內(nèi)毒素實驗凝膠法

內(nèi)毒素實驗凝膠法演示文稿目前一頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點內(nèi)容基本概念實驗方法操作注意事項目前二頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點細菌內(nèi)毒素

細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的產(chǎn)物,它主要化學成分是脂多糖。細菌在生活狀態(tài)下不會釋放出來，只有當細菌死亡后才會表現(xiàn)出毒性。目前三頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點一、概念及相關知識熱原反應：病人在靜脈給藥15分鐘后發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、昏迷、休克等癥狀。熱原：任何可以導致肌體發(fā)熱的物質(zhì)。機理：外源性熱原質(zhì)通過內(nèi)源性熱原質(zhì)起作用。外源性熱原質(zhì)吞噬性白細胞內(nèi)源性熱原質(zhì)體溫調(diào)節(jié)中心發(fā)熱新蛋白合成新mRNA翻譯目前四頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點1942年，美國藥典首次收載熱原檢查法，中國藥典自第一版（1953年版）起收載。所有注射用藥品（肌肉注射、靜脈注射）都要經(jīng)過熱原檢查。熱原檢查法的局限性：1、重現(xiàn)性差。2、對藥物引起的增加、抑制作用無法控制。3、不同細菌產(chǎn)生的熱原質(zhì)的致熱域有差別。4、非定量反應。雖然不排除有其他熱原物質(zhì)存在，但細菌內(nèi)毒素是最主要的熱原物質(zhì)。目前五頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點細胞壁結(jié)構(gòu)：

肽聚糖脂蛋白革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌外膜

磷壁酸脂多糖細菌內(nèi)毒素：革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。當細胞壁外膜結(jié)構(gòu)完整時不具備生物活性，只有當細菌死亡，脂多糖脫落才顯示出內(nèi)毒素活性。脂多糖結(jié)構(gòu)：多糖O抗原＋核心多糖＋類脂A致熱活性部分目前六頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點細菌內(nèi)毒素的生物活性

1、致熱性。2、致死性毒性。3、白細胞減少。4、激活凝血系統(tǒng)。5、降低血壓，休克。6、Shwartzman反應。7、刺激淋巴細胞有絲分裂，等等。目前七頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點細菌內(nèi)毒素的耐熱性

細菌內(nèi)毒素具很強的耐熱性，一般的高壓滅菌不能去除細菌內(nèi)毒素，需250℃至少30分鐘以上的干熱滅菌才能使其滅活。

目前八頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點實驗用器具的處理

內(nèi)毒素試驗中使用的器皿都要經(jīng)過處理去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。

耐高溫的玻璃器皿等置于電熱干烤箱內(nèi)180℃干烤至少2h或者250℃干烤至少30分鐘；

塑料器皿置于30％雙氧水中浸泡4h，再用細菌內(nèi)毒素檢查用水充分沖洗，60℃烘干備用。

目前九頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點細菌內(nèi)毒素的單位內(nèi)毒素的量值：1、內(nèi)毒素單位（EU）1982年FDA將當時美國代號為EC－2的內(nèi)毒素標準品規(guī)定為5EU/ng。1983年內(nèi)毒素單位（EU）被USP正式引用。2、國際單位（IU）WHO先后兩次組織協(xié)作標定，建立內(nèi)毒素國際標準品，其中第二批內(nèi)毒素國際標準品適用于所有內(nèi)毒素檢查法，且明確1IU＝1EU。目前十頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點細菌內(nèi)毒素檢查法

凝膠法

濁度法

光度法

顯色基質(zhì)法

重現(xiàn)性好

能定量

能控制藥物的增強/抑制干擾

操作簡便。節(jié)省時間方法分類方法特點目前十一頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點細菌內(nèi)毒素檢查法概念

本方法是利用鱟試劑檢測由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度測定法，由于凝膠法操作簡單快捷、靈敏度高，并且藥典規(guī)定當不同試驗方法的結(jié)果存在爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法為準，所以凝膠法被廣泛應用。目前十二頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動物門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一帶。鱟試劑：利用鱟血液中的變性細胞，經(jīng)裂解液和機械方式促使細胞破裂而提取到的一種細胞溶解物，能與極微量的細菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應，反應的速度和凝膠的堅固程度與內(nèi)毒素濃度有關，是體外檢測內(nèi)毒素的敏感試劑。目前十三頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點目前十四頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點凝膠法概念

凝膠法是通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的方法。目前十五頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點鱟試劑與內(nèi)毒素反應機理內(nèi)毒素C因子活化的C因子凝膠B因子凝固酶原凝固酶活化的B因子凝固蛋白原鱟凝血系統(tǒng)－酶聯(lián)反應目前十六頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點二、細菌內(nèi)毒素凝膠法實驗程序1、試驗準備：試劑、儀器及用具2、選擇鱟試劑靈敏度，計算樣品稀釋度3、鱟試劑靈敏度復核4、供試品干擾試驗（新藥或新方法）5、供試品內(nèi)毒素限量檢查目前十七頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點凝膠法中用到的儀器

1.超凈工作臺

目前十八頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點凝膠法中用到的儀器2.恒溫培養(yǎng)箱

孵育樣品浸提液以及培養(yǎng)試驗結(jié)果。目前十九頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點凝膠法中用到的儀器3.干烤箱

用于實驗用耐高溫器皿的去熱源，溫度范圍要求至少300℃目前二十頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點凝膠法中用到的儀器4.移液器和無熱源的移液尖（或者去熱源的刻度吸管）

5.計時器、漩渦混合器、電子天平等目前二十一頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點凝膠法中用到的器皿器具分類器具名稱反應試管玻璃試管（外徑10×75mm）、試管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及無熱原吸頭其他酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜、記號筆目前二十二頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點凝膠法中用到的試劑

1）鱟試劑：具有國家頒發(fā)的批準文號2）細菌內(nèi)毒素工作品3）細菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的無菌水）

4）75％乙醇目前二十三頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點鱟試劑靈敏度復核試驗

當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。

目前二十四頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點鱟試劑靈敏度復核試驗

根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值（λ）,將細菌內(nèi)毒素工作標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘,然后制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒鐘。目前二十五頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點鱟試劑靈敏度復核試驗

取復溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每一個內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管各加入0.1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。

將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃的適宜恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。

目前二十六頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點鱟試劑靈敏度復核試驗結(jié)果觀察

將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時，若管內(nèi)形成凝膠，且不從管壁滑脫者為陽性；若不形成凝膠，或形成凝膠但倒轉(zhuǎn)180°后從管壁滑脫者為陰性。

保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結(jié)果。

目前二十七頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點鱟試劑靈敏度復核試驗

若最大濃度2.0λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc），計算方法見中國藥典。反應終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。當λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

目前二十八頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點凝膠法的試驗步驟

下面我們結(jié)合中國藥典2010、GB14233.2醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法以及GB15810一次性無菌注射器來學習具體試驗方法。

目前二十九頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點實驗步驟

浸提介質(zhì)（細菌內(nèi)毒素檢查用水）體積計算公示：V－－浸提介質(zhì)體積，單位為（ml）；L－－產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素限值（該產(chǎn)品允許含有的細菌內(nèi)毒素的量），單位為EU/件；λ－－鱟試劑靈敏度的標示值，單位為EU/ml。目前三十頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點實驗步驟樣品處理方法：

a）管類和容器類器具用細菌內(nèi)毒素檢查用水浸泡器具內(nèi)腔，在（37±1）℃恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進行試驗；b）小型配件或?qū)嶓w類樣品置無熱源玻璃器皿內(nèi)，加入細菌內(nèi)毒素檢查用水振蕩數(shù)次，在（37±1）℃恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進行試驗。

制備的供試液儲存不應該超過2h。一般要求供試液的PH值在6.0~8.0之間，如不在該范圍內(nèi)，可用鱟試劑廠家提供的PH緩沖液調(diào)節(jié)浸提液的PH值。目前三十一頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點實驗步驟目前三十二頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點結(jié)果觀察

B、C溶液的反應管必須要陽性，就是輕輕倒轉(zhuǎn)180度過來，鱟試劑安瓿里的反應溶液形成了凝膠體，不滑落。而D溶液，就是細菌內(nèi)毒素檢查用水那2管，必須要陰性，3個條件都滿足，就說明試驗結(jié)果是可信的。最后看A溶液的反應情況：

陽性就說明原套器具每件大于20EU，判定為不合格；

陰性就說明小于20EU,結(jié)果是合格的；1管陽性、1管陰性則要重新復查，復試時，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性則判斷合格；否則判斷為不合格。目前三十三頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點注意事項1.每批鱟試劑在用于試驗前首先要進行靈敏度的復核試驗；2.安瓿開啟前應先用砂石劃痕(不管是色點或包環(huán)易折安瓿)，用手半拉半掰將頸部折斷，千萬不能用鑷子敲擊，防止碎玻屑掉入安瓿。3.在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加入時，取樣均應準確，緩緩加入避免氣泡。

4.保溫過程中不可隨時取出觀察，防止形成的凝膠受到振動后變形而誤判為陰性。

目前三十四頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點注意事項5.凍干的鱟試劑應存放在2-8℃下；避免長時間放置在高于25℃的溫度條件下。已復溶的鱟試劑在間歇使用過程中最好放在2-8℃的冰箱里，可存放24小時，在-20℃以下，可存放四個星期，鱟試劑只能凍融一次。

目前三十五頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點三、操作注意事項試驗前準備：1、玻璃器具應規(guī)范化，便于除熱原、計量準確、清洗操作方便。洗凈去污去內(nèi)毒素去洗滌劑精洗除外源性熱原：250

℃干烤至少1小時。2、盡量用鋁制器具和不銹鋼用具，且用蒸餾水沖洗后250

℃干烤至少1小時。3、用于內(nèi)毒素檢測的稀釋試管最好用玻璃試管；塑料用具只能為一次性且保證無內(nèi)毒素。目前三十六頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點實驗環(huán)境：最好在潔凈室或潔凈工作臺內(nèi)進行，保證環(huán)境溫度、濕度及通風穩(wěn)定。實驗人員：用適宜的洗滌劑洗手，用75％酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。實驗過程：1、內(nèi)毒素工作標準品應嚴格按要求低溫保存；工作標準品開封后盡快使用且應一次性用完，不再保存。2、溶解后的標準品用封口膜封口后在漩渦振蕩器上混勻15min；進一步稀釋時每稀釋一步均應在漩渦混合器上混勻30s。目前三十七頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點目前三十八頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點振蕩前振蕩后內(nèi)毒素分子在水溶液中的狀態(tài)目前三十九頁\總數(shù)四十二頁\編于二十三點3、每一步稀釋液所用的移液器不能反復、交叉使用。4、鱟試劑復溶時應將檢查用水順著瓶壁加入，避