成性電拔解質(zhì)蔑，在攝達(dá)到惑電中陜性時(shí)尿溶解釋度最差低，帥易發(fā)梨生沉焦淀，扎從而算實(shí)現(xiàn)枝分離慰的方謝法。此法棚主要谷用于可在分超離純鎮(zhèn)化流百程中斬去除弦雜蛋削白，景而不偷用于腳沉淀爹目的福物氨基初酸、隆蛋白竊質(zhì)、等酶和蹄核酸捉都是候兩性岔電解牛質(zhì)由于芝許多霧蛋白喉質(zhì)的瞇等電親點(diǎn)十富分接簽近，扇而且薦帶有對(duì)水膜瓣的蛋哄白質(zhì)軟等生惕物大差分子用仍有仗一定緞的溶德解度參，不世能完鍛全沉敬淀析給出，店因此姿，單辟獨(dú)使涉用此漲法分扛辨率贈(zèng)較低璃，效捎果不策理想因而脾此法尋常與畫鹽析下法、繩有機(jī)塑溶劑皮沉淀匪法或估其他顛沉淀柴劑一耳起配災(zāi)合使納用，覆以提壩高沉那淀能睜力和是分離慰效果熟。5、靜有機(jī)江聚合王物沉暗淀法有機(jī)奪聚合東物是纖六十裹年代雜發(fā)展絮起來哲的一裳類重篩要的筋沉淀疲劑，黨最早臂應(yīng)用蠢于提咽純免嫁疫球私蛋白劃和沉棉淀一鏡些細(xì)識(shí)菌和本病毒殃。近關(guān)年來培廣泛慣用于墨核酸錦和酶園的純?cè)?yīng)用珍最多革的是次聚乙閘二醇(P溉EG駛)，它城的親糞水性拖強(qiáng)，甚溶干窯水和系許多沸有機(jī)停溶劑河，對(duì)近熱穩(wěn)鴉定，牽有廣氧泛圍凱的分鉆子量法，在勺生物勒大分韻子制某備中謎，用欺的較休多的水是分狀子量搏為60燦00～20伯00拌0的PE孔G。作弱用機(jī)最制不蠻明。優(yōu)點(diǎn)脆：①操作泥條件憂溫和川，不索易引爛起生閉物大毛分子暫變性脅。②沉淀鑄效能羊高，半使用苦很少瞇量的PE姑G即可軟以沉誘淀相專當(dāng)多朋的生每物大煌分子劑。③沉淀板后有賭機(jī)聚方合物右容易狗去除禿。（二速）透析利用囑透析例袋把挺大分慚子蛋緞白質(zhì)托與小執(zhí)分子滾化合權(quán)物分軍開的警方法究。袋內(nèi)狡：大醋分子赤量的妄生物壟大分驕子袋外咽：鹽末和小幫分子鞭物質(zhì)不斷敵擴(kuò)散閃透析誦到，枯直到紛袋內(nèi)購(gòu)?fù)鈨呻S邊的熱濃度魔達(dá)到忌平衡該為止彎。（三倚）過濾過濾驚的分鵝類及姜其特男性(根據(jù)摟過濾然介質(zhì)茶截留絞的物歐質(zhì)顆守粒大禁小不恰同)類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜四種廳常用序膜分侵離過屬程的領(lǐng)截留咳特性超濾超過喜濾即委超濾刪，超襲濾是斯一種肅加壓道膜分按離技范術(shù)，族即在哀一定既的壓詢力下?lián)?，使錢小分套子溶明質(zhì)和宏溶劑泳穿過娃一定滋孔徑頂?shù)奶睾踔频男U薄膜宣，而欲使大公分子邀溶質(zhì)鑰不能味透過憑，留校在膜麻的一弄邊，扣從而岸使大表分子她物質(zhì)所得到望了部支分的販純化念。加壓酶溶液超濾膜支持柵板超濾液優(yōu)點(diǎn)音：操作辟簡(jiǎn)便陸，成巾本低司廉，怨不需勾增加世任何住化學(xué)馳試劑段，尤暑其是還超濾病技術(shù)鋒的實(shí)擔(dān)驗(yàn)條債件溫辱和，卵與蒸華發(fā)、沾冰凍矛干燥惡相比妙沒有易相的世變化潔，而得且不擺引起可溫度慶、pH的變承化，占因而圣可以臣防止喚生物杰大分柏子的奏變性澡、失濾活和騎自溶尤。缺點(diǎn)統(tǒng)：不能鼻直接尖得到洗干粉攜制劑隸。對(duì)慌于蛋梢白質(zhì)罪溶液?jiǎn)荆黄阒幌弈艿弥?0～50％的瞎?jié)舛葼?。超濾仁技術(shù)污的關(guān)們鍵是膜。在生烈物大塊分子膊的制傻備技桌術(shù)中蠟，超籍濾主松要用鉆于生享物大老分子鳥的脫紛鹽、姨脫水濫和濃芝縮等慕。（四單）電余泳電泳揉是指殿在電約場(chǎng)的初作用腹下，師這些掀帶電齡顆粒羽向著扛與其棚所帶御電荷膽性質(zhì)誕相反袖的電柳極方偷向移錫動(dòng)。電泳蘆技術(shù)外就是勁利用疏在電多場(chǎng)的殲作用猶下，局由于扁待分軋離樣尤品中號(hào)各種閱分子止帶電蹲性質(zhì)籌以及椅分子擊本身銷大小矩、形淺狀等貿(mào)性質(zhì)展的差百異，舊使帶黑電分閃子產(chǎn)校生不矩同的隊(duì)遷移煤速度祝，從繡而對(duì)援樣品中進(jìn)行遺分離撞、鑒火定或皺提純乒的技昂術(shù)。瓊脂摟糖凝間膠電近泳和叉聚丙展烯酰肚胺凝應(yīng)膠電桃泳。瓊脂炒糖凝唉膠電禽泳聚丙點(diǎn)烯酰坡胺凝務(wù)膠電耍泳1、聚寄丙烯按酰胺偏凝膠涂電泳群（PA鹿GE靜)聚丙知烯酰映胺凝束膠電農(nóng)泳簡(jiǎn)兔稱為PA尿GE（Po嚇ly煉ac渴ry逃la損mi茂dege陵l喪el扔ec勻tr碼op倘ho藥re傲si賤s），關(guān)是以鍬聚丙棵烯酰弦胺凝繞膠作悠為支詠持介丑質(zhì)。悉聚丙腎烯酰置胺凝車膠是睜由單填體的恐丙烯蜓酰胺縫和甲命叉雙職丙烯付酰胺反聚合目而成糞，這殖一聚奮合過船程需光要有立自由江基催孟化完嘆成。SD鏟S－聚磨丙烯窗酰胺序凝膠前電泳牢（SD隊(duì)S－PA侵GE）SD熄S(十二節(jié)烷基處磺酸要鈉)-啄-陰離誦子表罪面活盾性劑盼即去煎污劑僅，它診可以夢(mèng)斷開撓分子?jì)饍?nèi)和想分子棟間的竭氫鍵晨，破塞壞蛋秧白質(zhì)丟分子君的二殲級(jí)和銀三級(jí)危結(jié)構(gòu)稈，使斥蛋白量質(zhì)舒爺展。岡并且邁每2個(gè)氨啟基酸期與一蘋個(gè)SD寫S結(jié)合惡，使得飄每個(gè)籮蛋白搶質(zhì)分初子所杰帶電饒荷基悲本相繞同。這樣女就消叮除了鋤各種柔蛋白然質(zhì)本豆身電苗荷上志的差曬異，電泳董遷移濤率只煙與蛋揭白質(zhì)遵分子扔量大悟小有均關(guān)制備虜式電漸泳通廟常以規(guī)不含SD羅S的原推態(tài)di運(yùn)sc多-P迷AG絹E進(jìn)行羨，以枝便回等收具包有活闖性的宿蛋白綱質(zhì)；苦蛋白寶質(zhì)樣濟(jì)本要頓先經(jīng)旗過部堆分純鑒化，扒否則朵效果例不佳巧，并器先以歉分析齒式電晴泳確戚定所融要色混帶的港位置繡。有幾桌個(gè)方觀法可救以鑒譽(yù)定蛋大白質(zhì)交的位則置：(1斤)Co燙om序as依si改eBl找ue染色車法;朋(2慣)活性耽染色;弓(3跟)完UV照射倒呈像悠。定卷位后敵要把廣含有差目標(biāo)架酶的鄭凝膠鐮切出脅來，槳進(jìn)行樣電泳查分離療，獲萌得酶（五滋）離浴心離心計(jì)技術(shù)植主要扒用于屬各種散生物濃樣品悉的分之離和鼻制備竄，生例物樣肌品懸奮浮液屈在高幅速旋籍轉(zhuǎn)下憲，由傻于巨壟大的佩離心廟力作才用，備使懸住浮的勉微小林顆粒炭（細(xì)轎胞器后、生玩物大茂分子貼的沉更淀等色）以乓一定露的速飽度沉腰降，木從而裹與溶時(shí)液得魚以分嫁離，稅而沉任降速叢度取皂決于踏顆粒卸的質(zhì)溫量、率大小竿和密陰度。密度前梯度五區(qū)帶瘋離心仍法（難簡(jiǎn)稱眠區(qū)帶聚離心點(diǎn)法）差速約離心俊法（六徐）層陶析層析洽法又睬稱色窄譜法郊（Ch刻ro有ma研to軋gr問ap漆hy），帳是一簽種基蘇于被糠分離你物質(zhì)廣的物薄理、?；瘜W(xué)家及生咱物學(xué)啊特性菜的不年同，恐使各肚組分忽以不怨同程仔度分甲布在濁兩個(gè)島相中古，其母中一繪個(gè)相啊為固罩定的(稱為琴固定言相)，另說一個(gè)悅相則偏流過淋此固彼定相(稱為侮流動(dòng)噸相)并使衰各組尼分以趟不同剖速度士移動(dòng)傳，從限而達(dá)桑到分教離。層析諷分離咸方法層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離離子償交換厚層析凝膠匠滲透逗層析親和粥層析--利用竹生物刻分子菊與配議基之鄭間所榆具有殺的專鏈一而烤又可漲逆的伏親和離力，弊而使夜生物該分子館分離升純化賴的技笑術(shù)酶與享底物酶與非競(jìng)爭(zhēng)篇性抑疫制劑酶與留輔助嘴因子抗原彼與抗趁體酶RN炎A與互黃補(bǔ)的RN態(tài)A分子厭或片汽段RN優(yōu)A與互鍬補(bǔ)的DN橫A分子刪或片猴段（七著）濃圓縮、籌干燥脅和結(jié)幟晶濃縮顆：低寇濃度高濃男度離心水、沉芝淀、意吸水窗劑（PE陡G、硅前膠等泊）蒸發(fā)歪濃縮尿：通冷過加日熱或苗者減毫壓方博法，吃使得岔溶液汽中部呆分溶鍛劑汽距化蒸海發(fā)，蘿常采拾用真譜空濃群縮。酶高庸溫失傅活，一般技在60瘦℃以下，真咬空條瞇件下鈴進(jìn)行被濃縮食或干見燥——真空勉干燥散，另?xiàng)澩膺€約有冷村凍干粗燥、側(cè)噴霧痕干燥悶、吸逝附干徐燥、搬氣流剛干燥洋等。冷凍際干燥將酶茫液降猾溫到定冰點(diǎn)饑以下遲，使見之凍韻結(jié)成培固態(tài)健，然飄后在標(biāo)低溫柳狀態(tài)掛抽真繳空，口使冰弦升華孝，得捧到干雙燥的福酶制臥劑酶質(zhì)攀量高吧，結(jié)蒸構(gòu)完筒整，描活力兆損失娃少，候但是隆成本燒高，春適合菜對(duì)熱夠敏感地而價(jià)女值較繭高的沉酶類結(jié)晶結(jié)晶插與沉限淀的另區(qū)別沉淀錫和結(jié)憂晶在羨本質(zhì)努上同霉屬一雁種過佳程，付都是拘新相肉析出尋的過競(jìng)程。廣兩者田的區(qū)希別在汗于構(gòu)辰成單宇位（嗎原子筑、離偽子或騎分子跳）的步排列愉方式到不同在條沫件變庸化緩各慢時(shí)賭，溶拜質(zhì)分耽子具靈有足炭夠時(shí)隸間進(jìn)污行排料列，司有利寒于結(jié)怕晶形魯成；于相反術(shù)，當(dāng)貼條件亦變化的劇烈市，強(qiáng)耐迫快霸速析慈出，耀溶質(zhì)揮分子歷來不擱及排思列就駐析出泡，結(jié)掃果形哄成無浮定形壤沉淀蚊。由于泄只有悔同類呼分子們或離際子才濕能排縣列成頭晶體認(rèn)，故賴結(jié)晶責(zé)法具異有高扭度的派選擇豈性。酶在忠結(jié)晶冊(cè)之前鑒，酶液蛛必須她經(jīng)過越純化濤達(dá)到篩一定衫的純疾度。總飼的趨違勢(shì)是因酶的謝純度測(cè)越高秤，越炕容易毀進(jìn)行脊結(jié)晶默。如與果酶伴液純厘度太超低，煌不能技進(jìn)行熊結(jié)晶冬。通常還酶的儉純度艷應(yīng)當(dāng)圍在50繳%以上辟，方價(jià)能進(jìn)辣行結(jié)增晶。不同炭的酶棉對(duì)結(jié)盒晶時(shí)田的純?cè)S度要蹲求不談同。有些搬酶在勢(shì)純度鞋達(dá)到50軍%時(shí)就眨可能恨結(jié)晶扔，而搶有些綢酶在搭純度竭很高冬的條彎件下疊也無盛法析祖出結(jié)杯晶。桐所以迅酶的棗結(jié)晶碗并非蛋達(dá)到呈絕對(duì)驕純化刺，只并是達(dá)然到相走當(dāng)?shù)木眉兌全I(xiàn)而已覺。常用斜方法盾：鹽勞析結(jié)槳晶、見有機(jī)撓溶劑挑結(jié)晶僵、透桿析平婦衡結(jié)丑晶、雙等電永點(diǎn)結(jié)爐晶等吃。三、航分離險(xiǎn)純化久方法閱的選課擇及襯基本扁步驟生物城大分景子能突否高閃效率橫地制蓄備成叔功，額關(guān)鍵牢在于么分離乎純化隔方案籍的正壓確選狂擇和雹各個(gè)莫分離嬸純化綁方法潮實(shí)驗(yàn)眨條件紗的探視索。犁選擇纖與探角索的河依據(jù)郵就是找生物圣大分肆子與紀(jì)雜質(zhì)什之間吊的生起物學(xué)屢和物共理化規(guī)學(xué)性烈質(zhì)上霉的差洋異。斃由本蠅章前工述的登生物塞大分愉子制崖備的濃各種用特點(diǎn)涉可以振看出頭，分離僻純化稼方案曉必然困是千嬸變?nèi)f京化的前處理：粗分離：細(xì)分級(jí)：結(jié)晶：生物組織破碎、溶解、離心分離無細(xì)胞提取液鹽析、等電點(diǎn)沉淀、超濾、有機(jī)溶劑分級(jí)層析、電泳精制品結(jié)晶或者凍干四、損分離灘提純戲操作指要求盡量率減少長(zhǎng)酶活奸性的中損失低溫0～5℃、有哨機(jī)溶鉆劑：-1猛5～-2店0℃抽提墳液加決入ED與TA（絡(luò)轉(zhuǎn)合金普屬）抽提懼液加龍入巰王基乙殺醇（次防止惰含-S之H酶失窩活）不能疑過度失攪拌犯，以遇免產(chǎn)吵生大夜量泡期沫，馬使酶罩變性pH值和氣鹽濃災(zāi)度的飾控制抗菌咽、抑舍菌測(cè)定記酶的萬比活溉力⑴早期袍分離鋪純化特點(diǎn)幸：①粗提忠取液歐中物優(yōu)質(zhì)成練份十考分復(fù)裂雜。②欲制嗓備的配生物抗大分核子濃是度很犯稀。③物理晚化學(xué)暢性質(zhì)債相近爛的物賊質(zhì)很幫多。④希望錦能除鎖去大廉部分糟與目諷的產(chǎn)哲物物砍理化指學(xué)性撇質(zhì)差制異大冤的雜量質(zhì)。對(duì)所開選方介法的田要求供：①要快轟速、珠粗放征。②能較遙大地?fù)砜s小索體積孤。③分辨駛力不照必太兄高。④負(fù)荷刮能力猜要大萬。可選弟用的碗方法天：吸附再；萃慨取；瘦沉淀頃法（時(shí)熱變勉性、械鹽析儀、有彩機(jī)溶距劑沉貧淀等值）；敲離子碰交換系（批曠量吸衣附）胃；親是和層亡析等替。⑵晚期皆分離豬純化可選民用的腐方法異：吸騎附層撿析、準(zhǔn)鹽析讀、凝似膠過啄濾、妙離子躲交換升層析盲、親炎和層奔析、歪等電籍聚焦兔制備吵電泳佛、制棚備HP肅LC等。注意獻(xiàn)的問盤題：①鹽析酒后要潔及時(shí)果脫鹽嫩。②用凝芒膠過嗎濾時(shí)橫如何疼縮小來上樣貴體積歐，因畏為凝她膠層暴析柱座的上資樣體醋積只扒能是沃柱床愧體積左的1/路10～1/暈6，也些可以淺使用川串聯(lián)鑼柱以幫加大淡柱床掘體積族。③必要舒時(shí)也襪可以垂重復(fù)飽使用鋼同一返種分為離純廳化方賓法，毀例如零分級(jí)籠有機(jī)少溶劑蒸沉淀倉(cāng)，分唇級(jí)鹽臣析，已連續(xù)決兩次部凝膠宏過濾捏或離改子交表?yè)Q層核析等衰。④分離縫純化蓮步驟歉前后五要有投科學(xué)宋的安驅(qū)排和券銜接櫻，盡退可能壯減少鼠工序糊，提輸高效日率。句例如掠吸附嘩不可艙以放冰在鹽堂析之佩后，維以免陵大量涌鹽離拖子影瓦響吸搖附效脈率；好離子米交換伏要放納在凝里膠過鏈濾之無前，稿因?yàn)榫壢痣x子趨交換胞層析即的上宴樣量咽可以尖不受北限制界，只央要不端超過堡柱交色換容黑量即帥可。⑤分離窄純化仰后期性，目綁的產(chǎn)昂物的但純度顯和濃奸度都錘大大輩提高黑，此型時(shí)對(duì)肯于很遍多敏碎感的巨酶極刪易變會(huì)性失謝活，惱因此間操作路步驟卻要連續(xù)眨、緊肯湊，盡亮可能孤在低雷溫下育（如伐在冷賞室中河）進(jìn)火行。⑥得到宵最終濱產(chǎn)品飼后，屆必要?jiǎng)t時(shí)要針立即騾冰凍掛干燥虧，分份裝并善寫明業(yè)標(biāo)簽愿，－20繪℃或－70輩℃保存五、咐酶的張活力刮測(cè)定勁與純晨度測(cè)乒定1.酶的春活力桑測(cè)定餓與比怨活性——評(píng)價(jià)蛛提純歪方法會(huì)好壞漏的指頃標(biāo)總活修力的蔬回收化率反映照提純旨過程妻中酶姨活力姓的損由失情農(nóng)況比活漠力提賴高的晃倍數(shù)反映科純化否的效妨率在酶壓純化接的每矛個(gè)階鑒段，拼都需職要進(jìn)然行上悔述測(cè)義定兩者堤合理?xiàng)畎才琶?，但同通常蔥不可恥兼顧悶，根責(zé)據(jù)具撤體情曉況取店舍。2.純度然鑒定銹：方法振很多瀉，檢快驗(yàn)是乳否還拾有繼殿續(xù)純拋化的投必要由于規(guī)酶分部子高坑度復(fù)封雜，完不同叔方法身檢驗(yàn)拖出的監(jiān)結(jié)果襲可能些不同酶純襲度要據(jù)注明訂：電樸泳純佛、層籍析純辜、HP縮慧LC純。鑒定慘依據(jù)痛：酶分飲子的辜大小仆、形貼狀：林超速甩離心得法、戒凝膠丙層析帥等酶分蜂子的騙電荷爺性質(zhì)溉：離揉子交查換層哪析、孩電泳仗等酶分知子的賺化學(xué)西性質(zhì)炎：一哲級(jí)結(jié)慰構(gòu)測(cè)基