液相色譜分析

關(guān)于液相色譜分析2023/5/18第1頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18一、HPLC發(fā)展歷史§3-1高效液相色譜法簡(jiǎn)介二、

特點(diǎn)高壓、高速、高效、高靈敏度經(jīng)典LCHPLC第2頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18§3-1高效液相色譜法簡(jiǎn)介三、種類四、應(yīng)用液-固色譜液-液色譜離子交換色譜凝膠色譜生化分析、食品分析、環(huán)境分析、醫(yī)藥分析……第3頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18五高效液相色譜儀組成第4頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18第5頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)流程圖第6頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18HPLC儀包括：高壓輸液裝置;進(jìn)樣系統(tǒng);分離系統(tǒng);檢測(cè)系統(tǒng);和數(shù)據(jù)處理裝置。此外還配有梯度淋洗、餾分收集器。

第7頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/181.高壓輸液系統(tǒng)1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器(Ni合金)，其孔約2m，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。

脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過(guò)脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過(guò)膜從溶劑中除去。第8頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/182）高壓泵：要求：密封性好、壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕種類：恒壓泵和恒流泵。恒壓泵（氣動(dòng)放大泵）：利用大面積的其他活塞驅(qū)動(dòng)小面積液體活塞面，按照活塞面積比，以很小的氣體壓力可達(dá)到相當(dāng)高的液壓把流動(dòng)相送入色譜柱。體積和重量都很大，現(xiàn)僅作為液相色譜柱的填裝泵使用

第9頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18恒流泵（往復(fù)泵）：是目前液相色譜使用最普遍的一種高壓泵，優(yōu)點(diǎn)是泵頭內(nèi)腔體積小，容易清洗，便于換溶劑。單頭往復(fù)泵：?jiǎn)晤^往復(fù)泵依靠變速同步電機(jī)驅(qū)動(dòng)曲軸，然后帶動(dòng)寶石柱前后往復(fù)運(yùn)動(dòng)，流動(dòng)相則從下面通過(guò)單向閥吸入泵體，并由上部通過(guò)單向閥送出。改變沖程頻率可以控制流速雙頭往復(fù)泵：由電機(jī)帶動(dòng)凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，兩個(gè)寶石柱塞桿隨之往復(fù)運(yùn)動(dòng)、吸入和送出流動(dòng)相。因?yàn)閮蓚€(gè)柱塞桿來(lái)回移動(dòng)有一個(gè)時(shí)間差，正好補(bǔ)償流動(dòng)相輸出的脈沖，使得流速相當(dāng)平穩(wěn)第10頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/182.梯度洗提裝置：梯度洗提：就是載液中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在分離過(guò)程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過(guò)載液中極性的變化來(lái)改變被分離組分的容量因子和選擇因子，以提高分離效果。應(yīng)用梯度洗提可以提高分離效果，縮短分析時(shí)間，提高分辨能力和定量分析的精度。注意：（1）溶劑純度高，以保證良好的重現(xiàn)性（2）溶劑需互溶，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相（3）每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)第11頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/183.進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣裝置包括兩種：1）微量注射器進(jìn)樣：第12頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/182）高壓定量進(jìn)樣閥：常用的為六通閥。進(jìn)樣量由樣品管控制，進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好。第13頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/184.色譜柱1）對(duì)色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長(zhǎng)多為15~30cm，內(nèi)徑為4.6或3.9mm標(biāo)準(zhǔn)柱。2）柱的填充：

主要采用勻漿法。常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；常用的填料是新型健合相填料，粒度3-10微米。

填充方法：填充時(shí)，先制作勻漿液，用流動(dòng)相充滿色譜柱及其延長(zhǎng)管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無(wú)空氣進(jìn)入。第14頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18

（l）紫外檢測(cè)器

（2）熒光檢測(cè)器

（3）示差折光率檢測(cè)器

（4）電導(dǎo)檢測(cè)器

5.檢測(cè)器作用？——將經(jīng)色譜柱分離后的各組分按其特性及含量轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的電信號(hào)。HPLC檢測(cè)器類型第15頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18

特點(diǎn)：靈敏度高，最小檢測(cè)濃度達(dá)10-9g/mL；流通池體積?。ㄈ莘e8-10μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫

應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)(1).紫外檢測(cè)器（Ultrvioletphotometricdetector）第16頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18第17頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18紫外普通檢測(cè)器和光電二極管陣列檢測(cè)器的比較普通檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器第18頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18波長(zhǎng)可的松氟美松皮質(zhì)酮由光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)所獲得的三維色譜-光譜圖。利用色譜保留值及光譜特征吸收曲線綜合進(jìn)行定性分析。第19頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18(2).熒光檢測(cè)器（fluorescencedetector）特點(diǎn)：高靈敏度，最小檢測(cè)濃度達(dá)10-11g/mL；高選擇性，對(duì)具有共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)芳環(huán)分子(剛性結(jié)構(gòu)強(qiáng))有響應(yīng)。

如多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、甾類化合物等有響應(yīng).第20頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18(3).示差折光檢測(cè)器（differentialrefractiveindexdetector）檢測(cè)原理：連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與流動(dòng)相中的組分濃度成正比；第21頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18通用型檢測(cè)器（不同的物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；

靈敏度低10-7g/mL。對(duì)溫度敏感(檢測(cè)器溫度應(yīng)控制在±10-3℃)梯度洗脫會(huì)造成流動(dòng)相折光指數(shù)不斷變化，故不能用于梯度洗脫。

特點(diǎn)：第22頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18電導(dǎo)檢測(cè)器屬于電化學(xué)檢測(cè)器，主要用于離子色譜的檢測(cè)。檢測(cè)原理：基于待測(cè)物在一些介質(zhì)中解離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)變化來(lái)測(cè)量解離物質(zhì)的含量。特點(diǎn)：通用型檢測(cè)器，檢測(cè)靈敏度低。背景電導(dǎo)低時(shí)，采用雙電極電導(dǎo)檢測(cè)器(p90,圖3-13）。當(dāng)背景電導(dǎo)大時(shí)，應(yīng)采用五電極式電導(dǎo)檢測(cè)器(p91,圖3-15)

響應(yīng)受溫度影響較大，需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。當(dāng)pH>7時(shí)，該檢測(cè)器不夠靈敏。

(4).電導(dǎo)檢測(cè)器（electricalconductivitydetector）第23頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18

在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，而只有兩項(xiàng)，即：

H=A+Cu

如圖所示：H～u曲線是一段斜率不大的直線。而在高的流動(dòng)相流速下不致于使柱效損失太大，所以在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要參數(shù)。流速大于0.5cm/s時(shí),降低流速，柱效提高不是很大。§3-3影響HPLC分離的因素第24頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18A─渦流擴(kuò)散項(xiàng)

A=2λdp

dp：固定相的平均顆粒直徑λ：固定相的填充不均勻因子Cu─傳質(zhì)阻力項(xiàng)傳質(zhì)阻力包括固定相傳質(zhì)阻力Cs和流動(dòng)相傳質(zhì)阻力Cm(包括在流動(dòng)的流動(dòng)相中的傳質(zhì)和滯留的流動(dòng)相中的傳質(zhì))：

C=（Cs+Cm+Csm）柱內(nèi)色譜峰展寬引起H的變化：第25頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18提高液相色譜的柱效方法：

柱填充顆粒小且均勻；流動(dòng)相流速較低，粘度要??；柱溫高

流速選擇原則：柱效損失不太大的前提下提高流動(dòng)相流速以實(shí)現(xiàn)快速分離。第26頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18影響色譜峰擴(kuò)展的因素的柱外因素：

柱前展寬：由進(jìn)樣引起。若將試樣直接注入到色譜柱頂端填料中心點(diǎn)，或注入到填料中心之內(nèi)1-2mm處，可減小柱前展寬，提高柱效。

柱后展寬：由接管，檢測(cè)器流通池的死體積所引起。第27頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18一、液—液分配色譜原理

根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的液體中溶解度不同，具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過(guò)程。

§3-4高效液相色譜的主要類型及分離原理按分離原理，HPLC分離的主要類型？

用于各種樣品類型的分離和分析，無(wú)論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。2.應(yīng)用第28頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/183.固定相

液液色譜的固定相選擇較簡(jiǎn)單，常用的只有幾種，如,’-氧二丙腈、聚乙二醇、十八烷(C18)、角鯊?fù)?。固定相涂漬方法:1）機(jī)械涂漬固定相：將固定液通過(guò)機(jī)械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體上(5-10%涂布量)。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。

如何減少固定液的流失？

機(jī)械涂漬型和化學(xué)鍵合型。第29頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18

如何減少固定液的流失？方法一、固定相和流動(dòng)相之間溶解度越小越好（兩者極性差別越大越好）

方法二、在柱前加一根很短的前置柱(該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動(dòng)相進(jìn)入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和)或?qū)⒐潭ㄒ航『系捷d體上。方法三、使固定液在擔(dān)體上結(jié)合更牢固第30頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/182）化學(xué)鍵合固定相通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將各種不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到載體(硅膠)表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。這種固定相分離機(jī)理：液液分配？雙重分離機(jī)制，即液液分配+吸附取決于化學(xué)鍵合的表面覆蓋率。

高覆蓋率：液液分配為主；低覆蓋率：吸附為主?；瘜W(xué)鍵合固定相的類型：第31頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18化學(xué)鍵合固定相類型

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N第32頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/184.流動(dòng)相:

在液液色譜中，為防止固定相的流失，流動(dòng)相液體與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說(shuō)二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜（流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和反相分配色譜（流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）。反相健合相色譜法固定相:硅膠一C18H37、硅膠一苯基等流動(dòng)相:甲醇\乙睛一水、水+無(wú)機(jī)鹽buf溶液等正相健合相色譜法固定相:硅膠一OH、硅膠一CN等流動(dòng)相:正已烷中加入適量極性溶劑,如氯仿\醇等第33頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18A>B>C正相色譜低極性流動(dòng)相反相色譜高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系?待測(cè)物極性：第34頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18二、液固吸附色譜

固定相:固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，粒度5～10μm。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。作用機(jī)理：根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來(lái)進(jìn)行分離的。當(dāng)流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱后，它以單分子層S形式占據(jù)吸附劑上的活性中心點(diǎn)，當(dāng)試樣分子X(jué)進(jìn)入色譜柱后，在遷移過(guò)程中，與流動(dòng)相分子在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附反應(yīng)：這種競(jìng)爭(zhēng)吸附達(dá)平衡時(shí)，吸附的分配系數(shù)K為：K越大，溶質(zhì)分子的吸附性強(qiáng)，保留值大。應(yīng)用：相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性樣品，不同官能團(tuán)化合物、異構(gòu)體。

第35頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18三、離子對(duì)色譜法（IPC）

原理主要是基于待測(cè)組分在分析柱上的吸附作用不同而進(jìn)行分離的。將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì)化合物，利用它在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離。

固定相疏水性的苯乙烯、二乙烯苯樹脂或鍵合的硅膠流動(dòng)相水+離子對(duì)試劑+有機(jī)溶劑

離子對(duì)試劑所帶電荷與待測(cè)離子相反的離子第36頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18可以通過(guò)改變對(duì)離子的濃度和種類，流動(dòng)相的類型、濃度及pH值從而改變分離的選擇性，解決難分離混合物的分離問(wèn)題。平衡常數(shù)KXY為:

根據(jù)分配系數(shù)的定義，溶質(zhì)的分配系數(shù)D為：例如：固定相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液，于流動(dòng)相中加入與待測(cè)離子X(jué)+有相反電荷的離子Y-：

第37頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/182離子對(duì)試劑的選擇（1）分離親水性離子——選用疏水性離子對(duì)試劑分離疏水性離子——選用親水性離子對(duì)試劑（2）相對(duì)分子量較小的離子對(duì)試劑比分子量的分離效果更好第38頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18思考題：有一強(qiáng)極性有機(jī)酸混合物，若用離子對(duì)色譜法分離，請(qǐng)問(wèn)在流動(dòng)相中應(yīng)加入陰離子還是陽(yáng)離子來(lái)形成離子對(duì)？離子對(duì)色譜法的應(yīng)用分離大分子量的陰、陽(yáng)離子，特別是帶局部電荷的大分子及疏水性陰、陽(yáng)離子。包括陰陽(yáng)離子表面活性劑，大分子脂肪羧酸、烷基磺酸鹽和芳香硫酸鹽、季銨化合物、水溶性維生素、酚類等第39頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18

IEC是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。四、離子交換色譜（IEC）1.原理固定相為離子交換樹脂，可解離出離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。第40頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18第41頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/182.固定相作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。第42頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18一般形式：R一A＋B＝R－B＋A

對(duì)于典型的磺酸型陽(yáng)離子交換樹脂，一價(jià)離子的對(duì)樹脂的親和力大小順序?yàn)椋篊s+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二價(jià)離子的順序?yàn)椋築a2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+對(duì)于季銨型陰離子交換樹指，陰離子的選擇性順序?yàn)椋?/p>

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞IO3-＞CH3COO-＞F-第43頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。4.應(yīng)用3.流動(dòng)相

鹽類緩沖溶液（有一定pH和離子強(qiáng)度）。通過(guò)改變流動(dòng)相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。第44頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18產(chǎn)生背景：離子交換色譜法淋洗液幾乎都是強(qiáng)電解質(zhì)，電導(dǎo)比待測(cè)離子高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，被測(cè)離子的電導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)電解質(zhì)流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)信號(hào)掩沒(méi)而無(wú)法用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)；而多數(shù)無(wú)機(jī)離子沒(méi)有紫外吸收，不能用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。

五、離子色譜離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來(lái)的一種分離方法。第45頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18

例如：分析陰離子時(shí)，則發(fā)生下列反應(yīng)：R+—OH+NaBr

R+—Br-+NaOH流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)如何轉(zhuǎn)化成低的背景電導(dǎo)？1975年，美國(guó)DOWChemical公司H.Small等人引入抑制柱（SuppressorColumn）第46頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18

R—H++NaOH

R—Na++H2OR—H++NaBr(待測(cè)物)R—Na++HBr

由反應(yīng)可見(jiàn)：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量堿轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陽(yáng)離子Br-轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酸HBr，提高了檢測(cè)靈敏度。

在分離柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過(guò)抑制柱后會(huì)加寬，降低了分離度。后來(lái)，F(xiàn)rits等人提出采用電導(dǎo)率極低的流動(dòng)相溶液，例如用1×10-4～5×10-4mol/L苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動(dòng)相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。第47頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18六、空間排阻色譜法（SEC）又稱凝膠色譜法，主要用于大分子的分離。凝膠滲透色譜法：以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，多用于高分子領(lǐng)域，測(cè)定聚合物分子量分布或跟蹤聚合物合成、降解反應(yīng)。凝膠過(guò)濾色譜法：以水或水溶液為流動(dòng)相，多用于生化領(lǐng)域分離天然高分子。1.分離原理基于待測(cè)物分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離

固定相：為化學(xué)惰性、具有一定孔徑的多孔凝膠（孔徑：數(shù)nm~數(shù)百nm，大于分子篩的孔徑）。第48頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18凝膠內(nèi)有一定大小的空穴，體積大的待測(cè)物分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子基本上按其分子大小，先后由柱中流出。第49頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18

2.特點(diǎn)

（1）保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)；

（2）保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)；（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。因此柱壽命長(zhǎng)。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對(duì)分子質(zhì)量差別必須大于10％才能得以分離。第50頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/183.固定相類型固定相流動(dòng)相特點(diǎn)應(yīng)用軟性凝膠葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠以水溶性溶劑作流動(dòng)相微孔能吸入大量的溶劑，不適宜用在HPLC用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析半剛性凝膠高交聯(lián)度的聚苯乙烯、聚乙酸酯以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相溶脹性不如軟性凝膠，用于HPLC時(shí)，流速不宜大用于大分子質(zhì)量物質(zhì)的分析剛性凝膠多孔硅膠、多孔玻璃既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相剛性大，溶脹小可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作用于大分子質(zhì)量物質(zhì)的分析第51頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/184.流動(dòng)相第52頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18§3-7高效液相色譜分離類型的選擇第53頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/181．根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇相對(duì)分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對(duì)分子質(zhì)量范圍是20O～2000。對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量大于2000的樣品，用排阻色譜法為最佳。2．根據(jù)樣品溶解度選擇弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度。如果樣品可溶于水且能離解，采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類(如苯或異辛烷)，則可采用液一固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時(shí)，常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動(dòng)相，以憎水性化合物作固定相。第54頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/183．根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇用紅外光譜法，可預(yù)先簡(jiǎn)單地判斷樣品中存在什么官能團(tuán)。然后，確定采用什么方法合適。例如:酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液一液分配色譜、液一固吸附色譜；異構(gòu)體用液一固吸附色譜；同系物不同官能團(tuán)及強(qiáng)氫鍵的用液一液分配色譜。現(xiàn)列出表3-3作為選擇分離類型的參考。第55頁(yè)，課件共59頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2023/5/18

表3-3液相色譜分離類型選擇參考表

相對(duì)分子質(zhì)量溶于水——排阻色譜，水為流動(dòng)相＞2000不溶于水——排阻色譜，非水流動(dòng)相同系物——分配色譜不溶于水異構(gòu)體——吸