過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定

過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)【目的】【目的】過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定掌握米氏方程及其意義。掌握過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)測(cè)定的原理、方法和步驟?！驹怼?/p>

1.米氏方程【原理】米氏方程：當(dāng)環(huán)境溫度、pH、酶濃度等條件恒定時(shí)，酶促反應(yīng)速度v

與底物濃度[S]的關(guān)系符合米氏方程。v

=────Vmax[S]Km

+[S]Vmax：最大反應(yīng)速度Km：米氏常數(shù)02468101214161820020406080底物濃度

[S]Vm2Km初速率

vVm動(dòng)力學(xué)曲線Km值：可通過(guò)對(duì)米氏方程作圖(V~[S]圖)求出。在數(shù)值上等于酶促反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)的底物濃度值。單位是mol/L(或mmol/L)。當(dāng)v

=──

時(shí)，Km

=

[S]Vm2以不同的底物濃度[S]為橫坐標(biāo)，[S]/v為縱坐標(biāo)，將各點(diǎn)連成一直線，并向縱軸方向延長(zhǎng)，此延長(zhǎng)線在橫軸上的截距即為–Km值。2.漢斯方程2.漢斯方程

v

=────Vmax[S]Km

+[S]在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)動(dòng)力學(xué)曲線求Km值，即使用很大的[S]，也只能得到趨近于Vm的反應(yīng)速度，難以達(dá)到真正的Vmax，因此測(cè)不到準(zhǔn)確的Km值。為得到準(zhǔn)確的Km值，可以把米氏方程轉(zhuǎn)化為

y

=

ax

+

b

的直線方程，然后用圖解法求出Km值。本實(shí)驗(yàn)采用漢斯作圖法(HanesPlot)求Km值。將米氏方程兩邊取倒數(shù)再乘以[S]即為漢斯方程：(漢斯方程式)──=──

.[S]+──1Vm[S]vKmVm方程式兩邊取倒數(shù)再乘以[S]漢斯方程作圖──[S]v1斜率=

──Vm0[S]Km──Vm–Km3.鼠肝過(guò)氧化氫酶測(cè)定化學(xué)反應(yīng)原理本實(shí)驗(yàn)以鼠肝勻漿中的過(guò)氧化氫酶為例，測(cè)定其Km值和Vm值。2H2O22H2O+O2過(guò)氧化氫酶2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+5O2↑+8H2O過(guò)氧化氫酶催化H2O2分解成H2O和O2；反應(yīng)后剩余的H2O2用KMnO4在酸性溶液中滴定；通過(guò)滴定KMnO4的消耗量求出反應(yīng)前后H2O2的濃度差即為反應(yīng)速度v；通過(guò)漢斯作圖法可求出過(guò)氧化氫酶的Km值和Vm值。說(shuō)明：KMnO4既是氧化劑，又是指示劑；Mn2+是滴定反應(yīng)的催化劑。3.鼠肝過(guò)氧化氫酶測(cè)定化學(xué)反應(yīng)原理

操作

1.肝勻漿制備【操作】1.肝勻漿制備將小白鼠處死，立即取出肝臟，去除膽囊及結(jié)締組織，用0.45％的鹽水洗凈。稱取1g肝組織加1ml0.45%鹽水放入勻漿器，研磨成勻漿。取上述勻漿，用pH7.0的磷酸緩沖液稀釋至1:10。取1:10的勻漿液1ml，用pH7.0的磷酸緩沖液稀釋定容至50ml(1:500)。取干燥的100ml錐形瓶5只，編號(hào)，按下表操作。試劑(ml)1號(hào)瓶2號(hào)瓶3號(hào)瓶4號(hào)瓶5號(hào)瓶0.04mol/LH2O2252015105H2O05101520放入37℃水浴5分鐘肝勻漿液1:50011111分別加入，準(zhǔn)確記時(shí)10分鐘10％H2SO4555550.02mol/LKMnO4滴定記錄0.02mol/LKMnO4用量2.反應(yīng)速度測(cè)定2.反應(yīng)速度測(cè)定說(shuō)明：①

試劑加量要準(zhǔn)確；每個(gè)三角瓶可分別保溫，但要準(zhǔn)確計(jì)時(shí)。10％H2SO4液可事先準(zhǔn)備好，到時(shí)直接傾入。KMnO4用量記錄精確度：0.0113.389.966.773.841.433.計(jì)算

①計(jì)算各管底物濃度試劑(ml)1號(hào)瓶2號(hào)瓶3號(hào)瓶4號(hào)瓶5號(hào)瓶0.04mol/LH2O2252015105H2O05101520放入37℃水浴5分鐘肝勻漿液1:50011111分別加入，準(zhǔn)確記時(shí)10分鐘10％H2SO4555550.02mol/LKMnO4滴定記錄0.02mol/LKMnO4用量13.389.966.773.841.43底物濃度[S](mmol/L)

反應(yīng)速度v

(mmol/10min)

[S]/v(10min/L)3.計(jì)算①按下式計(jì)算各管底物濃度(mmol/L)填入下表H2O2濃度(mmol/L)×

加入H2O2的體積(ml)26ml(反應(yīng)液總體積)[S](mmol/L)=38.46230.76920.37715.3857.692②計(jì)算各管反應(yīng)速度試劑(ml)1號(hào)瓶2號(hào)瓶3號(hào)瓶4號(hào)瓶5號(hào)瓶0.04mol/LH2O2252015105H2O05101520放入37℃水浴5分鐘肝勻漿液1:50011111分別加入，準(zhǔn)確記時(shí)10分鐘10％H2SO4555550.02mol/LKMnO4滴定記錄0.02mol/LKMnO4用量13.389.966.773.841.43底物濃度[S](mmol/L)

38.46230.76920.37715.3857.692反應(yīng)速度v

(mmol/10min)

[S]/v(10min/L)3.計(jì)算②按下式計(jì)算各管反應(yīng)速度(mmol/10min)填入下表0.3310.3020.2620.2080.129

(mmol/L)=H2O2濃度(mmol/L)×

加入H2O2的體積(L)

–KMnO4(mmol/L)×消耗的KMnO4的體積(L)×5/2③計(jì)算各管[S]/v試劑(ml)1號(hào)瓶2號(hào)瓶3號(hào)瓶4號(hào)瓶5號(hào)瓶0.04mol/LH2O2252015105H2O05101520放入37℃水浴5分鐘肝勻漿液1:50011111分別加入，準(zhǔn)確記時(shí)10分鐘10％H2SO4555550.02mol/LKMnO4滴定記錄0.02mol/LKMnO4用量13.389.966.773.841.43底物濃度[S](mmol/L)

38.46230.76920.37715.3857.692反應(yīng)速度v

(mmol/10min)

0.3310.3020.2620.2080.129[S]/v(10min/L)3.計(jì)算③計(jì)算各管[S]/v值(10min/L)填入下表116.198101.88588.24873.96459.862④漢斯作圖3.計(jì)算④漢斯方程作圖求Km值和Vm值[S]v—–=—–+—–

KmVm1Vm[S]漢斯方程：漢氏作圖–30–25–20–15–10–5

051015

2025303540[S](mmol/L)[S]/v

(10min/L)12010080604020–Km=–25y=1.8277x

+45.854—–

=46

KmVm以[S]為橫坐標(biāo)，[S]/v

為縱坐標(biāo)，制作[S]/v

~[S]坐標(biāo)圖。將測(cè)定各點(diǎn)連成一直線，并向縱軸方向延長(zhǎng)與橫軸相交，交點(diǎn)為橫截距，即–Km

?？v截距為Km/

Vm

。從坐標(biāo)圖查得–Km=–25，即：Km=25mmol/L

。從坐標(biāo)圖查得Km/Vm

=46，將Km值代入求得：Vm=0.543mmol/10min

。*Excel漢斯作圖Excel漢氏作圖-35-30-25

-20-15

-10

-50510

1520253035404520406080100120140[S](mmol/L)[S]/v

(10min/L)–Km=–25y

=1.8277x+45.854—–

=46

KmVmKm=25mmol/LVm=0.543mmol/10min*Excel雙倒數(shù)作圖

y

=45.786x+1.8311Excel雙倒數(shù)作圖-0.1-0.0500.050.10.150.21234567891/[S](L/mmol)(0,1/Vm＝1.83)(–1/Km＝–0.04,0)1/v(10min/mmol)Km=25mmol/LVm=0.546mmol/10min*Excel-Eadie-Hofstee作圖

y

=-25.051x+0.54670.10.20.30.40.50.6-0.00500.0050.010.0150.020.025v/[S](L/10min)v(mmol/10min)0.5450.0218Km=25mmol/LVm=0.545mmol/10minExcel-Eadie-Hof