DNA甲基化檢測方法演示文稿

DNA甲基化檢測方法演示文稿目前一頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)DNA甲基化檢測方法總覽目前二頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)

主要檢測途徑基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法(金標(biāo)準(zhǔn))不基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法目前三頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法質(zhì)譜分析水解核苷酸質(zhì)譜分析目前四頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的甲基化分析原理1目前五頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的甲基化分析原理2目前六頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)

應(yīng)用一:直接測序法（Directsequencing)

用于甲基化分析的樣本常常是混合樣本，不適合直接直接進(jìn)行sanger測序分析目前七頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)

直接測序法目前八頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)圖6PMVK基因擴(kuò)增產(chǎn)物反向測序結(jié)果目前九頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)圖7TRIB3基因擴(kuò)增產(chǎn)物正向測序結(jié)果目前十頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用二：重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序(Bisulfite-sequencePCR，BSP)目前十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)目前十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)

注：A：癌組織；B：癌旁組織；○-：未甲基化；●：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43BBSP克隆測序結(jié)果目前十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)BSP克隆測序甲基化率三維圖形目前十四頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):能準(zhǔn)確的檢測出每個(gè)DNA分子單倍體型的

甲基化狀態(tài)，同時(shí)能分析不同CpG位點(diǎn)之間

的甲基化狀態(tài)的聯(lián)系。缺點(diǎn)：需要對PCR產(chǎn)物克隆，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)

力，克隆子的數(shù)目影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

測序重復(fù)性差。目前十五頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用三：甲基化特異性PCR(methylafion-specificPCR，MS-PCR)目前十六頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)目前十七頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)目前十八頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)UMUMUMladder100150200250MSP法檢測抑癌基因RASSF1A啟動子區(qū)的甲基化圖MSP檢測組織切片DNA甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果，U為非甲基化，M為甲基化。目前十九頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)

MSP擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖研究結(jié)果注：M表示甲基化，U表示未甲基化

B1-B6為高脂血癥組六例標(biāo)本，D1-D5為正常對照組五例標(biāo)本；H2O為陰性對照；m為50bpMarker。SREBP-1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)目前二十頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)甲基化特異性PCR優(yōu)點(diǎn)：①操作簡便；②敏感性高；③Nested-MSP提高靈敏度，便于分析微量檢材缺點(diǎn)：①引物設(shè)計(jì)要求高；②只能作定性研究；③存在重亞硫酸鹽處理不完全導(dǎo)致的假陽性；④只能了解部分位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。目前二十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)MethyLight對MSP的產(chǎn)物用Taqman探針進(jìn)行qPCR，從而實(shí)現(xiàn)甲基化的定量分析。優(yōu)點(diǎn)：增加了重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化和DNA復(fù)性的質(zhì)控對照

避免了電泳、酶切等操作缺點(diǎn)：PCRbias目前二十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用四：結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)目前二十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法目前二十四頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)基于限制性內(nèi)切酶的工具酶甲基化特異性的限制性內(nèi)切酶(MDRE)：可以識別甲基化的胞嘧啶甲基化敏感性的限制性內(nèi)切酶(MSRE)：可以識別甲基化的胞嘧啶目前二十五頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法目前二十六頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)MSRE-PCR原理圖1-1MSRE-PCR原理圖注：左圖DNA無甲基化,DNA被切斷,無法得到PCR產(chǎn)物;右圖DNA有甲基化,DNA保持完整,可以獲得PCR產(chǎn)物.目前二十七頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用舉例二：采用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶技術(shù)結(jié)合PCR的方法（MSRE-PCR）篩選在肝癌與癌旁組織中有甲基化差異的基因。目前二十八頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)圖1-3：DNM基因瓊脂糖凝膠電泳圖M21AE17B17BE17A17AE21A空21B21BE100bp250bp150bp400bp500bp注：M：Marker；E：加酶體系；A：癌組織；B：癌旁組織；空：水空白目前二十九頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)酶識別位點(diǎn)內(nèi)含有一個(gè)及以上CpG位點(diǎn)應(yīng)用條件：目前三十頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法優(yōu)點(diǎn)：①方法相對簡單；②可進(jìn)行甲基化水平的定量研究；③需要樣本量少。目前三十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)缺點(diǎn)：①由于CG僅限于內(nèi)切酶識別序列中，因此非識別序列的CG將被忽略；②只有檢測與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時(shí)，該檢測方法的結(jié)果才有意義；④存在酶消化不完全引起的假陽性的問題；結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法目前三十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用五：RestrictionDigestionandReal-TimePCR(qAMP)目前三十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)基本步驟目前三十四頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)舉例：Theevalutionofdifferentiallymethylatedregion(MDR)ofimprintedgeneU2af1-rs1,intestisandliverofmousePrimeraredesigned

toflankNotl(N),Hhal(Hh),andMcrBc(M)RestrictionsitesintheDMRregion.目前三十五頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)LiverandtestisgenomicDNAtemplatesarePCRamplicatedfollowingdigestionwithnoenzyme(sham),Notl,Hhal(Hh)orMcrBc.AmplicationusingasecondprimerpairthathasbeendesignedtoasequencedevoidOfrestrictionsitesdemonstratesthatthetemplatesareofequalconcentration.目前三十六頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)ThedifferenceintheCt

valueofanenzyme-digestedtemplaterelativetothesham-digestedtemplatedeterminatesthelevelsofDNAmethylationineachtissue.MSREMDRE目前三十七頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)

應(yīng)用六：基于親和純化的甲基化分析方法

目前三十八頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)

基于親和純化的甲基化分析方法

目前三十九頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)目前四十頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用七：ChIP-Seq技術(shù)

目前四十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)ChIP-Seq

目前四十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用八：芯片技術(shù)在甲基化檢測中的應(yīng)用目前四十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)啟動子區(qū)甲基化芯片技術(shù)目前四十四頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)基因芯片雜交信號圖目前四十五頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)目前四十六頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)目前四十七頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用九、質(zhì)譜技術(shù)（MassSpectromericAnalysisofCytosineMethylationbyBase-SpecificCleavageandPrimerExtensionMethods）目前四十八頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)如圖所示切下的每個(gè)片段含有一個(gè)或兩個(gè)CpG位點(diǎn)，在質(zhì)譜圖上甲基化片段和未甲基化片段大小相差16Da或32DaBase-SpecificCleavage目前四十九頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)PrimerExtensionMethods目前五十頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)如圖所示，用ddC和ddT終止延伸后，在質(zhì)譜圖上顯示出甲基化組（ddC）和未甲基化組(ddT)的質(zhì)譜峰,二者相差16Da。目前五十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)Base-SpecificCleavage檢測的是一個(gè)酶切后片段的甲基化狀態(tài)，用于在長片段DNA序列（如基因啟動子區(qū)域）中篩選甲基化位點(diǎn)并確定每個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化程度，而在基因的甲基化譜確定后可以用PrimerExtensionMethods精確的對每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度進(jìn)行定量檢測，PrimerExtensionMethods最多可以實(shí)現(xiàn)25個(gè)位點(diǎn)同時(shí)檢測。目前五十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)質(zhì)譜法檢測的優(yōu)勢：靈敏度準(zhǔn)確性高。操作較簡便。局限性：DNA樣本要求純度較高，提取過程中的小離子，未消化完全的蛋白，RNA對結(jié)果有干擾作用。需用質(zhì)譜儀。目前五十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用十、甲基化敏感性單核苷酸引物延伸法（methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension(Ms-SNuPE)）目前五十四頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)擴(kuò)增基因組DNA樣本重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ExoSAP消化PCR引物延伸加入SNP引物和SNaPshotMixSNP引物延伸(加入ddT或ddC)SAP處理分析310/3100樣本準(zhǔn)備加入GS120LIZ內(nèi)標(biāo)ABI310/3100電泳選用E5和POP4膠數(shù)據(jù)分析（GeneScan）樣本分型（Genotyper或GeneMapperID）步驟目前五十五頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)123456這是一個(gè)多重SNaPshot的檢測結(jié)果，總共檢測了6個(gè)CpG位點(diǎn)，陰影峰代表甲基化的C，空白峰代表未甲基化C。位點(diǎn)1、2和4顯示大約50%的甲基化率，而位點(diǎn)3、5和6顯示0的甲基化率。目前五十六頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用十一：高分辨熔解曲線分析

MS-HRM

目前五十七頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)HRM技術(shù)：用于篩選大量樣本，獲得感興趣的CpG位點(diǎn)鑒定感興趣的CpG島。目前五十八頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)HRM技術(shù)原理目前五十九頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)HRM技術(shù)原理目前六十頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)HRM特點(diǎn)高靈敏性：可檢測低達(dá)0.1%甲基化程度。高通量：1次可同時(shí)檢測不超過384樣本，適用于大樣本多位點(diǎn)甲基化掃描。高重復(fù)性：重復(fù)性100%。使用范圍廣：不受堿基位點(diǎn)局限。

操作簡便：只需設(shè)計(jì)特異引物，無須序列特異性探針，無需測序。標(biāo)本范圍廣：可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本，也可用于微量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等非手術(shù)標(biāo)本的檢測。缺點(diǎn)：檢測序列長度不應(yīng)超過100bp；

只能進(jìn)行半定量檢測目前六十一頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用十二：焦磷酸測序法目前六十二頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)焦磷酸測序法（Pyrosequencing）目前六十三頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)焦磷酸測序法（Pyrosequencing）目前六十四頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)焦磷酸測序目前六十五頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)焦磷酸測序目前六十六頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)焦磷酸測序目前六十七頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)焦磷酸測序的優(yōu)勢：靈敏度高，可測到鄰近CpG區(qū)域的單個(gè)甲基化水平，甚至包括測序的引物區(qū)域。除常規(guī)的檢測位點(diǎn)變化情況外，還可準(zhǔn)確計(jì)算頻率變化。

對于檢測位點(diǎn)要求低，可檢測未知序列信息，覆蓋到人類基因組的所有CpG位點(diǎn)；對于樣品要求低，適用于新鮮、冷凍和FFPE樣本。目前六十八頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)目前六十九頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)應(yīng)用十三：QuantificationofMethylatedDNAbyHeavyMethylDuplexPCR目前七十頁\總數(shù)七十二頁\編于十二點(diǎn)PrincipleofHeavyMethyl(A)WhentheDNAismethylated,theblockeroligonucleotides(solidblack)donotbind,leavingtheprimerbindingsiteaccessiblefortheprimers(grayarrows)tobindandamplifythetarget.Theamplicationisdetectedwithamethylationspecificoligonucleotideprobe[solidblack,labeledwithfuorescen