生物材料學實驗講義

生物材料學實驗講義目錄1.天然高分子生物材料-----從牛（豬）肌腱中提取I型膠原蛋白1.1肌腱組織前處理1.2膠原蛋白提取與鹽析1.3膠原蛋白透析與冷凍干燥2.無機生物材料-----羥基磷灰石的合成和組成分析2.1羥基磷灰石原粉的濕法制備2.2羥基磷灰石陶瓷原粉的鈣、磷含量化學分析3.有機高分子生物材料-----聚乳酸的合成、多孔材料制備和體外降解實驗3.1聚乳酸的合成3.2聚乳酸支架材料的制備和密度及孔隙率測定3.3聚乳酸材料的體外降解實驗4.納米生物材料-----金納米顆粒的可控合成與表征5.生物材料儀器分析和表征實驗5.1膠原蛋白的紫外光譜分析5.2聚乳酸材料的紅外光譜分析5.3金納米溶膠的等離子體共振吸收峰測定5.4金納米溶膠的粒度分析

實驗一、從牛（豬）肌腱中提取I型膠原蛋白膠原蛋白或膠原（collagen）是一類具有生理功能的天然蛋白質，是人體重要的細胞外基質成分，約占人體總蛋白的1/3，廣泛存在于動物皮膚、肌腱和其他結締組織中。膠原蛋白是一個大的蛋白家族，至少有15個型別，目前已發(fā)現的類型已不下20種。膠原蛋白的基本結構特征是具有三股螺旋結構，每一個鏈有1050個氨基酸，一級結構富含脯氨酸和羥脯氨酸，第三個氨基酸總是甘氨酸。根據是否形成有周期性橫紋的膠原原纖維可將其分為原纖維膠原蛋白和非原纖維膠原蛋白兩大類。原纖維膠原蛋白包括I、II、III、V、XI型膠原，在體內以膠原纖維的形式存在，其中以I型膠原分布最廣、含量最多。膠原纖維與組織器官的生物力學特性密切相關，是骨骼、肌腱、骨間膜、皮膚、軟骨、韌帶等器官的基本結構物質。膠原蛋白不僅作為組織的支持物，而且對組織行使正常功能以及傷口愈合都有重要影響，且免疫原性低，近20年被廣泛用于臨床，應用于修復軟組織缺損、覆蓋燒傷創(chuàng)面、整形、牙周引導組織再生等臨床治療。本實驗從動物肌腱組織中提取I型膠原蛋白，包括肌腱組織前處理、膠原蛋白的酶法提取與鹽析、以及膠原蛋白的透析與冷凍干燥三個實驗步驟。實驗目的掌握膠原蛋白的提取方法；掌握鹽析、高速離心、透析和冷凍干燥等基本實驗操作。實驗原理膠原蛋白主要從動物（牛，豬等）皮、肌腱和鼠尾等部位提取。目前常見的膠原蛋白提取方法包括堿法、鹽法、酸法和酶法。堿法容易造成肽鍵水解和產生D,L-型氨基酸消旋混合物；鹽法提取工藝不易穩(wěn)定，而且得到的膠原分子結構與天然膠原不同；酸法使用鹽酸等強酸，在水解過程中絲氨酸和酪氨酸部分被破壞，得到的膠原結構和性質與天然膠原相同，但代謝速度更快，一般被稱為酸溶膠原；酶法水解作用條件溫和，提取的膠原蛋白純度高、水溶性好、理化性質穩(wěn)定，溶解的膠原保留了完整的螺旋區(qū)段，保持了膠原蛋白的活性，同時又減少了抗原性，提取的產品適合作為生物材料。本實驗采用酶解法提取I型膠原蛋白。膠原蛋白以多種類型雜化存在，在提取時需要進行分級和純化。目前從組織提取膠原蛋白多采用分級鹽析的方法，如在酸性條件下，I型和III型膠原沉淀的鹽濃度臨界點相近；在中性條件下，III型和IV型膠原沉淀的鹽濃度臨界點相近，因此可以通過控制酸度和鹽濃度將不同類型的膠原蛋白進行分離。膠原蛋白的活性受溫度、時間、溶劑等條件影響。為保持膠原蛋白的活性，提取時間不宜太長，盡量在低溫條件下操作，并盡可能去除鹽分和雜質。試劑和儀器試劑：牛（豬）肌腱組織均漿，胃蛋白酶，0.5mol/L醋酸溶液，去離子水，NaCl，0.01mol/LHCl,儀器：150mL錐形瓶，200目濾布，300mL燒杯，臺式離心機（10000轉），離心管，透析袋，透析袋夾，培養(yǎng)皿，冰箱，冷凍干燥機，電子天平實驗步驟1.1肌腱組織前處理(1)取牛（豬）肌腱5~7塊（~20g），剝除鞘膜，裁成小段，在100mL的1mol/LNa2CO3溶液中浸泡0.5h，用自來水沖洗數次；(2)將清洗后的肌腱組織在100mL的0.5mol/L醋酸溶液中浸泡48h使組織充分溶脹；(3)取出后用自來水沖洗至中性，再用手術剪剪碎至大約1cm×1cm小塊，置于高壓均質機中粉碎10~15min，加冰塊維持18oC，得漿狀物。1.2膠原蛋白提取與鹽析(1)將約10~15mL漿狀肌腱組織倒入250mL錐形瓶中，并加入150mL0.5mol/L含1%胃蛋白酶的冰醋酸中，磁力攪拌，維持溫度低于20℃（空調調節(jié)），貼上標簽；(2)提取48~72h，記錄提取液顏色和粘度變化情況；(3)將提取液用50~100mL0.5mol/L醋酸稀釋，用200目濾布過濾；取30mL濾液高速冷凍離心（6000或10,000r/min）15min；將上清液倒入50mL燒杯中，緩慢加入一定量的NaCl使其最終濃度為1.0mol/L，攪拌15min進行鹽析；將鹽析后的膠原混合液轉移至離心管中，高速離心（6000或10,000r/min）15min取沉淀，加入適量0.01mol/LHCl溶解鹽析后的膠原蛋白沉淀物。1.3膠原蛋白透析與冷凍干燥(1)將透析袋（截留分子量為8,000~14,000）剪出適當長度，沸水中煮5~10min，在純水中浸泡15min以上；(2)配制透析液：在1000mL燒杯中加入990mL純水和10mL1.0mol/LHCl，攪拌均勻配制成0.01mol/LHCl透析液；(3)將充分水化后的透析袋一端折疊扎緊，留出2cm以上空余部分，將膠原蛋白溶解液裝入透析袋，用0.01mol/LHCl充分轉移壁上殘留的溶解液，一并倒入透析袋中；待裝至透析袋2/3體積時另一端也留出2cm以上空余部分并扎緊，在0.01mol/LHCl透析液中透析3~5d，期間每天換透析液一次；(4)將透析后的膠原蛋白溶液高速冷凍離心（6000或10,000r/min）離心15min，上清液用純水繼續(xù)透析1~2天，倒于培養(yǎng)皿中，貼上標簽，放入-20℃冰箱冷凍過夜；(5)采用冷凍干燥得到提純后的膠原蛋白海綿；(6)膠原蛋白海綿稱重。思考題肌腱組織前處理過程中，碳酸鈉、醋酸溶液的作用分別是什么？鹽析、HCl溶解鹽析物、透析和三次離心的作用分別是什么？哪些因素會影響膠原蛋白的提取效率和純度？簡述冷凍干燥的原理。它與其他干燥手段相比突出的優(yōu)點是什么？參考文獻：[1]吳霞，曾睿，但衛(wèi)華，Ⅰ型膠原提取中的若干技術問題，皮革與化工，2010,27(5):36-39.[2]劉麗莉，馬美湖，楊協(xié)力，牛骨Ⅰ型膠原蛋白提取及結構表征，食品科學，2010,31(2):87-91.[3]劉蘇銳，王坤余，琚海燕，豬皮I型膠原蛋白的提取及其結構表征，中國皮革，2007,36(7):43-49.實驗二、羥基磷灰石的合成、組成分析和陶瓷制備羥基磷灰石（Hydroxyapatite）是脊椎動物骨骼和牙齒的重要組成成分，屬六方晶系；其化學式為Ca5(PO4)3(OH)，分子量為502.31，但通常寫為Ca10(PO4)6(OH)2，以表示單位六方晶胞中包含的鈣、磷酸根和羥基數目。其密度為3.16g·cm-3，溶解度0.4ppm（25oC，Ksp=2.34×10-59）。天然羥基磷灰石中的OH-離子可以被F-、Cl-或CO32-等離子取代。人工合成的羥基磷灰石是一種具有生物活性的生物陶瓷材料，與自然骨和牙齒等硬組織中的無機質在化學成分和晶體結構上具有相似性，材料表面的Ca2+和PO43-可以游離出來被人體組織吸收，并長出新的組織，因此羥基磷灰石生物陶瓷具有良好的骨誘導再生作用，是一類重要的骨修復材料。羥基磷灰石生物陶瓷熔點為1650oC，燒結溫度在1200-1300oC之間。本實驗包含羥基磷灰石陶瓷原粉的合成及其鈣、磷含量的化學分析兩部分內容。實驗目的掌握羥基磷灰石生物陶瓷的制備方法；掌握鈣磷化合物組成元素的化學定量分析方法。實驗原理羥基磷灰石陶瓷原粉的制備主要采用體外人工合成的方法。目前合成方法有很多種，包括沉淀法、溶膠-凝膠法、高溫固相法、水熱法和電化學沉積法等。溶膠-凝膠法試劑昂貴、產量低；高溫法、水熱法和電化學法需要特殊裝置且儀器設備昂貴；因此常用的方法為沉淀法。該法操作簡單、產量高、不需要特殊儀器設備。沉淀法以硝酸鈣和磷酸氫二銨為原料，按Ca/P=5/3的配比進行反應，用氨水調節(jié)反應體系pH值在11~12之間，反應方程式如下：(NH4)2HPO4+NH3·H2O=(NH4)3PO4+H2O3(NH4)3PO4+NH3·H2O=(NH4)10(PO4)3(OH)(NH4)10(PO4)3(OH)+5CaCl2=Ca5(PO4)3(OH)+10NH4Cl反應在室溫攪拌下進行，通過調節(jié)反應液滴加速度來控制反應速度。羥基磷灰石晶體的鈣磷比為1.67，因此在沉淀反應中，必須控制原料的鈣磷比不低于該值；同時，由于羥基磷灰石在酸性和弱堿性條件下不穩(wěn)定，還必須保證反應體系的pH值始終大于11。羥基磷灰石陶瓷原粉的鈣、磷含量，直接影響陶瓷材料的力學性能以及生物相容性。理論上，所得到的羥基磷灰石原粉的鈣、磷摩爾比應為1.67，而事實上，由于雜質、非化學計量比化合物和晶體缺陷等因素的存在，有時會導致其化學比偏離此數值，因此需通過元素分析來確定所得產物的鈣、磷含量，以判斷所得到物質的化學組成。本實驗所采用的鈣、磷元素定量分析手段為化學分析，其中磷含量的測定采用重量分析法，鈣含量的測定采用絡合滴定法。磷鉬酸喹啉重量法測定羥基磷灰石的磷含量，是采用強酸將原粉試樣中的磷酸根轉化為磷酸，磷酸和喹鉬檸酮試劑生成黃色磷鉬酸喹啉沉淀（分子量為2212.74），沉淀產物經干燥后準確稱重，由所得重量計算出P2O5的含量。沉淀反應的方程式為：Ca5(PO4)3(OH)+10HCl=5CaCl2+3H3PO4+H2OH3PO4+3C9H7N+12Na2MoO4+24HNO3=(C9H7N)3·H3PO4·12MoO3↓+24NaNO3+12H2O絡合滴定法測定羥基磷灰石的鈣含量，是在堿性條件下，采用K-B指示劑，用乙二胺四乙酸四鈉（EDTA）與鈣絡合滴定的方法確定鈣離子濃度。試劑和儀器試劑：無水CaCl2，(NH4)2HPO4，濃NH3·H2O，去離子水；1：1（體積比）鹽酸溶液，1：1（體積比）硝酸溶液，鉬酸鈉，喹啉，檸檬酸，EDTA溶液（0.03M），NH3-NH4Cl緩沖液，K-B指示劑，CaCO3基準物儀器：500mL和1000mL燒杯，500mL滴液漏斗，10mL和250mL量筒，玻璃棒，pH廣泛試紙，電子天平，不銹鋼藥匙，磁力攪拌器，鐵架臺，臺式離心機（4000轉），烘箱，馬弗爐；100mL和300mL燒杯，250mL容量瓶，25mL移液管，50mL量筒，表面皿，玻棒，坩鍋，電子天平，烘箱，電爐，干燥器實驗步驟2.1羥基磷灰石原粉的濕法制備(1)稱取(NH4)2HPO413.2g，CaCl218.8g，分別加一定量的去離子水溶解，然后將CaCl2溶液用濃NH3·H2O調pH至11~12，并稀釋到300mL；將(NH4)2HPO4溶液用濃NH3·H2O調pH至11~12，并稀釋到500mL。兩種溶液最終pH值應不小于11，且沒有沉淀產生；(2)將裝有CaCl2溶液的燒杯置于攪拌器上，(NH4)2HPO4溶液裝入滴液漏斗，固定在鐵架臺上。調節(jié)(NH4)2HPO4溶液的滴加速度（約2~3滴/s，呈連續(xù)點滴狀），同時不斷攪拌，反應2~3h，放置陳化24h；(3)去掉上清液后用去離子水、70%和100%乙醇洗滌、離心，重復操作直至上清液呈中性為止。將洗凈的反應沉淀物轉入坩堝，放入80oC烘箱中干燥；(4)將干燥后得到的疏松塊樣放入馬弗爐中于800oC下保溫3h，冷卻后稱重，粉碎，過200目篩裝瓶備用，所得產物即為羥基磷灰石陶瓷原粉。2.2羥基磷灰石陶瓷原粉的鈣、磷含量化學分析2.2.1羥基磷灰石試樣溶液的配制準確稱取1.5g羥基磷灰石陶瓷原粉樣品，在燒杯中以1：1鹽酸溶液（任課老師配好）溶解，移至250mL容量瓶中，稀釋至刻度。2.2.2磷鉬酸喹啉重量法測定羥基磷灰石的磷含量(1)用移液管從裝有羥基磷灰石試樣溶液的容量瓶中吸取10mL溶液于300mL燒杯中，加入10mL1：1硝酸（任課老師配好）溶液，加80mL水，蓋上表面皿，加熱至近沸。(2)加入50mL喹鉬檸酮試劑（任課老師配好），繼續(xù)加熱煮沸1min，然后冷卻至室溫。先將上層清液濾完，然后用傾瀉法以水洗沉淀2次（浮在水面上的黃色膜引起的質量誤差很小，可忽略不計），將沉淀移入預先干燥至恒重并準確稱重的坩堝中，繼續(xù)以水洗滌，然后將坩堝連同沉淀放入烘箱中，于180oC烘45min；(3)將烘好的樣品取出放入干燥器中，冷卻至室溫，準確稱重。2.2.3絡合滴定法測定羥基磷灰石的鈣含量準確吸取25mLEDTA標準液（任課老師配好并標定好）于錐形瓶中，把羥基磷灰石試樣溶液加入滴定管內，于錐形瓶中加入10mL氯化銨緩沖液（任課老師配好）和2-3滴指示劑，滴定溶液由藍綠色變至紫紅色，記錄消耗的試液量。平行測定三次，取平均值，并計算鈣含量。思考題制備羥基磷灰石時如果原料的鈣磷比低于1.67，可能出現什么產物？在羥基磷灰石制備過程中，如果pH值低于10，可能出現什么產物？測定羥基磷灰石的磷含量和鈣含量時，哪些操作和因素會引起測定誤差？分析結果的有效數字分別是幾位？什么是燒結？羥基磷灰石的顆粒大小對燒結有什么影響？參考文獻：[1]丑修建，黃明華，資文華,郭旭俠,孫俊賽，陳慶華，濕法合成羥基磷灰石生物陶瓷材料的研究，中國陶瓷，2004，40(1):20-23.[2]沈雁，鈣磷陶瓷粉體的合成工藝研究，東南大學碩士學位論文，2006.4.[3]王志鋒，宋邦才，張軍，化學分析法精確測定羥基磷灰石中的Ca和P含量，硅酸鹽通報，2007,26(1):186-189.實驗三、聚乳酸的合成、支架材料制備與體外降解實驗聚乳酸（又名聚丙交酯，polylacticacid,PLA）及其共聚物是一類通過α-羥基酸的環(huán)狀二聚體（即交酯）開環(huán)聚合而制得的高分子量脂肪族聚交酯。它們是化學合成的可完全生物降解的材料。該類聚合物通過酯鍵水解而發(fā)生降解，其降解產物無毒，最終能夠被機體代謝排出體外。聚乳酸不僅具有良好的生物降解性，還具有良好的生物相容性和力學性能，已被美國食品和藥物監(jiān)督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）批準用于臨床，在人體組織器官修復、傷口縫合和藥物載體方面都有廣泛應用。本實驗包括聚乳酸的合成、聚乳酸支架材料的制備和孔隙率測定、以及聚乳酸材料的體外降解實驗三部分內容。實驗目的掌握丙交酯開環(huán)聚合形成聚乳酸的原理和方法；掌握多孔支架材料的制備方法和孔隙率測定方法；掌握聚乳酸降解機理和體外降解實驗方法。實驗原理聚乳酸為無色或淡黃色透明物質，可溶于二烷、乙腈、氯仿、二氯甲烷等有機溶劑，但不溶于脂肪烴、乙醇、甲醇等溶劑。聚乳酸由于其單體分子手性的不同，分為D型、L型和DL型。由于自然界中多為L-乳酸，所以L型聚乳酸應用更為廣泛。聚乳酸可以是玻璃態(tài)聚合物，其玻璃化溫度Tg=60℃，也可以是半結晶/高結晶聚合物，結晶熔點在130~180℃之間。聚乳酸可以由丙交酯催化開環(huán)聚合而成，也可以由乳酸直接縮聚合成。丙交酯開環(huán)聚合制備聚乳酸是合成高分子量聚乳酸的主要方法。目前投產的聚乳酸產品多采用此法合成。催化丙交酯開環(huán)聚合的最常用的催化劑是辛酸亞錫，原因是辛酸亞錫毒性低，并通過FDA檢驗，是一種安全的催化劑；并且辛酸亞錫也是一種非常有效的催化劑，即使含量很小（0.1%）也能使單體幾乎完全轉化。丙交酯和辛酸亞錫在制備和存放過程中都會吸收空氣中的水分，而水的存在會使反應單體中產生羥基，能與錫原子發(fā)生配位絡合作用，使辛酸亞錫失去活性，對反應產生嚴重影響；同時羥基也會參與鏈反應，使反應難以得到有效的控制，最終導致聚乳酸分子量大幅下降。因此在反應過程中必須有效地除去反應體系中含羥基的小分子物質，而抽真空是一種較好的方式。組織工程用三維多孔支架的制備有多種方法，主要包括非編織狀纖維成形法、致孔劑法、相分離法、發(fā)泡法和三維印刷法等。其中纖維成形法和三維印刷法制備的多孔支架材料為非編織狀纖維型，而致孔劑法、相分離法和發(fā)泡法制備的多孔支架為海綿型。致孔劑法的原理為將致孔劑與聚合物溶液混合，將溶劑去除后再將致孔劑濾出形成多孔支架材料。該方法最大的優(yōu)點是可方便地通過調節(jié)致孔劑的尺寸以及含量來控制支架的孔徑和孔隙率，同時具有塑形簡單、操作方便、不需要特殊設備等優(yōu)點。聚乳酸是高疏水性的合成材料，降解時間一般很長，完全降解至少需要24個月。聚合物的降解機理可分為均相降解和非均相降解。非均相降解指降解反應發(fā)生在聚合物的表面，也可稱之為表面降解；而均相降解則是降解發(fā)生在聚合物的內部，也可稱之為本體降解。聚合物材料以何種形式降解主要取決于這種聚合物的水解速度和水在這種聚合物內部的滲透速度。當水解速度慢于水滲透速度時，發(fā)生本體降解；反之即發(fā)生表面降解。一般來說，在PBS中聚乳酸遵循本體降解；而在強酸強堿性的環(huán)境下，聚乳酸以表面降解的機理為主。聚乳酸的降解一般認為是自催化效應，最初降解比較緩慢，產生的酸性小分子催化加速了材料的降解，使降解反應速率逐步增加，材料整體崩塌。隨著時間的推移，酸性分子來不及代謝而積累，降解產物乳酸往往會導致局部組織pH值降低，進而誘發(fā)組織炎癥反應，這是聚乳酸材料在臨床應用上的一個主要缺陷。試劑和儀器試劑：丙交酯，辛酸亞錫，乙醚，乙酸乙酯；氯化鈉，二氯甲烷，乙醇；0.2mol/LPBS溶液儀器：特制玻璃管，真空泵，酒精噴燈，10mL量筒，吹風機，油浴鍋；隔離紙，玻棒，80目篩，烘箱；搖床，分析天平實驗步驟3.1聚乳酸的合成(1)在特制的玻璃管中加入5g丙交酯和5mL辛酸亞錫的乙醚溶液，辛酸亞錫濃度為1~2mg/mL；混合均勻后用吹風機加熱使乙醚快速揮發(fā)；玻璃管抽真空，同時采用酒精噴燈加熱玻璃管口，使其融化并封口。(2)將密封后的玻璃管置于140oC油浴鍋中反應2~3h，冷卻后敲碎玻璃取出已聚合好的聚乳酸產物，用乙酸乙酯洗滌三次去除未反應的丙交酯和辛酸亞錫后，干燥備用。3.2聚乳酸支架材料的制備和密度及孔隙率測定(1)采用溶鹽制孔法制備高孔隙率的組織工程用聚乳酸支架材料。將5g聚乳酸（分子量4~5萬）溶于80mL氯仿中，攪拌使其溶解，傾入相應尺寸的器具中（如隔離紙或塑料杯），按0.2g/mL聚乳酸溶液加入NaCl粉末（80目過篩），攪拌均勻至流動性下降后，用針頭在材料表面扎洞。然后在器具上覆蓋塑料薄膜，并在薄膜上用針扎出孔洞，常溫常壓下揮發(fā)48h。(2)將溶劑充分去除后的材料置于蒸餾水中浸泡36h，期間每6h換水一次，自然晾干（約48h），得到柔軟有彈性的多孔泡沫材料。(3)將材料烘干、稱重、備用。(4)支架材料支架密度和孔隙率的測定密度和孔隙率的測定采用排液（乙醇）法，即根據阿基米德原理，浮力的大小等于該物體排開液體的重量，物體的密度就可以通過將物體浸于已知密度的液體中，通過測定其質量或體積變化的方法來求得。由于液體體積測量精度不夠高，采用稱重法精確測量乙醇質量，除以乙醇密度（ρ）即為乙醇體積。該方法具體步驟如下：（a）量取一定體積（V1）的乙醇置于刻度試管中，精確稱重，記為W1，并于液面切線位置在容器壁上做一標記；（b）將一定質量（W0）的材料置于其中，精確稱重，記為W2；（c）將刻度試管置于真空干燥器中，用循環(huán)抽真空的方法把材料中的氣泡抽出，直到氣泡完全溢出材料沉降（若乙醇損失較嚴重，可補充乙醇至質量為W2），此時材料和乙醇的總體積記為V2，則△V=（V2－V1）為復合材料支架固體的體積；（d）用一吸管將液體吸出至液面降為標記處，精確稱重，得W2，△W=(W2-W2)為支架材料固體部分排開液體的質量（即△V對應的液體質量）；（e）將含乙醇的支架材料移出后精確稱重，記為W3，此時所剩乙醇體積為V3。以材料中所含乙醇的體積（V1－V3）為材料孔隙所占的體積，則材料的總體積為V=△V+(V1－V3)=V2－V3，則V2=△V+V1=(W1+△W)/ρ；所以復合材料支架的密度可表示為：d=W0/(V2－V3)孔隙率可表示為：P=(V1－V3)/(V2－V3)=(W1－W3)/(△W+W1－W3)乙醇在使用前均超聲30min。測量三次，取平均值。3.3聚乳酸材料的體外降解實驗(1)準確稱取一定量干燥后的聚乳酸材料置于250mL錐形瓶中，加入40mL不同pH值的0.2mol/LPBS溶液中，放入37oC搖床中振搖；(2)每周取出材料，純水清洗數次后干燥至恒重，精確稱重。思考題丙交酯聚合反應為何要抽真空？影響合成聚乳酸分子量的因素有哪些？溶鹽法制備多孔聚乳酸支架材料過程中，影響材料孔隙率的因素有哪些？目前認為的聚乳酸在模擬體液環(huán)境下降解的機理是什么？稱重應精確至小數點后幾位？哪些因素影響稱量的準確性？參考文獻：[1]張淑貞，丙交酯開環(huán)聚合制備聚乳酸的工藝研究，天津大學碩士學位論文，2007.6.[2]聚乳酸的合成研究，北京化工大學碩士學位論文，2007.6.[3]方大慶，聚乳酸的合成與降解性能研究，合肥工業(yè)大學碩士學位論文，2004.6.[4]周慶亮，聚乳酸軟骨組織工程支架的制備、降解及細胞相容性研究，浙江大學碩士學位論文，2005.6.[5]RuiyunZhang,PeterX.Ma,Porouspoly(L-lacticacid)/apatitecompositescreatedbybiomimeticprocess,JournalofBiomedicalMaterialsResearch,1999,45(4):285-93.實驗四、金納米顆粒的可控合成與表征金納米顆粒由于其特有的表面等離子體共振性質，在生物傳感、生物成像、藥物載體、腫瘤診療等生物醫(yī)學研究中具有廣泛的應用。目前，用于合成金納米顆粒的方法有很多，如液相合成法、氣相合成法、水熱合成法及微波合成法等。由于金納米顆粒的表面等離子體共振性質與其顆粒大小及形貌相關，因此其大小和形貌的控制合成顯得極為重要。研究發(fā)現，在液相合成法中，通過使用不同量或不同類型的表面活性劑、不同的模板劑或巰基烷烴化合物保護劑、不同的金前驅體、還原劑等，能夠對其形貌或大小進行調控。本實驗利用液相法中的檸檬酸法，利用檸檬酸作為還原劑和表面修飾劑，通過變化檸檬酸的含量，對納米金的大小進行控制合成。實驗目的掌握檸檬酸法合成金納米顆粒的原理；掌握金納米顆粒的表面等離子體共振性質概念；理解金納米顆粒大小與其表面等離子體共振性質的關聯。實驗原理膠體金納米顆粒的合成主要分為兩個階段（圖1）：（1）晶核的形成；（2）晶體生長。最終晶體的大小與晶核的形成與其生長機制密切關聯。在實驗中，首先三價金（Au3+）在沸水用被還原劑檸檬酸還原成零價金原子（Au0），這些Au0即成為最初的晶核。一方面，由于初期形成的晶核極小，其表面具有很高的表面能，就會與周圍的晶核進行接觸長為更大的晶核。另一方面，檸檬酸根離子通過靜電作用力的方式吸附在晶核表面，抑制晶核的生長。在兩種作用競爭達到平衡后，晶體不再生長，最終形成穩(wěn)定的檸檬酸修飾的金納米顆粒。圖1、檸檬酸法合成金納米顆粒的機理試劑和儀器試劑：HAuCl4?3H2O、二水合檸檬酸鈉、超純水儀器：50mL和1000mL燒杯，加熱器、油浴鍋、三口燒瓶、冷凝管實驗步驟（1）用王水（配制：3體積濃硝酸+1體積濃鹽酸）浸泡三口燒瓶等玻璃器皿過夜，并用純水洗凈、烘干備用；（2）用純水配制150mL1.1mM、1.7mM、2.2mM和2.8mM的檸檬酸鈉水溶液（每4組配一個濃度）；同時，用純水配制1mL濃度為25mM的HAuCl4水溶液；（3）搭好反應裝置，于三口燒瓶加入150mL檸檬酸溶液，升溫并開啟冷凝系統(tǒng)。待溶液沸騰，迅速加入配好的HAuCl4溶液，繼續(xù)迅速加熱至沸騰后，繼續(xù)反應30min。加入HAuCl4溶液，仔細觀察溶液顏色的變化情況；（4）停止加熱，自然冷卻至室溫，得到金納米粒子溶膠。思考題三頸燒瓶為什么要用王水浸泡？金納米顆粒的合成為什么要在沸水中進行？參考文獻：[1]NeusG.Bastus,JoanComenge,VíctorPuntes,Kineticallycontrolledseededgrowthsynthesisofcitrate-stabilizedgoldnanoparticlesofupto200nm:sizefocusingversusostwaldripening,Langmiur,2011,27:11098-11105.實驗五、生物材料儀器分析和表征實驗實驗目的掌握紫外光譜分析測試方法、蛋白生色基團種類和I型膠原蛋白特征吸收峰；掌握紅外光譜分析測試方法和聚乳酸特征吸收峰；掌握金納米粒子等離子體共振吸收峰的測定方法；掌握光散射法測量顆粒粒度的基本方法、適用范圍和粒度分布基本表示方法。試劑和儀器試劑：提取的I型膠原蛋白海綿樣品、冰醋酸；合成聚乳酸樣品、氯仿；金溶膠樣品儀器：UV-2550型紫外-可見分光光度計，紫外用比色皿，25mL燒杯，10mL量筒，移液槍，玻棒；VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀；ZetasizerNanoZS型動態(tài)激光散射粒度儀，粒度用石英比色皿實驗步驟5.1膠原蛋白的紫外光譜分