流式細胞概述三

十三.流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用淋巴瘤免疫分型目前淋巴瘤的分類方法已從LSG的形態(tài)學(xué)分類逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镽EAL分類法，REAL分類法是以腫瘤發(fā)生源為基礎(chǔ)的分類方法，在原來的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上加上免疫學(xué)分型后再加以分類，這種分類方法不僅能夠推斷腫瘤的發(fā)生源，對治療也有指導(dǎo)意義。因此淋巴瘤的免疫分型越來越重要。如同白血病免疫分型一樣，淋巴瘤的免疫分型也是利用單克隆抗體檢測淋巴瘤細胞的細胞膜和細胞漿抗原,分析其表現(xiàn)型，以了解被測淋巴瘤細胞所屬細胞系列及其分化程度。流式細胞儀能對多數(shù)的淋巴瘤細胞的細胞膜和細胞漿抗原迅速客觀地做出檢測，在淋巴瘤的免疫分型中起著不可替代的作用。臨床淋巴瘤的免疫分型的檢測標(biāo)本一般是淋巴結(jié)、脾臟、胸水、腹水等。在臨床淋巴瘤的免疫分型工作中?？捎龅揭韵滤姆N情況：①B細胞系淋巴瘤②T/NK細胞系淋巴瘤③淋巴細胞系以外的造血細胞腫瘤④造血細胞以外的腫瘤。REAL分類淋巴瘤的免疫表型見表12.8。表1L8REAL分美ifr巴宿的免疫表型—CQCQCQCDCQCQCQ10CDlieCQ16CQ19CQ50CDCDCQ30CQCQ56ELEL十明LLT-—LPL*/-十HCL十-t-PEL十-9-AIZL-9-SMZL:*AHCL—十PCDLPL+一BL一-?-一HBLB-t-癡TLEL十十十-?-十TPLLLGLT-t--t-—LCLNE-t-十-t-十AiF-t-—十PTL十AELDACLITCL4AIL-t-LCL*LCLH*/-+* :弱表達或陰性。BLBL:前B原始淋巴細胞淋巴瘤/白血??；BSLL:B-小淋巴細胞淋巴瘤；LPL:淋巴漿細胞樣淋巴瘤；MCL:斗篷細胞淋巴瘤；FCL:濾泡中心淋巴瘤；MZL:邊緣帶B細胞淋巴瘤；SMZL:脾MZL;HCL:毛細胞白血??；PC:漿細胞瘤；DLBL:B-彌漫性大細胞淋巴瘤；BL:Burkitts淋巴瘤；HBLB:高度B細胞淋巴瘤，Burkitts樣;TLBL:前T原始淋巴細胞淋巴瘤/白血??；TPLL:T幼淋細胞白血??；LGLT:大顆粒淋巴細胞白血病，T細胞型；LGLNK:大顆粒淋巴細胞白血病，NK細胞型；MF:覃樣真菌??；PTL:外周T細胞淋巴瘤,非特異;AILD:血管免疫T細胞淋巴瘤;ACL:血管中心性淋巴瘤；ITCL:腸T細胞淋巴瘤；ATL:成人T細胞淋巴瘤/白血??；LCL:大細胞淋巴瘤；LCLH:大細胞淋巴瘤，何杰金氏樣；B細胞系淋巴瘤大多數(shù)情況下，B細胞系淋巴瘤CD19、CD20陽性，分化早期CD20陰性，CD10、CD34陽性；分化晚期CD5、CD23陽性，成熟為漿細胞后以上標(biāo)記均陰性。利用單克隆抗體K、入(正常時K：入=2：1)可檢測免疫球蛋白輕鏈的偏移，推斷是否克隆性增殖免疫球蛋白。表12.6.列出了外周B淋巴系淋巴瘤的4種類型的免疫分型。SLL(smallcelllymphocytelymphoma)--小細胞淋巴細胞淋巴瘤：小細胞淋巴細胞淋巴瘤細胞一般表達CD19、CD20、CD43和CD79,CD5與以上抗原復(fù)合表達，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表達但表達較弱，CD10、CD22陰性。伴染色體異常者預(yù)后較差。MCL(mantlecelllymphoma)--斗篷細胞淋巴瘤：MCL包括以前分類為中等淋巴細胞淋巴瘤(ILL)、中度分化淋巴細胞淋巴瘤(IDL)、中心細胞淋巴瘤和套區(qū)細胞淋巴瘤(MZL)，占淋巴瘤的2%-8%，入型較k型常見，sIgM中度表達,IgD弱或陰性，表達CD19、CD20、CD22、CD43，但多數(shù)病例CD5陽性CD23陰性，CD10一般陰性，CD5陽性CD23陰性和Ig類型可幫助鑒別MCL和FCL。FCL(Follicularcentercelllymphoma)---瀘泡中心細胞淋巴瘤：FCL占淋巴瘤的45%，表達CD19、CD20、CD22，sIg強表達，但多數(shù)病例CD10和CD23陽性，典型FCCLCD5、CD43和CD11c陰性。CD10陽性、CD11c陰性和sIg強表達利于與MZL鑒別。MZL(Marginalzonelymphoma)--邊緣帶淋巴瘤和相關(guān)B細胞淋巴瘤：典型免疫表型：CD19、CD20、CD22、HLA-DR陽性，sIg中度表達，CD5、CD10、CD23、CD25陰性，CD21、CD24多數(shù)情況下陰性，多數(shù)表達CD11c。CD5、CD10、CD23、CD25陰性，CD21、CD24多數(shù)情況下陰性，利于與CLL/SLL、FCCL、MZL鑒別。T/NK細胞系淋巴瘤早期T細胞一般CD2、CD5、CD7、cCD3陽性。T/NK細胞系淋巴瘤的詳細分類及表型參見表12.8。細胞膜CD3陽性可確認(rèn)為外周T細胞腫瘤，外周T細胞腫瘤的特征是CD3與CD4或CD8復(fù)合表達，并常有克隆性T細胞受體，或a-p型或y-6型；MF(mycosisfungoides)--蕈樣真菌病和sezary綜合癥:占皮膚淋巴瘤的絕大多數(shù)，CD4陽性，同時表達CD2、CD3、CD5,有時CD7陰性，CD8陽性病例極少見但已有報道，有無TCRp基因重排對鑒別淋巴瘤和炎性反應(yīng)有幫助。LCL(largecelllymphoma)--大細胞淋巴瘤：大細胞淋巴瘤(LCL)占成人淋巴瘤的40%，兒童的1/3，成人80%是B細胞型的，兒童B細胞型和T細胞型各占一半。淋巴細胞系以外的造血細胞腫瘤急性髓系細胞白血病(特別是M4、M5)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時有發(fā)生，如T、B淋巴細胞標(biāo)記低表達應(yīng)懷疑并按白血病免疫分型處理。造血細胞以外的腫瘤檢測淋巴結(jié)、胸腹水標(biāo)本時如遇CD45陰性情況應(yīng)考慮非造血系統(tǒng)腫瘤淋巴結(jié)、胸膜、腹膜轉(zhuǎn)移。十四.流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用紅細胞疾病診斷(一)網(wǎng)織紅細胞測定計數(shù)外周血中網(wǎng)織紅細胞數(shù)量，對于評價骨髓紅系造血及網(wǎng)織紅細胞從骨髓到外周血的轉(zhuǎn)送速率有重要意義。有核紅細胞在成熟過程中，脫去細胞核后仍有少量RNA殘留在細胞漿內(nèi)，再經(jīng)過約一天時間殘留RNA完全消失，成為成熟紅細胞。這種細胞漿內(nèi)有殘留RNA的紅細胞稱作網(wǎng)織紅細胞。正常情況下有一定量的網(wǎng)織紅細胞出現(xiàn)在外周血中，正常值為1.0?1.5%，上限3.0%，但當(dāng)紅細胞數(shù)異常時會出現(xiàn)錯誤結(jié)果。因此用網(wǎng)織紅細胞絕對值表示,正常值5?15x1010/L。由于常規(guī)方法測定須先在體外經(jīng)活體染色(最常用亞甲蘭)，然后在顯微鏡下計數(shù)，計數(shù)細胞數(shù)有限。用流式細胞儀測定網(wǎng)織紅細胞具有以下優(yōu)點:①可避免由于細胞核的碎片或鐵幼粒細胞的顆粒的存在而出現(xiàn)假性網(wǎng)織紅細胞升高②可避免人為誤差③因為可在短時間內(nèi)測量上萬個細胞,結(jié)果較常規(guī)方法準(zhǔn)確、可靠，④同時可給出網(wǎng)織紅細胞年齡結(jié)構(gòu)。流式細胞儀測定網(wǎng)織紅細胞方法簡單，只須將紅細胞洗凈后用熒光染料染色后即可上機檢測。常用的熒光染料有焦寧Y(PyroninY)丫啶橙(AcridineOrangeAO)碘化丙啶(崛PropidiumIodinePI)花青(Cyaninedye)等。(二)PNH診斷陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)因血細胞膜上錨固蛋白-糖磷酸肌醇(GPI)減少或缺乏而導(dǎo)致與GPI有關(guān)的補體激活抑制因子如CD55、CD59減少或缺乏，因而紅細胞對補體異常敏感發(fā)生溶血。流式細胞儀檢查CD55、CD59十分敏感，正常人CD55、CD59雙陽性細胞〉95%,PNH病人CD55、CD59明顯減少，這種減少不僅表現(xiàn)在紅細胞上，粒細胞、淋巴細胞也有減少。已發(fā)現(xiàn)CD55c可能對GPI減少或缺乏較CD59更敏感。十五.流式細胞術(shù)在血液學(xué)中應(yīng)用血小板功能分析和血小板病診斷血小板功能分析血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期血小板的膜糖蛋白受體的種類、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同，用不同的抗血小板單克隆抗體可測定和分析血小板功能狀態(tài)。血小板質(zhì)膜糖蛋白單克隆抗體CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b(GPIb)、CD41b(GPIIb)、血小板顆粒膜糖蛋白CD62p、CD63的測定可供分析血小板功能狀態(tài)，如CD62p、CD63正常血小板不表達，當(dāng)血小板活化時表達明顯增加，可用來測定活化血小板。血小板病診斷攪1.血小板相關(guān)抗體測定血小板相關(guān)抗體可因不同機制產(chǎn)生?？寡“遄陨砜贵w(包括原發(fā)性、藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生、合并其它自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)能引起嚴(yán)重的血小板減少。大多數(shù)原發(fā)性(免疫性)血小板減少性紫瘢病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相關(guān)抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相關(guān)抗體的抗原仍不十分清楚，可能有多種，如GPIb、GPIIb、GPIIIa、Pa、或HLA抗原?？寡“遄陨砜贵w也可能發(fā)生于多次輸血后或懷孕期間，這些自身抗體多為針對HLA-I類抗原決定簇的抗體，一般是IgG,它們可迅速破壞和清除隨機供血者的血小板。因此能迅速測定這些抗體存在與否的方法是必需的。許多不同的利用放免、熒光、酶、SPA等的測定血小板抗體的方法已建立，但這些方法都很復(fù)雜、費時;同時給出的結(jié)果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗體來表示。近年來發(fā)展起來的用FCM測定血小板抗體的方法具有快速、簡便的優(yōu)點，同時可測定血小板上和血清中的抗體;測定中FCM分析每一個血小板表面有無抗體，能給出血小板群體中有多少血小板表面有抗體(以％表示)；同時能給出血小板相關(guān)抗體量與血小板數(shù)的直方圖，使我們了解血小板相關(guān)抗體在血小板群體中的分布情況。FCM測定血小板抗體原理:分別用標(biāo)有熒光的抗人IgG、IgA、IgM或用抗血小板GPIb、IIb、IIb/IIIa的抗體與分離洗凈的病人的血小板和在病人血清中孵育過的正常O型血小板作用后用FCM測定，前者測定的是病人血小板上的抗體后者測定的是病人血清中的抗體。血小板無力癥血小板無力癥時血小板膜GPIIb/IIIa明顯減少，用血小板質(zhì)膜糖蛋白單克隆抗體CD41、CD61和流式細胞儀測定不僅可測出GPIIb/IIIa減少，CD42a、CD42b基本正?；蚱?，還可測出GPIIb/IIIa減少程度，分類血小板無力癥。巨大血小板綜合征(BSS):血小板巨大,CD42a減少，CD42b減少，CD61增加。十六.流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用微小殘留白血病檢測微小殘留白血病(MinimalResidualLeukemiaMRL)是指白血病經(jīng)治療后獲得完全緩解(CompleteRemissonCR)后體內(nèi)殘留少量白血病細胞的狀態(tài)。微小殘留白血病與明顯白血病(Overtleukemia)無明確界限，僅是白血病細胞負荷數(shù)量不同，一般成人明顯白血病時白血病細胞可達1012,經(jīng)治療獲CR后＜1010,因此MRL狀態(tài)白血病細胞數(shù)可能是100-10攪。MRL是白血病復(fù)發(fā)的根源，因此檢測MRL有十分重要的意義：①指導(dǎo)臨床治療②預(yù)測白血病復(fù)發(fā)③評價自體骨髓移植的凈化效果。應(yīng)用FCM檢測MRL的優(yōu)點在于可在短時間內(nèi)分析大量標(biāo)本，具有快速的特點。由于白血病細胞缺乏特異性標(biāo)記,FCM檢測MRL的效果尚不理想，敏感性尚不夠高，一般僅有1/103-104。目前主要有兩類檢測方法:①用FCM分析CR期骨髓細胞核酸量或染色體，可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性僅1-5%。②免疫表型分析，由于尚無白血病特異的標(biāo)記,只能通過與正常細胞比較某些抗原量的差別及分布部位的不同作為檢測依據(jù);如利用TdT和CD10雙標(biāo)記檢測MRL,但敏感性亦不高，約0.1-1%。假陰性結(jié)果可能由于：①標(biāo)本中的白血病細胞＜10-4攪或＜10-5;②所取標(biāo)本不能代表全身骨髓情況；③病人白血病細胞表型轉(zhuǎn)換。十七.流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用白細胞吞噬功能測定粒、單核-巨噬細胞是機體免疫反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)細胞中的重要成員。它們不僅具有吞噬功能，吞噬外來的微生物、腫瘤細胞等，同時又分泌多種生物因子參于免疫反應(yīng)，此外單核-巨噬細胞對抗原物質(zhì)的攝取、修飾、遞呈等作用，是淋巴細胞的免疫功能必不可少的。因此檢測白細胞吞噬功能對了解機體免疫狀況有重要意義。以下簡要介紹FCM測定白細胞吞噬功能的概況。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡測定白細胞吞噬功能時須分離粒、單核細胞，并盡可能地保持細胞活性。用FCM檢測時不須分離細胞，應(yīng)用全血即可，因此可在自然狀態(tài)下測定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。目標(biāo)粒子一般以酵母、細菌等能激發(fā)自然吞噬作用或予先以抗體調(diào)理化的人造粒子為好；并標(biāo)以熒光，常用者為FITC(異硫氤酸熒光素)或RA(羅達明).以肝素或拘櫞酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200pl全血與目標(biāo)粒子200^(目標(biāo)粒子濃度4x107/ml)置37°C溫育,溫育結(jié)束后立即置冰水中，以同樣標(biāo)本不在37°C溫育而置于冰水中者作為對照。目標(biāo)粒子不同溫育時間不一,FITC標(biāo)記的金黃色葡萄球菌25分鐘,FITC標(biāo)記的粒子15分鐘即可達到吞噬飽和;此外，粒子與白細胞的比例也很重要，一般為10:1。溫育結(jié)束后以溶血劑溶去紅細胞即可上機檢測。應(yīng)用FCM全血法測定白細胞吞噬功能，對白細胞的丟失、損傷最??；此外用本法可測定血清中的調(diào)理素(Opsonine)水平及血清中有無吞噬作用抑制因子。如果用FITC標(biāo)記的單克隆抗體CD13、CD14、CD15標(biāo)記粒、單核細胞,用紅熒光標(biāo)記目標(biāo)粒子，即可測定吞噬功能與細胞表面標(biāo)記的關(guān)系,對白細胞吞噬功能作進一步的研究。十八.流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用NK和LAK細胞活性測定NK細胞存在于外周血大顆粒淋巴細胞中，它對靶細胞的細胞毒活性不依賴于抗體，無MHC限制性，它們的數(shù)量及細胞毒活性是機體免疫系統(tǒng)的重要指標(biāo)。人NK細胞一般表達CD56、CD16、CD57部分表達CD2、CD8、CD11而不表達CD3。LAK(LymphokineActivatedKillercells)細胞主要存在于LGL的高密度群體中，LAK前體細胞表達NK細胞標(biāo)志CD16而不表達T細胞標(biāo)志如CD3、CD4、CD5等；它們不需要抗原刺激就能殺傷NK細胞不能殺傷的腫瘤細胞,并且無MHC限制性;從表型上看大多數(shù)LAK細胞來自NK細胞，但嚴(yán)格講LAK細胞對K562細胞的殺傷活性不能稱作LAK活性，測定LAK活性的靶細胞應(yīng)為NK抵抗的實體瘤細胞,如HL-60細胞、HeLa細胞等。常用的測定NK和LAK細胞活性的方法較多，如撞51Cr釋放法、[3H]TdR參入法或釋放法、LDH釋放法、ATP發(fā)光法等;應(yīng)用放射性同位素對人體和環(huán)境不利，利用FCM測定NK和LAK細胞活性從1986年就開始摸索，方法已趨于成熟,以下介紹其中一種：肝素抗凝取外周血后分離PBMC后洗凈，調(diào)整細胞濃度為106/ml,為效應(yīng)細胞；靶細胞分別為K562和HL-60或HeLa細胞，在對數(shù)生長期受集細胞，調(diào)整濃度為106。用3mMDiO(3,3-DiacradecyloxacarbocyaninePerchlorate)標(biāo)記靶細胞，效應(yīng)細胞:靶細胞(E:T)為40:1、20:1、10:1和5:1,孵育后加入PI(10pg/ml)染死細胞，洗凈后即可上機檢測。DiO發(fā)綠熒光,PI發(fā)紅熒光，利用雙參數(shù)(FL1vFL2)直方圖可清楚地了解靶細胞中的死亡細胞，計算出靶細胞％溶解率。十九.流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的 應(yīng)用造血干/祖細胞測定造血干/祖細胞移植已廣泛應(yīng)用于血液腫瘤、實體瘤、某些遺傳性疾病、免疫缺陷病等，因此檢測造血干/祖細胞已成為臨床必不可少的手段。應(yīng)用流式細胞儀多色技術(shù)測定外周血造血干/祖細胞，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點，不僅能確定造血細胞數(shù)量，而且能對造血干祖細胞的質(zhì)量進行評價，為臨床干細胞移植治療提供重要數(shù)據(jù)。目前多色組合一般包括CD34、CD38、HLA-DR等McAb。CD34抗原是一種分子量約11萬的糖蛋白，選擇性地表達于早期造血干/祖細胞、小血管內(nèi)皮細胞和胚胎纖維母細胞表面。該抗原在原始造血細胞上表達，以后隨細胞分化、成熟逐漸減少直至消失，因此一直作為造血干/祖細胞表面的一種特征性標(biāo)志而廣泛應(yīng)用于造血干細胞基礎(chǔ)研究和臨床。CD34+細胞是一群不均一的群體，依其是否表達CD38、HLA-DR、CD33、c-kit等分出的亞群表現(xiàn)出了不同的造血性能。最近隨著造血理論的深入研究關(guān)于造血干細胞究竟是否都是CD34+細胞出現(xiàn)一些爭論，實驗研究證明，CD34-造血干細胞較CD34+造血干細胞更具造血潛能,有人經(jīng)實驗研究提出CD34的表達與造血干細胞的細胞動力學(xué)相關(guān)，細胞激活時CD34+，細胞處于穩(wěn)定狀態(tài)時CD34-;也有人提出CD34-造血干細胞較CD34+造血干細胞發(fā)育階段更早。我們認(rèn)為：成人體內(nèi)可能仍保留著一小部分原始間充質(zhì)細胞，他們?nèi)员Ａ糁嘞蚍只芰Γ材芟蛟煅杉毎只?，因此體內(nèi)有CD34-造血干細胞和CD34+造血干細胞是正常的，CD34-造血干細胞較CD34+造血干細胞發(fā)育階段更早、更具造血潛能；但目前的用CD34+細胞代表造血干細胞的檢查方法已足以滿足臨床需要，因為臨床實踐已證明這一點。理論研究往往能推動學(xué)術(shù)發(fā)展，開發(fā)新技術(shù)，我們期待著造血理論的不斷發(fā)展給臨床帶來新技術(shù)，不斷提高臨床療效。我們用CD34、CD38、HLA-DR三色組合測定了151份外周血經(jīng)動員后標(biāo)本，CD34+細胞占單個核細胞(MNC)的(0.954±0.466)%，含量為(3.55±2.41)x109/L；其中CD34+CD38-亞群含量為(0.253±0.24)x109/L，占CD34+細胞的7.13%；CD34+HLA-DR-亞群含量為(0.273±0.310)x109/L，占CD34+細胞的7.61%；隨著采集次數(shù)的增加，CD34+細胞及其亞群數(shù)量逐漸減少(PV0.05)；隨著供者年齡增加，其外周血CD34+細胞數(shù)逐漸減少，在＞40歲供者CD34+細胞百分比和含量比＜20歲供者分別降低了47%和50%；動員后外周血CD34+細胞數(shù)存在性別差異，男性供者外周血CD34+細胞數(shù)較女性高23%。應(yīng)用流式細胞儀測定造血干細胞雖具有快速、準(zhǔn)確的特點，目前被廣泛采用。但應(yīng)用中要特別重視質(zhì)量控制，要建立一套完整質(zhì)控方法以確保檢測的準(zhǔn)確性。二十.流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用細胞凋亡研究細胞凋亡是細胞在基因控制下的有序死亡，在疾病發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，因而研究細胞凋亡有重要意義。細胞凋亡檢測方法很多，應(yīng)用流式細胞儀技術(shù)可根據(jù)細胞在凋亡過程中發(fā)生一系列形態(tài)、生化變化從多個角度對細胞凋亡進行定性和定量的測定。1.細胞形態(tài)變化：通過流式細胞儀測定細胞光散射的變化來觀察細胞凋亡。在細胞凋亡早期，細胞前向角光散射的能力顯著降低，90°角光散射的能力增加；在細胞凋亡晚期，前向角和90°角光散射的信號均降低。此方法特異性不強，目前使用較少。2細胞膜功能改變：磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserinePS)異位：正常情況下，PS位于細胞膜內(nèi)層，細胞發(fā)生凋亡時PS從細胞膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)并暴露在細胞膜外層，是細胞發(fā)生凋亡的早期事件。PS與AnnexinV(一種具有強力抗凝作用的血管蛋白)具有高度親和力。應(yīng)用流式細胞儀采用FITC-AnnexinV/PI雙染法進行細胞凋亡檢測，可同時描述三群不同狀態(tài)細胞：FITC-AnnexinV-/PI-細胞，即正?；盍毎籉ITC-AnnexinV+/PI-細胞，即凋亡細胞；FITC-AnnexinV+/PI+細胞，即已死亡細胞。此種方法操作過程簡單，指標(biāo)敏感，應(yīng)用者越來越多。PI/Hoechst33342雙染法：Hoechst33342(HO)是一種DNA的特異性熒光染料，可通過完整細胞膜，應(yīng)用PI/Hoechst33342可將細胞分為三群：正常活細胞(HO強/PI-)，凋亡細胞(HO弱/PI-)，(由于凋亡細胞發(fā)生DNA降解和丟失，導(dǎo)致HO熒光減弱)，死亡細胞(HO弱/PI+)。此種方法再結(jié)合凋亡細胞前向角光散射能力降低的特點，能更好地鑒定凋亡細胞，但HO須紫外光激發(fā)，由于很多流式細胞儀不配有紫外激光，故此法應(yīng)用受限。吖啶橙(AO)/漠化乙啶(EB)雙染法:AO是一種異染性熒光染料，可通過完整的質(zhì)膜，它與核酸的結(jié)合主要是嵌入DNA雙鏈的堿基之間，其發(fā)射峰為530nm，呈綠色熒光。EB的理化特性與PI相似，不能通過完整質(zhì)膜。應(yīng)用AO/EB雙染法也可以將細胞分成三群:正常活細胞(AO強/EB-)，凋亡細胞(AO弱/EB-)，死亡細胞(AO弱/EB+)，原理與PI/Hoechst33342雙染法相似，不同的是AO/EB雙染法所的激發(fā)光是被廣泛使用的氬激光(488nm)，而不須紫外光，其缺點是染色過程較復(fù)雜，且AO易污染設(shè)備管道，因此使用此法者較少。放線菌素D(7-AAD)染色法：7-AAD是一種核酸染料，它不能通過正常質(zhì)膜，隨著細胞凋亡、細胞死亡過程，質(zhì)膜對7-AAD的通透性逐漸增加，結(jié)合細胞凋亡中DNA的有控降解，最后通過7-AAD標(biāo)記DNA的強弱，將細胞分為三群：7-AAD強為死亡細胞，7-AAD弱是凋亡細胞，7-AAD-為正常活力細胞。此法具有染色快速、簡便、價格便宜等優(yōu)點。另外，由于此法不破壞細胞膜，故還可聯(lián)合使用FITC、PE標(biāo)記的膜蛋白，對特殊細胞群及亞群進行多色熒光分析(雖然AO/EB雙染法也不破壞被檢細胞膜，但由于AO及EB的發(fā)射光波譜分別與FITC和PE的發(fā)射光波譜相似，故AO/EB法不能與FITC和或PE聯(lián)合使用)。此法是應(yīng)用核酸染料測定細胞凋亡的流式細胞儀法中十分實用的方法。細胞器改變：線粒體膜APO2.7蛋白表達：早期凋亡細胞的線粒體膜出現(xiàn)APO2.7蛋白表達，利用熒光標(biāo)記的單克隆抗體，運用流式細胞術(shù)可以檢測早期凋亡細胞。4.DNA含量變化：主要是PI染色法，由于凋亡細胞DNA發(fā)生有序降解，被降解的低分子量DNA片段從變性細胞膜(經(jīng)乙醇及透膜劑處理)漏出細胞外，使得凋亡細胞內(nèi)的DNA含量減低，在流式細胞儀測定細胞DNA含量直方圖中G1峰前可出現(xiàn)亞二倍體峰，即所謂凋亡峰。通過測定凋亡峰百分含量，便可知凋亡細胞比例。此法簡便、快速，是目前常用的、經(jīng)典的測量凋亡細胞的方法。此法存在問題：少量的正常的低DNA含量細胞、由于機械損傷產(chǎn)生DNA含量減低的壞死細胞、染色體丟失的分裂相細胞以及細胞碎片和微核等都可能出現(xiàn)在亞二倍體峰內(nèi)。因此，此法的特異性較低。5.DNA斷裂點標(biāo)記：細胞凋亡時發(fā)生DNA斷裂，利用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)可以將dUTP標(biāo)記到斷裂點上，稱作原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)。此法有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種，前者的標(biāo)記物是FITC-dUTP，后者的標(biāo)記物是生物素(biotin)標(biāo)記的dUTP,需要再用FITC標(biāo)記的親和素(avidin)與生物素標(biāo)記的dUTP結(jié)合，使標(biāo)記反應(yīng)倍增，故間接標(biāo)記法靈敏度高，但操作較復(fù)雜。TUNEL還可以配合其它單抗同時進行細胞表型分析，或與DNA含量同時分析。TUNEL法因其靈敏度高而被廣泛采用。6細胞凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物檢測：細胞凋亡是一個多種基因參與的復(fù)雜過程,目前已知與bcl-2基因、c-myc基因、P53基因等有關(guān)，這些基因都有相關(guān)產(chǎn)物，目前針對這些相關(guān)產(chǎn)物已有單克隆抗體生產(chǎn)，應(yīng)用這些單抗，通過流式細胞儀可檢測造血細胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達水平，相互關(guān)系。流式細胞儀測定細胞凋亡方法、層次眾多，且具有快速、準(zhǔn)確特點，應(yīng)用十分廣泛。在實際應(yīng)用中應(yīng)注意采用多種方法結(jié)合使用，使結(jié)果更加可靠準(zhǔn)確。二十一.流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用細胞分選流式細胞儀能夠分選某一亞群細胞，分選純度＞95%。目前細胞分選主要用于研究，臨床應(yīng)用較少。血液學(xué)應(yīng)用最多的是造血干細胞的研究，最近隨著造血理論的深入研究關(guān)于造血干細胞究竟是否都是CD34+細胞出現(xiàn)一些爭論，實驗研究證明，CD34-造血干細胞較CD34+造血干細胞更具造血潛能，這些實驗研究所用的CD34-和CD34+細胞就是通過細胞分選獲得的。小鼠造血干細胞分選一般按lin-c-Kit+CD34+/lin-c-Kit+CD34-分選，人造血干細胞分選一般按lin-CD34+/lin-CD34-分選。為避免某些遺傳性血液病如海洋性貧血、異常血紅蛋白病的純合子出生，產(chǎn)前診斷非常重要，這些疾病的主要靶細胞是紅細胞，而孕婦血循環(huán)中存在著胎兒有核紅細胞，只是數(shù)量非常少，利用流式細胞儀可從孕婦血液中分選出胎兒有核紅細胞(分選條件：CD45-GPA+)進行基因分析，作出產(chǎn)前診斷。利用流式細胞儀分選免疫擔(dān)當(dāng)細胞進行細胞免疫學(xué)研究也是目前的熱門課題。總之，流式細胞儀能夠分選出你想得到的任何一亞群細胞，只要你想得到的某一亞群細胞有合適的單克隆抗體標(biāo)記，流式細胞儀的分選功能將得到越來越多的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用。二十二.流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用其他流式細胞儀可能在兩方面對骨髓增生異常綜合癥(MDS)有用，一是測定CD34陽性細胞數(shù)，以監(jiān)測病情，二是測定核蛋白增殖因子(PCNA)，有報告PCNA再在生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合癥、白血病三種疾病中表達有明顯差異，可輔助鑒別診斷。此外流式細胞儀也可檢耐藥蛋白，如肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)、多藥耐藥蛋白(MRP)、P170等。流式細胞儀也可檢測細胞因子，細胞內(nèi)細胞因子如白介素系列(IL-1—IL-14)，腫瘤壞死因子(TNF)，干擾素(IFN)等,只要用適當(dāng)?shù)拇蚩讋┘纯捎每股鲜黾毎蜃訂慰寺】贵w標(biāo)記后用流式細胞儀測定。參考文獻CoulterEducationCenter:TrainingGuide(EpicsEliteFlowCytometer),1994,USA.CoulterCorporation:Operater,sGuide(EpicsEliteFlowCytometer),1993,USA.Gray.J.W.Cellcycleanalysisusingflowcytometry.Int.J.Radiat.Biol.1986;49(2):237.Catovsky.D.etal.AClassificationofacuteleukemiafor1990s.AnnHematol1991;62:16.Bemard.A.Thelimitationsinutilizingphenotypicmarkerstodetectminimalresidualdiseasesi