分子生物學(xué)筆記第一節(jié)的含義

第一 緒所謂在分子水平上命的本質(zhì)主要是指對(duì)遺傳、生殖、生長(zhǎng)和發(fā)育等生。第二 分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)由于50年代以來的迅速發(fā)展，該領(lǐng)域已形成了比較完整的和研究技研究?jī)?nèi)容包括核酸/組的結(jié)構(gòu)、遺傳信息的、轉(zhuǎn)錄與翻譯，核酸1PAGEPAGE7能關(guān)系方面取得了一些進(jìn)展，但是對(duì)其基本規(guī)律的認(rèn)識(shí)尚缺乏突破性的進(jìn)展。細(xì)胞生物學(xué)：從細(xì)胞普通生物學(xué)（動(dòng)物&植物）&微生物學(xué)：不同生物類型動(dòng)（Biochemicalprocesses）1是什么（what，生物學(xué)重要性和具體過程），)不具有多樣性，不能攜帶的信息，當(dāng)時(shí)對(duì)攜帶遺傳信息的分子的是足的進(jìn)步。1944年，Avery等人發(fā)現(xiàn)從致病力強(qiáng)的光滑型（S型）鏈球菌提在對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的研究上，1950-52年Wilkins及Flanklin用X-線衍射技術(shù)測(cè)定這一階段是從50年代初到70年代初，以1953年ton和rik雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)代。基配對(duì)是核酸、遺傳信息傳遞的基本方式；從而最后確定了核酸是遺傳的物質(zhì)在發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)同時(shí)，Watson和Crick就提出DNA的可能模.年代 特別是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學(xué)家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質(zhì)的遺傳，隨后研究表明這套遺傳在生物上述重要發(fā)現(xiàn)共同建立了以中心法則為基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)基本。1970年Temin和Baltimore又同時(shí)從雞肉瘤顆粒中發(fā)現(xiàn)以RNA為模板合成1958年Ingram證明正常的血紅蛋白與鐮刀狀細(xì)胞溶血癥的血紅蛋白1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶為工DNA分子有效地插入到細(xì)菌細(xì)胞之中，產(chǎn)生了重組DNA的克隆。Berg是重組1977年Boyer等首先將人工合成的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子14肽的重1979年技術(shù)公司用人工合成的人胰島素重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌1993年，Mullis由于發(fā)明PCR儀而與第一個(gè)設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的至今我國(guó)已有人干擾素、人2、人集落刺激因子、重組人乙型肝、工程幼畜腹瀉等多種工程藥物和進(jìn)入生產(chǎn)或臨床試用，世界上還有幾百種工程藥物及其它工程產(chǎn)品在研制中，成為農(nóng)業(yè)和轉(zhuǎn)動(dòng)植物和剔除動(dòng)植物的成功是工程技術(shù)發(fā)展的結(jié)果投放市場(chǎng)，1996年轉(zhuǎn)玉米、轉(zhuǎn)大豆相繼投入商品生產(chǎn)，最早研制得total:52600000USA:30300000Agentina:10000000Canada:300 500000診斷與治療是工程在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)重要方面。 缺陷我國(guó)也在1994年用導(dǎo)入人凝血因子Ⅸ的方法成功治療了乙型血友病的患者。在我國(guó)用作診斷的試劑盒已有近百種之多。診斷和治療正1977年Sanger測(cè)定了ΦX174-DNA全部5375個(gè)核苷酸的序列；他和齒類動(dòng)物以及水稻、擬南芥和酵母等50多種生物的全組序列測(cè)定工作。提出、啟動(dòng)的人類組計(jì)劃(HumanGenomeProject，HGP)，被譽(yù)為生命科學(xué)的“登月”計(jì)劃。年月日國(guó)家人類組研究項(xiàng)目斯博士隆重宣布，美、英、日、法、德和中國(guó)由30億個(gè)堿基對(duì)（3×109bp），組成的人類組，蘊(yùn)藏著生命的奧秘?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)人類數(shù)目約為3.4萬至3.5萬個(gè)，僅比果蠅多2萬個(gè)，遠(yuǎn)小于原先10萬個(gè)的估計(jì)。2001年成立國(guó)際人類蛋白質(zhì)組組織（HUPO），20031215啟動(dòng)兩個(gè)首單克隆抗體 1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)出單克隆抗體80年代以后隨著工程抗體技術(shù)而相繼出現(xiàn)的單域抗體、單鏈抗體、嵌分子遺傳學(xué)基本理論建立者Jacob和Monod最早元學(xué)說打開了細(xì)菌代謝的分子機(jī)制而獲得了生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。同時(shí)他們還了mRNA分子1977年最先發(fā)現(xiàn)猴SV40和腺中編碼蛋白質(zhì)的序列是不連續(xù)的，這種內(nèi)部的間隔區(qū)（內(nèi)含子）在真核組中是普遍存在的，揭開了認(rèn)識(shí)真核組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的序幕。70年代中期以后，癌和抑癌的發(fā)現(xiàn)、蛋白酪氨酸激酶的發(fā)現(xiàn)及其在免疫活性細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別及其活化信號(hào)的傳遞途徑方面和細(xì)胞增殖控制方面等都形成了一些基本的概念，當(dāng)然要達(dá)到最終目標(biāo)還需相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間的努力。期 遺傳信息的傳遞與保持（replication轉(zhuǎn)錄與調(diào)控翻譯與調(diào)控 教加強(qiáng)溝通（師生、學(xué)生、與外界作業(yè) 能力、學(xué)習(xí)資源利用能力等、表述能力小組學(xué)習(xí)（克 、一起進(jìn)步（多元化人才培養(yǎng)、重能力培養(yǎng)平時(shí)小考期末考試平時(shí)相互幫助（2分TurnerP.C.etal.MolecularBiology.科學(xué)WeaverR.MolecularBiology.科學(xué)BenjaminLewin.GenesVI,OxfordUni.Press,。《分子生物學(xué)》，中國(guó)，1997。《現(xiàn)代分子生物學(xué)》，高等教育，1997?！斗肿舆z傳學(xué)》，科學(xué)中國(guó)生物信息：分子生物學(xué)信息網(wǎng) 生物軟件 中華網(wǎng)：大學(xué)分子生物學(xué)教學(xué)：/fzjx/fzswx/classguide/ Ergito(GenesVII）:TutorialsinMolecularBiology: .分子生物學(xué)習(xí)題及解答.大學(xué)，2002王金發(fā)等.分子生物學(xué)與工程習(xí)題集.科學(xué)第2DNA第1節(jié)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)第2節(jié)核酸的化學(xué)組成第3節(jié)核酸的結(jié)構(gòu)第4節(jié)核酸的物理化學(xué)性質(zhì)第5節(jié)超螺旋和拓?fù)洚悩?gòu)第1編碼氨基酸的61個(gè)子具有簡(jiǎn)并性、通用性b、編碼選擇性表達(dá)的信原核生物的結(jié)構(gòu)占Genome的比例很大，Φx174phage5386bp，結(jié)構(gòu)15RNA：傳染媒介是顆粒（組RNA、蛋白質(zhì)外殼Tobacco 類（viroid）:使高等植物產(chǎn)生疾病的傳染性因子，只由RNA組成Prion(proteinaccousinfectionsparticle)朊－－－蛋白質(zhì)樣的因人類庫(kù)魯（kuru）均由傳染原蛋白顆粒引起，統(tǒng)稱Prion(朊朊毒體的致病過程是：首先經(jīng)一定途徑（如進(jìn)食患病動(dòng)物和內(nèi)臟）侵入機(jī)體并進(jìn)普利學(xué)說公布之初，在學(xué)術(shù)界曾遭到猛烈，多數(shù)人持否定態(tài)度。因?yàn)榉肿由飳W(xué)發(fā)現(xiàn)的重大科學(xué)價(jià)值，普利榮獲1997年度生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。第2DNAisanucleotidepolymerwithcovalentbondsbetweenthesugarandPhosphateAlongmolecularchaincontainingasugar,aphosphateandoneoffourdifferentnucleotidebases.ChemicalComposition（化學(xué)組成 -phosphodiester (G) (C) (T)名稱與縮寫 cytosinethymine guanine名稱與縮寫 adenosine(Ado) guanosine(Guo) cytidine(Cyd) thymidine(Thd) （帶磷酸adenosine5’-mono(di,tri)AMP,ADP, (dAdo) dAMP,dADP,主鏈的脫氧核糖的羥基能與水形成氫鍵，而磷酸基團(tuán)在生理?xiàng)l件下離解為負(fù)離子第3.1938...Atry 首次用－射線分析b150 hgf A+G/T+C=1A+T G+192 Aldr d &Rosalind 直徑

螺距為34?(任一條鏈繞軸一周所升降的距離每圈有10個(gè)核苷酸(堿基力（Vandewaals疏水作用力(Hydrophobic 堿基內(nèi)能增加(溫度),圖反向重復(fù)序列（invertedrepeatitivesequenceorinvertedrepeats,IR）,又稱回三螺旋DNA(TribleHelix T.S1953年，Watson&CrickD.SDNAmodel潛在的專一與 (蛋白質(zhì))結(jié)合的能形成T.SDNA1957年Felsenfeld等發(fā)現(xiàn)一股為嘌呤，另一股為嘧啶的核苷酸雙鏈能夠形成三鏈如：polyA/polyU polyd(AG)/polyd(CT)——三螺旋DNA的概念提出1987年Mirkin.S.M證明smidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在，這些發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了三螺旋DNA的研究a、D.SDNAD.S.DNA→T.SDNAS.S☆ (偏堿性介質(zhì)中穩(wěn)定 G＊G、A＊A、☆PY/PU +PY(偏酸性介質(zhì)中穩(wěn)定) 常見類型G＊C＋ 3、四股螺旋DNA (tetraplexDNA,TetrableHelixDNAA、穩(wěn)定真核生物結(jié)構(gòu)B、保證DNA末端準(zhǔn)確C、與DNA分子的組裝有關(guān)D、與的meiosis&mitosis有1、條件：加熱，pH，（尿素、酰胺)，低鹽濃度¤¤DNA溶液的溫度（0.1℃／分）Tm=ofCtC0/2OD增加值的中點(diǎn)溫度(85-95℃)DNA雙螺4TmAT,C,GGC Tm值愈AT形成變性，變性加快，Tm值小 已知大腸桿菌的組為4.2x106bp,COt1/2= 四、核酸分子雜交固相雜交(濾膜雜交1975E.M.Southern S.S.DNA×S.S. J.C.Northern S.S.RNA×S.S. Western Protein(antigen)×＊固相分子雜交(1975EM第5一、超螺旋 松馳態(tài)DNA（relaxform）低能量常態(tài)超螺旋（Supercoied） 正超螺旋（positivesupercoiled）overwinding右旋負(fù)超螺旋（Negative 松纏unwinding(左旋White

W（Writhingnumber）：超盤繞數(shù)，即超螺旋數(shù)，直觀上為雙螺旋在空間的轉(zhuǎn)動(dòng)2、核酸的一級(jí)結(jié) 書寫方3、 ＆Crick的 參 大小 二級(jí)結(jié)構(gòu)的多態(tài) 6、變性：溶解曲線 化學(xué)試劑、鹽、7、復(fù) 形成、類第3章與組的結(jié)斷裂構(gòu) 性2）種C真核生物的結(jié)、簇、DNA、分散重復(fù)DNA序列人類組計(jì)了解人類組的重復(fù)順序、人類組計(jì)劃第1節(jié)的概第2節(jié)命名簡(jiǎn)第3第4節(jié)及組的大小與C值第5節(jié)第6節(jié)第8節(jié)第9節(jié)人類組研究進(jìn)第1節(jié)的概結(jié)構(gòu)：編碼蛋白質(zhì) 調(diào)控研究的發(fā) 分子反向生物學(xué)1955，Benzer用以表述T4具溶菌功能的區(qū)的2個(gè)亞區(qū): 第2節(jié)命名簡(jiǎn)表示3個(gè)小寫斜體字母表示 3個(gè)小寫斜體字母+1個(gè)大寫斜體字母。自然質(zhì)粒3個(gè)正體字母，首字母大寫重組質(zhì)粒在2個(gè)大寫字母前面加小寫人 一、割裂的發(fā)

第3真核生物的都是不連續(xù)或割裂(splitgene)。 開的。割 割 SplittingGeneSplittinggeneSplittingGene 大T抗原小t抗原Splittinggene割裂的外顯子在中的排列順序和它在成熟mRNA產(chǎn)物中的排列順序是相 關(guān)系的序列，結(jié)果表明一個(gè)的外顯子常與其他的外顯子有親緣關(guān)系。兩個(gè)相關(guān)內(nèi)含子之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如其外顯子之間的親緣關(guān)系緊密 SplittinggeneIntron并非“含而不露 細(xì)胞色素bIntronII編碼成熟Exon并非“表里如一人類尿激酶原ExonI不編碼氨基酸序并非真核生物所有的結(jié)構(gòu)均為splittinggeneHistonegenefamilyYeast中多數(shù)第4節(jié)及組的大小與C 的例子里，甚至有5060kb大多數(shù)酵母小于2kb，很少有超過5kb的開 開 廣和

由于人們無法用已知功能來解釋組的DNA含量，所以產(chǎn)生了C值(Cvalue第5節(jié) 一闕新歌聲漱玉，歌聲漱玉采蓮人一、原核生物的(overlap在細(xì)胞 中，一般一段序列只以三種白質(zhì)可讀框一種被閱，但是在一些或線粒體中，兩個(gè)近的一種巧妙的方式生，并不同的可讀框被閱讀并表達(dá)，因此一段相同的DNA序列可以編碼兩個(gè)非同源蛋白φXl74的DNA序列組織上有(overlap-gene)和內(nèi)①一個(gè)完全在另一個(gè)內(nèi)部如：B和A＊E和D內(nèi)部分一個(gè)堿基在這 一個(gè)特定的外顯子可能選擇性地與不同的外顯子連接形成信使RNA第6節(jié) 細(xì)菌的組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈聚集在一起，形成一個(gè)較為致密的區(qū)域，稱為類核（nuleoid）。類核無核膜與胞A超螺旋。Fig.TypicalbacterialE.coligenomeisasingledouble-strandedDNAmoleculeof1.6ButE.coliisonly~2minDNAis~1000largerthanthesizeoftheThisisachievedbysuper-coilingtheDNAgyrase旋轉(zhuǎn)酶introducesnegative-superhelicaltwistsintotheDNA. degreeofsupercoilingofthechromosomeisstrictlyregulated.( 具有子(trnascriptionaloperon)結(jié)構(gòu),其中的結(jié)構(gòu)為多順反子數(shù)個(gè)子還可以由一個(gè)共同的調(diào)節(jié)（regulatorygene）即調(diào)節(jié)子（regulon）X174D-E-J-F-G- 外殼蛋白J、F、G、組裝蛋白D裂解蛋白E.coli色氨酸子9個(gè)順反子9個(gè)酶真核很少，如18s5.8s28srRNA在大多數(shù)情況下，結(jié)構(gòu)在細(xì)菌組中都是單拷貝。細(xì)菌組編碼順序一般不會(huì)，和組不同的在DNA分子中具有各種功能的識(shí)別區(qū)域如起始區(qū)OriC，終止區(qū)TerC,轉(zhuǎn)在或子的終末往往具有特殊的終止順序,它可使轉(zhuǎn)錄終止和RNA聚合酶從DNA鏈上脫落。例如大腸桿菌色氨酸子后尾含有40bp的GC豐富區(qū)，其后ProkaryoticDNAiscompacted–E.g.E.colipacks1.5mmchromosomeintoacellthatisonly1uminNohistonesornucleosomes–SmallbasicproteinsMAYserveasimilarGenesusuallydonotSingleoriginofreplication（二）質(zhì)粒指細(xì)菌 組大小約質(zhì) 、轉(zhuǎn)（一）真核（二）真核（四）葉綠 （一）真核(Eukaryoticchromosome組蛋白核小體著絲粒（centromere或中心粒)和端粒 Chromatinstructureenablesthechromosomestoaltertheircompactnessasthecellprogressthecellcycle.組蛋白 Mononucleosomestypicallyhave~200bpDNA.End-trimmingreducesthelengthofDNAfirstto~165bp,andthengeneratescoreparticleswith146bp.The10nmfiberisacontinuousstringof4.結(jié)構(gòu)的形（1）有絲中期的（二）真核組(Eukaryoticchromosomegenome結(jié)構(gòu)復(fù)雜，數(shù)龐大，具有許多起點(diǎn)，每個(gè)子大小不一斷裂（splitgene)。與間的非編碼序列為間隔DNA（spacerDNA).7）功能相關(guān)的構(gòu)成各種，可串聯(lián)在一起，也可相距很遠(yuǎn)。8）可移動(dòng)因素（geneticelement),又稱為自私（selfishDNA).真核生物組的結(jié)–編碼蛋白質(zhì)tRNA順式作用元件（cis-acting指與結(jié)構(gòu)表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序 真核生物分布在多個(gè)上，而原核生物只一個(gè)乎每一個(gè)都是完整的連續(xù)的DN段；真核生物組的起點(diǎn)多，缺少明顯的子結(jié)構(gòu)，而原核生物的組含有編碼2個(gè)細(xì)胞色

5.4—DH降解酶(ND1～6)和2線粒體是 需與 互作編碼一些遺 圖1-1線粒體DNA葉綠體組較大，在高等植物中通常為140kb第7DNA一

第8節(jié)（gene 。超（genesuperfamily)指一組由多及 。 簇(genecluster)是指中的各成員緊密成簇排列成大段的串聯(lián)重復(fù) DNA），成簇存在 概念：DNA有些高度重復(fù)DNA序列的堿基組成和浮力密度同主體DNA有 lite大DNA（macrosaliteDNA)又稱為經(jīng)典DNA。總長(zhǎng)度100kb~幾個(gè)Mb。根據(jù)順序組成。小DN（minisaliteDNA)由中等大小的串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成，總長(zhǎng)約0.1~20kb，分布在所有，往往近于端粒處。高度可變的DNA、端粒DNA（串聯(lián)的微DNA（microsaliteDNA):重復(fù)單位為1~5bp,重復(fù)次數(shù)為10~60次，總長(zhǎng)度,短散在核元件（shortinterspersednuclearelements，SINEs),主要是Alu重復(fù)序列。序列中有限制酶Alu的酶切位點(diǎn)（AGCT）而得名。重復(fù)次數(shù)30~50萬，散在分布于組中，與表達(dá)調(diào)控有關(guān)。長(zhǎng)散在核元件（longinterspersednuclearelementsLINEsKpn一、人類組的基本特點(diǎn)三、人類組計(jì)劃斷 人 A+GG+CSNP300SNP2（240 D三、人類組計(jì)劃 組計(jì)劃(HumanGenomeProject，HGP)， 年月決定出資億，用15年時(shí)間（1991—2005年）完成“人類組計(jì)劃”?！叭祟惤M計(jì)劃”是生物學(xué)有史以 年月日國(guó)家人類組研究項(xiàng)目斯博士隆由30億個(gè)堿基對(duì)（3×109bp）組成的人類組，蘊(yùn)藏著生命的奧秘?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)人類數(shù)目約為3.4萬至3.5萬個(gè)，僅比果蠅多2萬個(gè)，遠(yuǎn)小于原先10萬個(gè)2－5完成5人 斷裂構(gòu) 性種類真核生物的結(jié)、簇、DNA、分散重復(fù)DNA序列人類組計(jì)第四章DNA 第一節(jié)DNA概述第二節(jié)DNA的酶學(xué)DNA

第一節(jié)DNA概述(DNAReplication:An三、起點(diǎn)、方式和方向 DNA中含有一定起點(diǎn)和終點(diǎn)的單位。1.3萬—90萬不Aunitofthegenomeinwhich aregionfromoriginto Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNACsClCesiumchloridedensitygradientultracentrifugation（CsCl密度梯度超離心LabeledE.ColiDNAwith 三、起點(diǎn)、方向和方AllprokaryoticchromosomesandmanybacteriophageandviralDNAmoleculesarecirclesandcomprisesinglereplications.（單子）1、起點(diǎn)（origin，ori或O，原點(diǎn)）開始處DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：?jiǎn)纹瘘c(diǎn)，即——整個(gè)只有一個(gè)單位真核生物（Eukaryote）：多起點(diǎn)，即－－一個(gè)genome中有多個(gè)單位2、方向（過程的順序性 fork）：中參與的活性區(qū)域，即正在發(fā)生眼 真核生物的多 多個(gè)（1）單雙向取決于起點(diǎn)處有一個(gè)還是兩個(gè)（2）的多模多起點(diǎn)、單方向（真核多起點(diǎn)、雙方向（真核3、方從新起始（denovoinitiation）或叉式（replicationfork置換式（Discementform）又稱D circle從新起始（denovoinitiation）或叉式（replicationfork）或θAreplicationeyeformsathetastructureincircular置換 form，又稱D線粒體和葉綠體DNA的方共價(jià)延伸方（covalenceelongation）或滾環(huán)式 （rollingcirclereplication）由于時(shí)產(chǎn)生的滾環(huán)結(jié)構(gòu)形狀象σ，又稱σ 1968年（ReijiOkazaki）設(shè)計(jì)了兩組實(shí)驗(yàn)，其一是脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)experiment了研究在脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中所發(fā)現(xiàn)的10－20s的小片段在全過程中的發(fā)展結(jié)局，將實(shí)驗(yàn)菌株先進(jìn)行同位素標(biāo)記培養(yǎng)30秒，然后轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)分為此將DNA的這種方式稱為不連續(xù)模式，將最初合成的10－20s片段稱如果兩條極性單鏈的DNA均按這種不連續(xù)的模式進(jìn)行，后隨鏈的合成可以在模板單鏈到1000－2000核苷酸長(zhǎng)度后，開始從5’→3’合成片段，而先導(dǎo)鏈的合成從進(jìn)化的原則講，大可不必按片段的模式不斷地啟動(dòng)小片段的合成，既耗時(shí)又費(fèi)能。換言之,DNA的應(yīng)該是按一種半不連續(xù)的方式進(jìn)行，即先導(dǎo)鏈以連續(xù)的方式完成子代DNA的合成，而后隨鏈以不連續(xù)的方式完成OkazakiDNA全部為小片DNAIIIdUMPDNA分子中，必然會(huì)導(dǎo)致生物的表達(dá)與進(jìn)化過程中的潛在，實(shí)際上E.coli依靠了兩種機(jī)制了dUMP摻入到DNA分子的過程。由dut編碼的dUTP酶（dUTPase）能有效dUTPdUDdUTPasedUTP1／1200dUTP分子的DNA分子中的dUMP切除，形成一個(gè)無嘌呤或嘧啶的Ap位點(diǎn)（apurinicapyrimidinic鏈為模板重新聚合和連接，完成切補(bǔ)修復(fù)過程.1200dUMP被切除的dutungdut－突變體的脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，由由于已摻入的dUMP被切除的幾率降低，片段變長(zhǎng)。選用連接酶突變體第二節(jié)DNA的酶學(xué) ofDNA底物： 模板（temte):解開成單鏈的DNA母鏈引物（primer):寡核苷酸片段,3’-OH末端,dNTP其它酶和蛋白質(zhì)因子:合酶（DNA DNApolymerase）或DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（DNA-directedDNA (一)DNA聚合酶催化的反應(yīng)(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+2、3’－5’ 校對(duì)功能 KornbergInfact,thereare5polymerasestodate,althoughwewillfocusonlyonDNApolDNApolDNApolDNAPolymeraseDNAPolymeraseDNApolⅡ：5`3`聚合酶活性及3`5`:–α5`3` DNApolⅢ是主要 為什么子鏈DNA延伸方向只能是5’(一)模板對(duì)的指導(dǎo)作用在于堿基的準(zhǔn)確配對(duì)，而堿基卻埋在雙螺旋的內(nèi)部。只有相關(guān)蛋白的：dnaA、dnaB、dnaC……dna相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)：DnaA、DnaB、DnaCDnaXDnaA：辨認(rèn)起始位點(diǎn)DnaBDnaC：輔助解螺旋酶使其在起始點(diǎn)上(二DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I（topoI）拓?fù)洚悩?gòu)酶II（topo(三)單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB):表4參與DNA的酶及蛋白DNADNADNA合成RNA引物DNA

1、基本概 DNA子體時(shí)3、起點(diǎn)：結(jié)構(gòu)特方向：叉眼單雙向的決定條件的多模式D環(huán)（置換式4、酶三種 聚合活 外切活 5、DNA的半不連續(xù)實(shí) 先導(dǎo) 后隨BacterialDNATerminationofDNAStudysystem:theE.colioriginlocusoriCisclonedinto smidstoproducemoreeasilystudiedminichromosomes.Initiationisdividedintothefollowing–1.recognitionoftheorigin（識(shí)別原點(diǎn)–2.separationofparentalstrandsandstabilizationofsinglestrands（分開雙 HowdoweknowthatthereisonlyoneoriginofreplicationinE.假定每個(gè)都在同樣的一個(gè)起始點(diǎn)（i）開始，那么距i近的將先被而得多些，遠(yuǎn)離i的將得少些。因此在一個(gè)群體中離i點(diǎn)越近的出現(xiàn)頻率越高。假如–雙向的，頻率以i為中心呈雙向梯HowdoweknowthatthereisonlyoneoriginofreplicationinE.測(cè)定了大腸桿菌上很多的頻率，發(fā)現(xiàn)以O(shè)riC附近為WhatdoesthisexperimentThereisasingleceonthechromosomewherereplicationReplicationproceedsinbothThetworeplicationforksmeetatnear31’onthegeneticmapThestructureofOriCHowisreplicationDnaAproteinbindsto9-mers9nt聚合體DnaAtogetherwithHUdenaturetheDnaBhelicasebindstheopenInitiationofDNAreplicationinE.AlongwiththeHUprotein,thednaAprotein-ATPcomplexbindstothe passingthefournine-mers.Inall,thiscomplexcoversabout200bp.（隨同HU蛋白一起，dnaAprotein-ATP復(fù)合體結(jié)合到DNA上，包圍4Opencomplex（開放復(fù)合體）和Preprimingcomplex(前復(fù)合體ATP這時(shí)DnaB和DnaC蛋白進(jìn)入DNA的熔解區(qū)與OriC結(jié)合形成前復(fù)SeparatedstrandsintheoriCregionarepreventedfromreannealingbythebindingofsingle-strandedbindingprotein(SSBprotein).TheprimosomecomplexAhelicase(DnaB)beginstounwindtheSSBbindstopreventGyraserelievesthetension.PrimasesynthesizesashortstrandofPrimasebindstodnaBproteinatoriCandformsaprimosome體Let’sreviewtherolesofthemajorDnaA-RecognizesoriginanddenaturestheDnaB-HelicasethatunwindstheDnaC-RequiredforDnaBHU-histone-likeproteinstimulatesPrimase(DnaG)SynthesizesRNASSB-SinglestrandedDNAbindingRNApolymeraseFacilitatesDnaADNAgyraseRelievestorsionalDammethylaseMethylatesGATCsequencesatReviewInitiationofDNAreplicationinE.oriCcontainsfour9bpbindingsitesfortheinitiatorproteinDnaA.SynthesisofDnaAiscoupled聯(lián)系togrowthratesothatinitiationofreplicationisalsocoupledtogrowthrate.DnaAformsacomplexof30-40molecules,facilitatingmelting解鏈ofthree13bpAT-richrepeatsequenceforDnaBbinding.DnaBisahelicasethatusetheenergyofATPhydrolysis水解tofurthermeltthedouble-strandedDNA.SSB(single-strandedbindingprotein)coatstheunwindedDNAtopreventDNArenaturing.DNAprimaseloadtosynthesizesashortRNAprimerforsynthesisoftheleadingstrand.Primosome(體):DnaBhelicaseandDNAElongationinvolvesanothercomplexofproteinscalledtheREPLISOME(體，顆粒).Itisassembledfromitscomponentseachtimereplicationoccurs.E.colireplicationmachinery(Elongationphase)HelicaseunwindDNAatreplicationforkinareactioncoupledtoATPSingle-strandedDNAbindingproteins(ssb)bindandstabilizetheDNAinasingle-strandedconformationaftermeltingbyhelicasesPrimosomesynthesizesRNAprimersonlaggingDNAPolIIIthetrueE.coliDNATopoisomerase–relaxessupercoiledDNAthatformsaheadofreplication–decatenatesthefullyreplicatedDNAPolIrecesRNAprimerswithDNAbynick- joinsOkazakiConcurrentDNABothstrandsreplicatesimultaneouslyatthesamereplicationThelaggingtemtestrandisloopedtoinvertthephysicaldirectionofsynthesis,butnotthechemicaldirectionDNApolymeraseIIIfunctionsasadimer,witheachcoreenzymeachievingsynthesisononeortheotherstrandIfthepolymerasecomplexismovingcontinuouslyalongtheleadingstrand,howdoesitdiscontinuouslysynthesizeDNAalongthelaggingstrandintheoppositedirection??TerminationofDNASpecificterminationsitesofDNAreplicationexistinE.Terminationinvolvesthebindingofthetusgeneproduct(tusprotein)--terbindingprotein,aninhibitoroftheDnaBhelicase（終止位點(diǎn)結(jié)合蛋白，ThisterbindingproteinmayacttopreventhelicasefromunwindingDNA(willthereforehalt停止polIIIandpolIaction).DNAreplicationproducestwointerlockingrings（連環(huán)）whichmustThisis plishedviatheenzymetopoisomerase.TerminationofE.coliDNAreplicationTrapthereplicationforks（使叉受到限制Containsequencesthatfacilitatedecate-nationandpartitioningof<300SummaryofstepsinE.coliDNAdnaAproteinmeltsduplexinoriCdnaB(helicase),alongwithdnaCandATPbindstoreplicationfork(dnaCproteinexits).(Pre-primingcomplex)Singlestrandbindingprotein(ssbprotein)bindstoseparatedstrandsofDNAandpreventsreannealing.Primasecomplexeswithhelicase,createsRNAprimers(pppAC(N)7-10)onthestrandsoftheopenduplex2(Primase+helicaseconstitutetheAftermakingtheRNAprimers,DNApolIIIholoenzymecomesinandextendstheRNAprimer(layingdowndNTP's)ontheleadingstrand.4.Asthereplicationforkopensup(viahelicase+ATPaction)leadingstrandsynthesisisanuninterrupted不間斷的process,thelaggingstrandexperiencesagap.ThegapregionofthelaggingstrandcanwindaroundoneactivesiteunitofthePolIIIcomplex,andboundPrimaseinitiatesanRNAprimerinthegapregion.Onthelaggingstrand,PolIIIextendstheRNAprimerwithdNTP‘sasthelaggingtemtestrandisloopedthroughthePolIIIcomplex. Aftersynthesisofanascent初始fragmentthelaggingstrandloopisreleasedandthesinglestrandregionfurtherupnearthereplicationforkissubsequentlyloopedthroughthePolIIIcomplex.Steps7-9areMeanwhile其間,PolIremovestheRNAprimerregionsoftheOkazakifragmentsvia5to3'exonucleaseactivitynicktranslationPolIexitsandligasejointstheDNAfragments(onlaggingstrand).EukaryoticDNAcellnuclearomereYeast(Saccharomycescerevisiae酵母:hasmuchsmallergenome(1.4X107bpin16chromosomes)andonly400replicons.SV40(simian 40猿猴40,5kb):isgoodm lianmodelsforreplicationfork.Cell-extract無細(xì)胞提取物preparedfromXenopuslaevis(非洲爪蟾)eggscontaininghighconcentrationofreplicationproteinsandcansupportinvitroreplication.cellcycle——細(xì)胞從一次有絲結(jié)束到下一次有絲完成所經(jīng)歷間期(interphaseG1phase，Sphase，G2phase，細(xì)胞可由G1期進(jìn)入一Mphase:有絲期(Mitosis),胞質(zhì)期細(xì)胞周期是通過多種蛋白激酶復(fù)合物催化的蛋白磷酸化來實(shí)施調(diào)控圖Cyclin-dependentkinase(Cdk)OriginsandARS（自主序列Licensingfactorcontrolseukaryoticreplication（特許因子）DifferencesinDNAbetweeneukaryotesandprokaryotesEukaryoticgenomesaremuchReplicationineukaryotesoccursduringasmallportionofthecellDNAineukaryotesisboundbyEukaryoticchromosomesare圖MultipleReplicationOnlyonceinonecellcycle(每個(gè)細(xì)胞周期只有一次Clustersofabout20-50replicons(子) initiatesimultaneouslyatdefinedtimesthroughoutS-phase（20-50個(gè)子在S期同時(shí)起始）Initiationofeachrepliconwithinaninitiationzonemayoccurat不同區(qū)域的染色質(zhì)起始的時(shí)間不同EarlyS-phaseeuchromatin常染色質(zhì)LateS-phaseheterochromatin異染色質(zhì)Centromeric(著絲粒的)and omeric(端粒的)DNAreplicateatlastYeastorigin:theminimal11bpBoundbyoriginrecognitioncomplex(ORC起始識(shí)別復(fù)合體)activated激活byCDK.ARS:AutonomouslyReplicatingSequence（自主序列）。單細(xì)胞酵母的起點(diǎn)克隆進(jìn)原核生物的質(zhì)粒，由于這些起點(diǎn)序列允許質(zhì)粒在酵母中而被稱之為ARS。TheyeastLicensingfactorcontrolseukaryoticreplication（特許因子控制真核生物DNALicensingfactorcontrolseukaryoticrereplicationDNAThemachineryof–AdditionalfeaturesofeurkaryoticOnereplicationpercycle–Theoriginofreplication–passagethroughaseriesof?Originofreplicationboundby?Licensingfactorsbindassembletheprereplication?Licensingfactors–atleastsix–Mcm2-?Mcmproteinsmovewiththereplication?McmproteinsarethendiscedfromDNAbutremainin?Mcmproteinscannotreassociatewithanoriginofreplicationwhichhasalready‘fired’replicatonThemachineryofAdditionalfeaturesofeurkaryoticNucleosomesandthereplication–Histones–H3H4tetramers四聚體remainintactandaredistributedbetweenthedaughterduplexes–OldandnewH3H4tetramersfoundoneach–H2A/H2Bdimers–separateandbindrandomlytoH3H4tetramersalreadyinceReplicationof Whathappenstothenucleosomewhenthereplication replicationmachinery andopenuptheDNAdoublestrand?Nucleosomesarefoundproperlyspacedonboth strandsimmedia yafterpassageofreplicationfork.圖Amodelfornucleosome圖AmodelfornucleosomereplicationNucleosomeandReplicationforkNewnucleosomesareassembledtoDNAfromamixtureofoldandnewlysynthesizedhistonesaftertheforkpasses.EukaryoticDNADNAsynthesisisverysimilarinprokaryotesandManyofthesameenzymeactivitiesareNuclearMatrix（核基質(zhì)Nuclearmatrix:Replicationisspatiallyorganizedbyaproteinscaffoldofinsoluble不溶的proteinfibers.Replicationfactoriesareimmobilized固定onthismatrixandtheDNAmovesthroughthem.Ascaffoldofinsolubleproteinfiberswhichactsasanorganizationalframeworkfornuclearprocessing,includingDNAreplication,omerereplication——TheproblemoflinearomereSolvingtheproblemoflaggingstrand--ChromosomalendsRegulation0fDNA大腸桿菌DNA的調(diào)大腸桿菌DNA的調(diào)–起始物位點(diǎn)編碼調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，起點(diǎn)與調(diào)節(jié)蛋白作用啟動(dòng)–編碼的調(diào)節(jié)蛋白通過與復(fù)合物的相互作用確定起始頻率和方式。細(xì)胞生活周期水平調(diào)控：限制點(diǎn)調(diào)控，真核細(xì)胞DNA的發(fā)生是起始調(diào)控，如酵母起始受時(shí)序調(diào)控。BacterialDNA–TerminationofDNAEukaryoticDNA–cell omereDNA聚合酶DNA聚合酶核酸酶DNA聚合酶快慢Regulation0fDNA Chapter DNAdamageand教學(xué)要求DNADNA(5.1.1Thereasonsof5.1.2Typesof5.1.3Mutagens誘變劑5.1.4mutagenesis誘變Mutation(突變）=Permanent,heritableal tionsinthebasesequenceofaDNAThereasonsofSpontaneouserrors(自發(fā)性錯(cuò)誤):inDNAreplicationor Mutagen(誘變物): AconsequenceofthedamagingeffectsofphysicalorchemicalmutagensonDNAMutagen=mutationcausingEssentiallyallmutagensare 物MostcarcinogensareTypesof)-InvolvelargeregionsofDNAPointmutations（點(diǎn)突變-Involveonlyoneor few-AriseduringDNATypesofpointmutations ABCDEEF ABCD-F Typesofpointmutations 堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸序列的改變Nonsensemutation（無義突變）: 為蛋白質(zhì)合成的終止子(stopcodon，TAG,TAA,TGA)。 effect(silentmutation沉默突變)Readingframe（閱讀框）isoneofthethreepossiblewaysinwhichanmRNAsequenceofnucleotidescanbereadasaseriesofbasetriplets三個(gè)一組tospecifytheaminoacidsinaproteinchain.ORFopenreadingframe開放性閱讀框fromstartcodontostopWhatisthefirstdefenseagainstOntheonehand,theactualerrorrateofthepolymerase,beforeediting,isoftheorderof0.1%to1.0%.However,theoverallerrorrateforDNAreplicationis1errorin109to1010baseThisphenomenalfidelityisachievedinthreeways.Replicationfidelity（的保真度）First,Watson-CrickbaseSecond,DNApolymeraseshavetheabilitytoedit("proofread")theirwork(3’to5’exonucleaseactivityofthepolymerases).Third,post-replicationrepairofDNA（mismatch(High-energyionizingradiation(電離輻射）: X-raysandγ-raysstrandbreaks（斷鏈），base/sugardestruction（堿基/核糖損傷）Nonionizingradiation（非電離輻射）UVlightpyrimidinedimers（嘧啶二聚體 ogs（堿基類似物）mispair，direct deaminatesCto (Directmutagenesis直接誘變)resultsfromthepresenceofstableunrepairedbasewithalteredbasepairingpropertiesintheDNA.Indirectmutagenesis()Themutationisintroducedasaresultofanerror-pronerepair（傾向差錯(cuò)的修復(fù)）. 損傷)DNAsynthesisInsertionofbasesoppositeunrepairedlesionregardlessoftheoriginalsequence（不顧原始序列如何，在未修復(fù)的損傷序列對(duì)面插入堿基--tomaintaintheDNAintegritybutnotthesequenceaccuracy（只保證DNA序列的完整性，不保證序列的精確性）.DNA bulkyadductsDNAlesions(DNA損傷）：Anal theDNA（DNA正常的化學(xué)或物理結(jié)構(gòu)的改變）Alkylation烷基化作用Bulkyadducts聚化加合物Bulkylesionssuchaspyrimidinedimersandarylating芳基化agentadductsdistortthedoublehelixandcauselocalized局部denaturation.ThisdisruptsthenormalfunctioningoftheDNA.鍵，然后，又由3’-5’校對(duì)功能而將之水解。如此反復(fù)發(fā)生，而產(chǎn)生了一個(gè)空耗由于蛋白質(zhì)仍在不斷合成，而DNA不能，細(xì)胞也就不能，結(jié)果出現(xiàn)細(xì)絲狀的所謂蛇形細(xì)胞，最后導(dǎo)致細(xì)胞。Direct(Exisionrepair切除修復(fù)Mismatchrepair錯(cuò)配修復(fù)Post-ReplicationRepair 后修復(fù)binationalrepair（重組修復(fù)SOSPhotoreactivation(活 E.coliPhotoreactivationofThymineProcessiscatalyzedinaprocesssimilartophotosynthesisharvestingenergyfromHumancellsdonotcontain(AlkylationofDNACanblockDNAreplicationbecauseofmodifiedbasesthatareSometimeusedinchemotherapy（化學(xué)療法）toblockcellUsuallypurinesarealteredspectrumofproductsMosthighlymutagenicoftheseGuanine→O6–alkyl替換為烷基轉(zhuǎn)移酶特異性地轉(zhuǎn)移O6–甲基鳥嘌呤或O6–乙基鳥嘌呤上的甲基或乙團(tuán)Exisionrepair切除修復(fù)–NucleotideExcisionRepair（NER，核苷酸切除修復(fù) E.coliendonuclease Uracil-DNANglycosylaseIsaubiquitousmechanismrepairingavarietyoflesions.是修復(fù)多種損傷的普遍性機(jī) 核苷酸切除修復(fù)—ExcisionrepairsystemsinEuvrA和uvrB發(fā)現(xiàn)二聚體后，uvrA解離，uvrCuvrB和uvrCDNA被DNA螺旋酶(uvrD)DNADNAI和連接酶填補(bǔ)）核苷酸切除修復(fù)ExcisionrepairsystemsineukaryotesNucleotideexcisionrepairBaseexcisionrepairBER,堿基切除修復(fù)Mismatchrepair錯(cuò)配修復(fù)OccursjustafterMustdistinguishtheparentfromthedaughterbinational（重組修復(fù)PresentinprokaryoticandeukaryoticOnlypoorlyWeknowitexistsbecauseUvrA-andRecA-cellsaremuchmoresensitivetoUVthancellscontainingonlyonemutation.binationalDependsonRecAproteinimportantfor binationandrepair;itcatalyzesstrandSOSrepair（SOS修復(fù)UVreactivation（紫外激活反應(yīng)）Wreactivation（W激活反應(yīng)50年代J.Weigle發(fā)現(xiàn)，用經(jīng)紫外線照射后的噬菌體用低劑量UV照射過的大腸桿菌時(shí)，噬菌體的存活率比未用低劑量UV照射的大腸桿菌明顯增加，突（W激活反應(yīng)）TheincreasedsurvivalintheUVirradiatedhostisduetotheinductionoftheSOS-repairsysteminthehost.（存活率上升是由于紫外線照射引起了寄主SOS修復(fù)Metabolicsystemthathelpsthecellsurviveinperiodsofpotentiallylethalstresses（在UVirradiation（紫外照射TreatmentwithDNAmodifyingenzymes（DNA修飾酶處理Inactivationofgenesessentialtoreplication（DNA必須的失活SOSrepairDiseasescausedbydefectsinRecQhelicasegenesWernersyndromeprematureaging過早衰老beginningin20’slifeexp.Predisposition易患病的體質(zhì)tomalignanciesDiseasescausedbydefectsinRecQhelicasegenesBloomsyndromedwarfismimmunedeficiencybutterflyrash皮疹sunpredispositiontomalignanciesofalltypes(uptohighsisterchromatidexchange,other DiseasescausedbydefectsinRecQhelicasegenesRothmund-Thomsonsyndromeskin,skeletalabnormalities骨骼畸形sunPredisposition易患病體質(zhì)to somaticwholechromosomeaneuploidyDNA是遺傳信息的載體，它需要有極高的保真度，這不僅依賴于 –Exisionrepair切除修復(fù)( binationalrepair（重組修復(fù)第6章RNA細(xì)菌的轉(zhuǎn) 1956年E.Volkin和 這種“信使”Jacob和Monod將它定名為:信使RNAMessengerRNA)或mRNA1. 1963J.Marmur和DotySpiegelnan區(qū)分有義鏈。采用枯草桿菌的SP8SP8DNA雙鏈有“輕”、“重”’-利用這個(gè)差別以14C來標(biāo)記U,在0C培養(yǎng)E.coli6.1.4RNA合成和DNA的區(qū)轉(zhuǎn)錄的底物是rNTP，的底物是細(xì)菌的轉(zhuǎn)1.全酶(HoloEnzyme)和酶(Core(1)全酶（Holo依靠空間結(jié)構(gòu)與DNA模板結(jié)合(σ 半衰期：數(shù)小時(shí) 轉(zhuǎn)錄效率低，速度緩慢（σ的結(jié)合（2）酶（Core作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過程（終止依靠靜電引力與DNA模板結(jié)合（蛋白質(zhì)中堿性基團(tuán)與DNA半衰期：60 RNApolcoreσ Enzyme識(shí)別啟動(dòng)子的 tamaBox(－35區(qū)), ?酶的組建因促使RNApol與DNAEditing(排斥與模板鏈不互補(bǔ)的堿基與Rho（ρ）因子競(jìng)爭(zhēng)RNA構(gòu)成Holoenzyme后,β因子含有兩個(gè)位點(diǎn)Isite siteRifs):該位點(diǎn)專一性地結(jié)合(Esite(elongationsiteRifR):對(duì)NTP非專一性地結(jié)合（催化作用和Editing功能β’ 有義DNA鏈結(jié)合位點(diǎn)（β’亞基提供雙鏈DNA解鏈位點(diǎn)（α亞基提供原核生物RNApolCore)RNApol物的區(qū)域，它還包括一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結(jié)合位點(diǎn)。CAP-cAMP（表達(dá)調(diào)控的正控制位點(diǎn)CAP（catabolitegeneActivatorProtein）降解物活化蛋白，環(huán)腺苷RNApol的進(jìn)入（結(jié)合） 2、RNA聚合酶的進(jìn)入位點(diǎn)（1）tama框（tama Pribonow框（Pribonow-10序列，RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)——結(jié)合位點(diǎn)（B位點(diǎn)一致序列 4轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)一、終止子的種類1ρ因子的終止子(內(nèi)在終止子)1ρ因子的終止子(強(qiáng)終止子結(jié)構(gòu)特征?發(fā)夾結(jié)構(gòu)的突變可轉(zhuǎn)錄的終 二是6~8個(gè)連續(xù)的U串(發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端2ρ結(jié) IR序列中的G／C對(duì)含量較 造成高度延宕（典型的有60秒左右RNApol6~8個(gè)連續(xù)的U串可能為RNApol與模板的RNA－DNA之間的rU－dA結(jié)合力較弱于是：RNA－DNA解離 三元復(fù)合體RNApolU2ρ通讀（readthrough）：ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止過程中，RNApolIR序列之后，雖發(fā)生一定時(shí)間的延宕，但如果沒有ρ因子存在，則RNApol會(huì)繼續(xù)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄終止的活性，NTPasea、ρ因子與RNA結(jié)合（終止子上游的某一處，RNA的5’c、ρRNApolRNAPol轉(zhuǎn)錄ρ因子跟在RNAPol后沿RNA轉(zhuǎn)錄終止,釋放出RNAPolρ子和RNADNARNA值，才能配合ρ因子與RNApol的作用序列不同的終止子→不同的終止程度 編碼鏈 轉(zhuǎn)錄方向都是5’→（1）全酶（2）酶(coreα2ββ’DNA啟動(dòng)子概念原核生物啟動(dòng)子的特點(diǎn)②-10bp處-TATAAT- ③-35bp處- (tama封閉的酶-啟動(dòng)子二元復(fù)合物（closedbinary開放的啟動(dòng)子二元復(fù)合體（openedbinarycomplex）真核生物的6.3.1真核生物的RNApolⅠ核 活性所占比例最大轉(zhuǎn)錄rRNA（6.8S、18S、RNApolhnRNA、snRNAhnRNA（mRNA前體，核不均一 heterogeneousnuclearsnRNA（核內(nèi)小分子RNA，small 表6-2真核生物的三種RNA 28S,18S,6.8S感 表6-34RNApol分子量500KDa,7~12大亞基中有C末端結(jié)構(gòu)域(carboxy C端重復(fù)七肽，不同生物中重復(fù)數(shù)目不一樣（酶活性RNApol→三種啟動(dòng)子→三類，Ⅰ Ⅱ Ⅲ1、RNApolⅡ的啟動(dòng)子——2、RNApolⅠ的啟動(dòng)子——3、RNApolⅢ的啟動(dòng)子——位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游,通用型啟動(dòng)子（無組織特異性siteTATA框（HognessGoldberg-Hogness框位于－30一致序列為定位轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的功 CAAT框（CAAT增強(qiáng)子GC（GC序列為八聚核苷酸元件（octamerelementOCT元件） B元 一致序列為 一致序列為,啟動(dòng)子（corepromoter）或元件（coreelement），位于-45到+20，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn),可增 5SRNAtRNAb、上游啟動(dòng) 最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾的5S★非洲爪蟾的細(xì)胞提取液作為體外轉(zhuǎn)錄體系，進(jìn)行缺失試★以不同長(zhǎng)度的5SrRNA為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。結(jié)果★5SrRNA的啟動(dòng)子位于內(nèi)第一類：含A框和C框（5SrRNA）第二類：含A框和B框（tRNA、VARNA）?RNApol圖6-23真核RNAPolⅢ的內(nèi)啟動(dòng)子和外啟動(dòng)

?轉(zhuǎn)錄起始過程需要很多的輔助因子(轉(zhuǎn)錄因子)參與, 成復(fù)合物，協(xié)助RNApol定位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。RNApolⅡ的轉(zhuǎn)錄起始RNARNApol單制

需要二種輔助因子：UBF1、表6-6RNApol TBPRNApol的轉(zhuǎn)錄起始都需要RNApolⅠ的轉(zhuǎn)錄起始過程中,TBP是SL1的組份，起定位RNApolⅠ的作RNApolⅡ的轉(zhuǎn)錄起始由TBP識(shí)別TATARNApolⅢ的轉(zhuǎn)錄起始過程中,TBP起定位RNApol TBP起定位作用,所以又稱定位因子 Transcription1、起始時(shí)，σ因子有利于ββDNA專一性結(jié)合所要求的構(gòu)起始后,σ因子解離,ββ’2、Euk.多種輔助因子的共同作用來保證這一轉(zhuǎn)變二、延伸過程RNANTP不斷加到RNA3’-OH★形成一個(gè)磷酸二酯鍵后，酶向前滑?1RNApol結(jié)合和轉(zhuǎn)錄的DNA模板區(qū)域，有17bp胰臟RNAase——其長(zhǎng)度10bp（確2 拓?fù)鋵W(xué)問RNApolRNApol…..DNAΦ超纏問題的解決靠DNA旋轉(zhuǎn)酶ΦRNA-DNA3RNA30~50個(gè)核苷酸／秒,與蛋白質(zhì)的合成速度相近（15模板DNA中G／C（G／C8~10）轉(zhuǎn)錄的終止 RNAProk.和Euk.都具有－－一種表達(dá)調(diào)控了解很少（3’末端） 發(fā)夾結(jié) 2RNApolⅢ的終止子類似原核生物（發(fā)夾結(jié)構(gòu)U串且保守性很強(qiáng)（酵母→人1、真核生物RNApol：3、RNApolI第6章RNA細(xì)菌的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄后的加工(posttranscriptional是指將各種前體RNA分子加工成成各種RNA。加工（processing）有三種形式表6-10RNA加工反應(yīng)的分類一.原核的tRNArRNA的加工tRNArRNAtRNA①串聯(lián)的tRNA分子都是相同的，如在27’的tRNATyr-少數(shù)的tRNA前體為單順反子圖6tRNA去尾，形成3’-OH末端；RNaseF，RNaseD(4tu),D臂的2甲基鳥苷(2mG)，TψC臂的假尿苷(ψ)和反子環(huán)上的2異戊腺苷(2ipA)圖6-三種tRNA前體的剪切圖6tRNArRNA在E.coli中rRNA有7個(gè)轉(zhuǎn)錄單位,名為rrnA-rRNA序列是保守的,每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位都含有等比例的16S、23S、5SRNA及一個(gè)或幾個(gè)tRNA每個(gè)轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄成單個(gè)的RNA前體分子，經(jīng)剪切后變成為成RNA的分子rRNA前體的加工是由RNase(一)tRNA真核tRNA的和原核不同 簇排列，間有間隔區(qū) 真核tRNA一般都比原核tRNA得多，如酵母約有400個(gè)tRNA③)都要加CCA酵母tRNA在未處理前先進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果只顯示一條帶，且跑得較慢，表明此為tRNA圖6-酵母tRNA在體外的剪切真核tRNA內(nèi)含子切除的特點(diǎn) 沒有交界序列，也沒有內(nèi)部引導(dǎo)序列；酵母tRNA前體內(nèi)含子3’和5’端的剪切是由內(nèi)切酶的不同亞基催化的。亞基Sen34,真核tRNA的加工和原核的區(qū) 真核tRNA 真核生物的18S，5.8S和28SrRNA 體，5SRNA是和它們分開轉(zhuǎn)錄的，這和原核的rRNA不同。切除5′端的前導(dǎo)序列,即外部的轉(zhuǎn)錄間隔序列轉(zhuǎn)錄間隔序列（ITS），產(chǎn)物分別為20S（含18SrRN段）和32S。mRNA個(gè)單個(gè)的多順反子mRNA，然后經(jīng)RNaseⅢ將其切開，四個(gè)兩兩分開，最后再各自進(jìn)行E.coli90’/100’T7噬菌體早期區(qū)轉(zhuǎn)錄單條前體RNA，經(jīng)RNaseⅢ剪切成5條成RNaseⅢ在T7莖環(huán)上的典型切割位點(diǎn)(GENESVIFig 、真核mRNA前體的加(一)核內(nèi)不均一RNA（heterogenousnuclear 3′端有poly（A）尾巴； (4) 莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可能分布于編碼區(qū)（非重復(fù)序列）的兩側(cè)；15′23′3如呼腸，如皰 在末端鳥苷的第7位上存在單個(gè)甲基化位點(diǎn)的稱O型帽子在次末端核苷酸的核糖上的2′-0位點(diǎn)上還有一個(gè)甲基位點(diǎn)的稱1型帽子(cap此外，在第三個(gè)核苷酸的核糖上（2′-0）有甲基化位點(diǎn)的稱2型帽子（cap2）這三種帽子都有特殊面對(duì)面核苷酸結(jié)構(gòu)（confrontdenucleotidestructure）。圖mRNA53’端約長(zhǎng)200bp(大多數(shù)Euk.的mRNA) 最近研究發(fā)現(xiàn)，原核生物的RNA轉(zhuǎn)錄后也有3’添加poly(A)E.coli的poly(A)聚合酶早 年就已發(fā)poly(A)與mRNA的有b、胚胎發(fā)育中，poly(A)mRNA（非poly(A)cpoly(A)mRNApoly(A)剪切因子(CF)AAUAAA下游11－30nt二．I類內(nèi)含子的剪接1、RNA拼接（RNA 5’拼接點(diǎn)或左拼接點(diǎn)（內(nèi)元上游1982Davies 結(jié)構(gòu)（centralcorestructure）:在有些內(nèi)元中，含有4個(gè)重復(fù)的保守序列，長(zhǎng)度為10~20bp，4個(gè)保守序列構(gòu)成一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，在拼接中起重要作用 ★Ⅰ類內(nèi)元（groupⅠ）:含有中部結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器核★Ⅱ類內(nèi)元（groupⅡ）:不含有中部結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器線粒體核★Ⅲ類內(nèi)元（groupⅢ）:具有GU－AG特征的邊界序列，核mRNA前★tRNA的內(nèi)元均位于tRNA的