熒光定量原理值

關(guān)于熒光定量原理值第1頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南第2頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析與常規(guī)PCR技術(shù)比較：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實時檢測熒光定量PCR原理－－定義第3頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

擴(kuò)增曲線熒光閾值

Ct值熒光定量PCR原理－－常用名詞概念第4頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase熒光基團(tuán)熒光檢測元件熒光定量PCR原理－－擴(kuò)增曲線第5頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）BaselineLog－linerphaseLog－linerphase

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進(jìn)入指數(shù)期的最初階段真正的信號:熒光信號超過域值Threshold熒光定量PCR原理－－熒光域值第6頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Ct值的定義：

PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Cycle（循環(huán)數(shù)）Rn（熒光強(qiáng)度）Ctvalue熒光定量PCR原理－－Ct值第7頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration

模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。熒光定量PCR原理－－Ct值與模板起始量的關(guān)系第8頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)Notemplatecontrol確認(rèn)PCR擴(kuò)增效率（E）:0.8-1.235Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用SYBR檢測方法，30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增35Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（r2）：大于0.98熒光定量PCR反應(yīng)性的確認(rèn)第9頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

定性分析研究：雜合或純合子鑒定，（SNPs）分析等

絕對定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷貝數(shù)定量，GMO定量檢測等

相對定量研究：mRNA表達(dá)量分析，siRNA效果確認(rèn)，基因芯片結(jié)果驗證，差異顯示結(jié)果驗證等熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用第10頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南第11頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月非特異性熒光標(biāo)記

SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記

TaqManProbe常用熒光標(biāo)記方法第12頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBRGreenI第13頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月熱變性引物退火延伸反應(yīng)SYBRGreenI染料法——作用機(jī)理第14頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月問題點(diǎn)：

SYBRGreenI與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將同時被檢測，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。SYBRGreenI染料法——問題點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)關(guān)鍵點(diǎn)：

設(shè)計合適引物，防止非特異性擴(kuò)增！第15頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)(-dI/dT)原始圖譜對數(shù)圖譜SYBRGreenI染料法——融解曲線第16頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確SYBRGreenI染料法——融解曲線第17頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA

使用方便，不必設(shè)計復(fù)雜探針具有價格優(yōu)勢優(yōu)點(diǎn)

容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對引物特異性要求較高不能進(jìn)行多重定量缺點(diǎn)SYBRGreenI染料法——優(yōu)缺點(diǎn)第18頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Taqman探針法——原理

5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)

探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針第19頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Taqman探針法——工作機(jī)理熱變性引物和探針與模板退火延伸反應(yīng)探針報告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探針DNA聚合酶引物RRRR第20頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月1、引物、探針的設(shè)計：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應(yīng)參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度

3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM

探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同Taqman探針法——PCR體系的建立第21頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月3’淬滅基團(tuán)淬滅基團(tuán)性質(zhì)建議使用的5’報告基團(tuán)TAMRA熒光物質(zhì)FAM,HEX,TET,JOE等Eclipse非熒光物質(zhì)FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX等Taqman探針法——熒光標(biāo)記物的選擇第22頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

高度特異性重復(fù)性好可進(jìn)行多重定量優(yōu)點(diǎn)

只適合一個特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價格較高不易找到本底低的探針缺點(diǎn)Taqman探針法——優(yōu)缺點(diǎn)第23頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月不同定量方法的比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍SYBRGreenI方法適用性廣靈敏方便便宜引物要求高易出現(xiàn)非特異性帶不能進(jìn)行多重定量適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物的研究TaqMan方法特異性高重復(fù)性好多重定量價格高只適合特定目標(biāo)病原體檢測，疾病耐藥基因研究,藥物療效考核遺傳疾病的診斷第24頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容概要

熒光定量PCR原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量產(chǎn)品選擇指南第25頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月絕對定量解析方法第26頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Sample25絕對定量的定義

Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴(kuò)增反應(yīng)存在的線性關(guān)系

根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量第27頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備PCR目的基因克隆質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒目的基因基因組DNA第28頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月拷貝數(shù)的計算：待測樣本濃度（ng/ul）＝OD260×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計算第29頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

方法：從血液中提取病毒DNA，以TaqMan探針法進(jìn)行熒光定量檢測

試劑：TIANGEN公司探針法試劑RealMasterMix（Probe）（目錄號：FP203）

標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為106、105

、104

、103

；2個重復(fù)；設(shè)陰性空白對照

實驗步驟：提取HBVDNA；設(shè)計特異引物；設(shè)計TaqMan探針并標(biāo)記探針；熒光定量擴(kuò)增；結(jié)果分析：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)。絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量第30頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD標(biāo)準(zhǔn)品5×10328.1828.6428.410.16標(biāo)準(zhǔn)品5×10425.2525.1425.190.04標(biāo)準(zhǔn)品5×10522.1122.4622.280.12標(biāo)準(zhǔn)品5×10618.6318.9218.770.10未知樣品?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實驗數(shù)據(jù)絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量第31頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月擴(kuò)增效率（E）計算

E=10-1/斜率－1=10-1/-3.17－1

=2.03－1

＝1.03標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用MeanCt作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.17x+37.52R2=0.9988絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量

相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。擴(kuò)增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。第32頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月未知樣品拷貝數(shù)的計算將Ct值帶入線性方程：20.5=-3.1726X+37.52QuantityUnknown=105.36

=229087copies絕對定量實驗例——乙肝病人血液中HBV的絕對定量X=20.5-37.52-3.1726=5.36第33頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月相對定量解析方法第34頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月理論上目的基因表達(dá)量分析條件SampleBSampleA目的基因擴(kuò)增效率相同RNA提取效率相同細(xì)胞起始數(shù)相同實際目的基因表達(dá)量分析相對定量的必要性第35頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月以上條件不可能同時得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）進(jìn)行校正，進(jìn)行相對表達(dá)量分析。第36頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月管家基因

維持細(xì)胞基本代謝活動所必須的基因,如：GAPDH、Actin、18SrRNA等篩選方法

根據(jù)文獻(xiàn)提供通過具體實驗篩選相對定量分析——管家基因篩選0123456Sample1Sample2Sample3Sample4實驗組實驗值β-ActinGAPDHβ-2-microglobulinHPRTP

P

P

O

第37頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

2-△△Ct法

相對定量分析——兩種常用的分析方法第38頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達(dá)量。

相對值=校正值=目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值對照樣品的校正值相對定量分析——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法公式：第39頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單缺點(diǎn)：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一相對定量分析——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測樣品管家基因H目的基因X定量結(jié)果定量結(jié)果校正值相對量對照樣品6391.5343.40.05371.000待測樣品18589.717.30.00200.037待測樣品27432.91946.10.26184.874實驗數(shù)據(jù)第40頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月公式：F=2－相對定量分析——2法優(yōu)點(diǎn)：無需作標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點(diǎn)：假定擴(kuò)增效率為100%；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴(kuò)增之際間的效率都保持一致；實驗條件優(yōu)化較為復(fù)雜應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一

待測組目的基因平均Ct值待測組管家基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組管家基因平均Ct值－－－－△△Ct第41頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗數(shù)據(jù)：Sample處理前處理后Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.41.951.952-

△△Ct法：假設(shè)目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%△Ct（處理前）＝18－17＝1△Ct（處理后）＝16－17.4=－1.4△△Ct=△Ct（處理后）－△Ct（處理前）＝－1.4－1＝－2.4比率（處理后/處理前）=2－△△Ct＝2－（－2.4）=5.3所以Jun基因在處理后表達(dá)水平比處理前高5.3倍修正方法：如果我們知道目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴(kuò)增效率，但擴(kuò)增效率不等于2，那么2－△△Ct可以修正為：E－△△Ct，例如擴(kuò)增效率為1.95，那么計算公式可修正為1.95－△△Ct相對定量分析——2-△△Ct法第42頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容概要

熒光定量PCR的原理熒光定量PCR的標(biāo)記方法熒光定量PCR的解析方法

SYBR法實驗流程及注意事項

TIANGEN公司熒光定量相關(guān)產(chǎn)品第43頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月SYBR法實驗流程及注意事項樣品制備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定技能要求環(huán)境要求誤差控制數(shù)據(jù)分析儀器介紹RT上機(jī)反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇分析方法第44頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月樣品制備環(huán)境要求模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析RT上機(jī)濃度確定SYBR法實驗流程及注意事項無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具高純度，濃度均一的RNA分光光度計檢測電泳檢測第45頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月RT反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析上機(jī)AMVM-MLVQuantSuper下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積選擇應(yīng)用引物高效、全長的cDNASYBR法實驗流程及注意事項第46頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月模板準(zhǔn)備引物設(shè)計濃度確定環(huán)境要求誤差控制RT樣品制備數(shù)據(jù)分析上機(jī)核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間評價引物使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（≥3次）設(shè)置空白和陰性對照均一的反應(yīng)液和模板混合物GC％：50－60％Tm：50－65℃單個堿基重復(fù)＜4個無二級結(jié)構(gòu)擴(kuò)增長度：100－200bp第47頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月反應(yīng)體系優(yōu)化上機(jī)反應(yīng)條件優(yōu)化RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析反應(yīng)體積＞5ul，推薦20－50ulMg2＋調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時間：產(chǎn)物長度決定擴(kuò)增效率：90％－110％重復(fù)性：std＜0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：R＞0.99或R2

＞0.98SYBR法實驗流程及注意事項標(biāo)準(zhǔn)品待測樣本陽性對照陰性對照第48頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月技能要求誤差控制儀器介紹上機(jī)試劑選擇RT樣品制備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析自配realmastermixRCHO-LightcyclerseriesROTOGEN-RGseriesBIO-RADOpticonseriesABI-7serie