chap基因操作常規(guī)技術(shù)

第四章基因工程的常規(guī)技術(shù)?分離檢測(cè)?分子雜交?PCR技術(shù)

?DNA測(cè)序

?基因定點(diǎn)突變

?DNA與Pr互作目前一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.1核酸的分離與檢測(cè)gDNA的分離質(zhì)粒DNARNA的分離目前二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)細(xì)胞破碎去蛋白DNA沉淀4.1.1gDNA的提取SDS法酚抽提法CTAB法目前三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)CTAB法高鹽:溶解低鹽:沉淀蛋白、多糖分離NaAc-70%alc目前四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)如何保持CS-DNA的完整性?物理降解內(nèi)源DNase＞pH7目前五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.1.2質(zhì)粒DNA的分離純化拓?fù)鋵W(xué)的差異gDNA大,易解旋質(zhì)粒小,ccc狀態(tài)目前六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs1.CsCl密度梯度超離心密度梯度沉降=擴(kuò)散浮力密度差樣品+EB樣品BD=該位置上的CsCl密度位置分布:沉降速度、MW及離心時(shí)間目前七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)SolI;II;IIIcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA2.堿變性法pH12:變性程度pH7:復(fù)性速度離心:收集?目前八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)3.沸水浴法加酶破壁沸水浴40s離心Eth沉淀

目前九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.1.3RNA的提取原理酚-異硫氰酸胍目前十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)防止RNA降解的措施DEPC處理RNasin專用無菌臺(tái)器皿、手套、口罩低溫操作目前十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.1.4核酸質(zhì)量檢測(cè)紫外光譜法凝膠電泳法[ssDNA]=33(A260A310)

稀釋[dsDNA]=50(A260A310)

稀釋[ssRNA]=40(A260A310)

稀釋熒光分析法二苯胺顯色目前十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)分子篩;電荷效應(yīng)UV→EB→熒光凝膠電泳技術(shù)目前十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)凝膠成像系統(tǒng)目前十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)Rf、分辨力的影響因素大小,構(gòu)型gel濃度電壓、時(shí)間buffer凝膠濃度片段大小/kb0.35600.61100.70.8201.00.581.20.40.12目前十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)緩沖液及其pHTBE:緩沖力大?長:TAE﹥TBE?短:TAE分辨力低如何防止pH和離子強(qiáng)度改變?目前十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)RNA的檢測(cè)A260變性膠28S→4.5kb18S→2.1kb目前十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)PAGE尿素buffer:0.51TBE同位素或熒光標(biāo)記測(cè)序、多態(tài)性分析目前十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)＞40kb:Rf與分子大小無關(guān)交替改變的電場,線團(tuán)→束狀脈沖場凝膠電泳改變形狀所需時(shí)間不同膠孔中摩擦力不同A-+AB-+B目前二十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖目前二十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前二十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)A-+AB-+B垂直交變電場系統(tǒng)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強(qiáng)電場系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+目前二十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)影響分辨率的因素脈沖時(shí)間(0.1s-1000s):長脈沖,大片段電壓:場強(qiáng)↑,最大片段范圍↑電場夾角:110–120溫度:4℃

目前二十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.2分子雜交技術(shù)SouthernblotNorthernblotWesternblotdotblotFISH菌落原位雜交目前二十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.2.1

探針與探針標(biāo)記寡核苷酸片段ssords足夠長度不含互補(bǔ)區(qū)目前二十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

Mg2+5dNTP5pppdA(-32P-dATP)5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’

DNaseIDNApolI1.探針的標(biāo)記目前二十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)隨機(jī)引物標(biāo)記目前二十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)5末端標(biāo)記5

HOOH3

OH5

T4-PNKMg2+

pppATP

(-32P-dATP)5pp5

3

HO3

HOOH3

目前二十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)2.

標(biāo)記物及其檢測(cè)標(biāo)記物及性質(zhì)標(biāo)記方法雜交體檢測(cè)法地高辛:DIGRPL酶標(biāo)抗體-底物顯色生物素:Bio-16-dUTPNT,TL,PCR酶標(biāo)親合素顯色熒光素:羅丹明,FITC合成法熒光顯微鏡放射性標(biāo)記非放射性目前三十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)地高辛系統(tǒng)標(biāo)記dUTP-連接臂-甾醇半抗原DIG抗體-顯色酶交聯(lián)復(fù)合物目前三十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前三十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)生物素標(biāo)記GCTTGAGCAGTAACCTG顯色酶Biotin

Avidin

烷烴連接臂生色底物顏色產(chǎn)物目前三十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前三十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)熒光素標(biāo)記GCTTGAGCAGTAACCTG熒光素Biotin

Avidin烷烴連接臂目前三十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前三十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.2.2

Southern雜交質(zhì)粒鑒定、基因位置、分子診斷酶切和電泳法可以嗎?目前三十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前三十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.2.3Northern雜交樣品,電泳,探針?不宜堿變性?勿低鹽buffer洗膜?膠中無EB目前三十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.2.4Western雜交電泳,印跡,免疫學(xué)主要步驟SDS,blot雜交(AP或HRP)目前四十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)Semi-drytransfersystem目前四十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前四十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)斑點(diǎn)雜交4.2.5目前四十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)Allele-specificoligonucleotide(ASO)dot-blothybridizationcanidentifyindividualswiththesicklecellmutation.Theschematicdot-blotattopshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthenormal-globinallele(A-ASO).Theresultsarepositive(filledcircle)fornormalindividualsandforheterozygotesbutnegativeforsicklecellhomozygotes(dashed,unfilledcircle).Thedot-blotatthebottomshowstheresultofprobingwithanASOspecificforthesicklecell-globinallele(S-ASO),andinthiscasetheresultsarepositiveforthesicklecellhomozygotesandheterozygotesbutnegativefornormalindividuals.TheA-andS-ASOweredesignedtobe19nucleotideslonginthiscasechosenfromcodons3to9ofrespectivelythesenseAandSglobingenesequencessurroundingthesicklecellmutationsite.Thelatterisasinglenucleotidesubstitution(A→T)atcodon6inthe-globingene,resultinginaGAG(Glu)→GTG(Val)substitution(seemiddlesequences).目前四十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)制片探針制備雜交鏡檢、拍照4.2.6

FISH雜交目前四十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)基因檢測(cè)新技術(shù)使膀胱癌確診提前“FISH技術(shù)在膀胱癌檢測(cè)中的臨床應(yīng)用研究”,為期2年,對(duì)4809例患者開展了臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn).結(jié)果:比臨床常規(guī)檢查,膀胱癌確診提前36m雜交探針和檢測(cè)試劑已實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化,質(zhì)量穩(wěn)定可靠,價(jià)格比進(jìn)口產(chǎn)品降低近七成目前四十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.2.7菌落(斑)原位雜交陽性重組子檢測(cè)菌落→?文庫菌斑→?文庫目前四十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.3PCR擴(kuò)增技術(shù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)動(dòng)物單拷貝GSinceitsdiscoveryin1983thepolymerasechainreactionhasrevolutionizedmolecularbiology.Today,newformsofPCRandtherelatedtechniquesofcloningarefindingnewapplicationsatthecuttingedgeofbiomedicine.

目前四十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.3.1基本原理離體合成幾何級(jí)數(shù)平臺(tái)效應(yīng)目前四十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.3.2反應(yīng)體系模板引物Taq酶dNTPs緩沖液DNAormRNA模板純度數(shù)量目前五十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)引物的設(shè)計(jì)1630nt,GC含量連續(xù)互補(bǔ)堿基﹤3

3?正確配對(duì)5?可被修飾簡并引物目前五十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)耐熱的DNApolTaq酶Pfu酶?3→5校讀?高保真目前五十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)緩沖液pH、離子強(qiáng)度Mg2+↓,酶活↓Mg2+↑,非特異↑引物退火目前五十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.3.2基本過程變性退火延伸目前五十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)擴(kuò)增精確性的影響因素引物:1mol/LdNTPs:20~200mol/LMg+2:0.5~2.5mmol/Lhotstart目前五十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.3.3PCR技術(shù)的改進(jìn)nestedPCRinversePCRanchoredPCRRT-PCRinsituPCR實(shí)時(shí)定量PCR目前五十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)1.巢式PCR嵌套引物外引物內(nèi)引物目前五十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)2.

反向PCRX、Y未知序列酶R消化環(huán)化再酶切擴(kuò)增目前五十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)反向PCR的特點(diǎn)難選適當(dāng)?shù)南拗泼笖U(kuò)增的長度有限自身環(huán)化效率低目前五十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)3.AnchoredPCR?錨定引物A?擴(kuò)增?產(chǎn)物鑒定目前六十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)特點(diǎn)擴(kuò)增未知序列無需酶切及連接操作簡單特異性高目前六十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.RT-PCR目前六十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)5.原位PCR原位擴(kuò)增,雜交,定量?不需抽提模板?靈敏度高100?病毒檢測(cè)、腫瘤發(fā)生率目前六十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量分析的方法6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR目前六十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)FRET技術(shù);熒光標(biāo)記探針擴(kuò)增、雜交、光譜、實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)積累,起始模板量熒光定量PCR的原理目前六十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)起點(diǎn)定量與終點(diǎn)定量起點(diǎn)天然重現(xiàn)性好終點(diǎn)加工誤差大目前六十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)熒光擴(kuò)增曲線的三個(gè)階段背景信號(hào)階段指數(shù)擴(kuò)增平臺(tái)期目前六十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)幾個(gè)參數(shù)的確定①臨界點(diǎn)②循環(huán)數(shù)(Ct)③標(biāo)準(zhǔn)曲線基線→閾值→Ct值→DNA0閾值缺省:3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍目前六十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)Log濃度與循環(huán)數(shù)的關(guān)系起始數(shù)越多,Ct值越小標(biāo)準(zhǔn)曲線→樣品Ct值→初始模板量目前六十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記TaqMan探針分子信標(biāo)目前七十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)①SYBRGreen法只有和dsDNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時(shí),DNA雙鏈分開,無熒光目前七十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)延伸結(jié)束階段采集熒光信號(hào)與非特異的dsDNA結(jié)合發(fā)光,必須在反應(yīng)結(jié)束時(shí)做融解曲線分析目前七十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)SYBRGreen融解曲線分析目前七十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化染料:太高抑制Taq酶活性;太低,熒光信號(hào)太弱,不易檢測(cè)引物:擴(kuò)增有雜帶,定量不準(zhǔn)Mg2+:1.5mM,減少非特異性產(chǎn)物T&T:由酶和引物決定目前七十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)模板無選擇性使用方便,無需探針靈敏;便宜非特異性結(jié)合,產(chǎn)生假陽性對(duì)引物特異性要求較高目前七十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)5-R;3熒光淬滅基團(tuán)(Q)探針完整,R發(fā)射的熒光能量被Q吸收,無熒光;R與Q分開,發(fā)熒光Taq酶:5→3外切酶活性②TaqMan法目前七十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)TaqMan水解型雜交探針原理當(dāng)一個(gè)熒光分子(供體)的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子(受體)的激發(fā)光譜相重疊時(shí),供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減,FRET目前七十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移目前七十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)擴(kuò)增1條DNA→釋放1個(gè)熒光分子→熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物同步目前七十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)TaqMan法PCR反應(yīng)的建立PP的設(shè)計(jì):探針Tm為70℃,<30bp,5’非G;引物Tm為60℃反應(yīng)參數(shù):

95℃3,94℃15s,60℃60s,40循環(huán)PP優(yōu)化:獲得最小Ct值,最大信號(hào)/背景比值primer:

50-900nM;probe:50-250nM目前八十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列的高特異性引物設(shè)計(jì)相對(duì)簡單重復(fù)性比較好只適合一個(gè)特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記,價(jià)格較高目前八十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)③分子信標(biāo)與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合產(chǎn)生熒光,信號(hào)的強(qiáng)弱→靶序列的多少目前八十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)發(fā)夾型熒光探針R與Q接近,產(chǎn)生FRET探針-模板配對(duì),構(gòu)象改變R與Q分離→熒光目前八十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)熒光定量PCR的特點(diǎn)實(shí)時(shí)檢測(cè)特異性強(qiáng)定量精確無需跑膠目前八十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.4DNA測(cè)序化學(xué)降解法末端終止法目前八十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)G反應(yīng):DMS使G、A甲基化G+A:哌啶使G斷裂T+C:肼使嘧啶環(huán)斷開,哌啶除去堿基C反應(yīng):高鹽下,僅C與肼反應(yīng),C末端

1.Maxam-Gilbert化學(xué)降解法目前八十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前八十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)距標(biāo)記末端250nt非酶促合成測(cè)序,無需引物對(duì)合成的寡核苷酸測(cè)序蛋白質(zhì)與DNA的相互作用特點(diǎn)目前八十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)2.Sanger酶學(xué)法目前八十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)基本步驟模板純化測(cè)序反應(yīng)模板,引物,Pol,

dNTPs(dd)4個(gè)反應(yīng)→4組產(chǎn)物PAGE→自顯影→X光片上樣電泳放射自顯影目前九十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前九十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)測(cè)序與PCR的比較測(cè)序PCR引物1條1對(duì)合成線性指數(shù)底物dNTP和dddNTP產(chǎn)物系列長度片段1條帶目前九十二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)CAGTtemplateprimerdATP,dNTPpolymeraseterminator3.DNA全自動(dòng)測(cè)序同位素標(biāo)記熒光標(biāo)記?單色熒光?多色熒光目前九十三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)時(shí)間長序列短污染大操作難放射自顯影膠圖目前九十四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前九十五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)多色熒光標(biāo)記templateprimerdNTPpolymeraseterminatorCGTA目前九十六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)ABIPrism3100-Avant目前九十七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)遺傳分析儀的多種應(yīng)用目前九十八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)基本步驟模板的純化與定量測(cè)序反應(yīng)—PCR儀產(chǎn)物的純化與變性上樣電泳—測(cè)序儀結(jié)果分析目前九十九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)AutomatedDNAsequencingwithfluorescentlylabeledddNTP.(A)Thechainterminationreactionsarecarriedoutinasingletube,witheachddNTPlabeledwithadifferentfluorophore.Intheautomatedsequencer,thebandsintheelectrophoresisgelmovepastafluorescencedetector,whichidentifieswhichddNTPispresentineachband.Theinformationispassedtotheimagingsystem.(B)Theprintoutfromanautomatedsequencer.Thesequenceisrepresentedbyaseriesofpeaks,oneforeachnucleotideposition.Inthisexample,agreenpeakisan'A',blueis'C',blackis'G',andredis'T'.目前一百頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前一百零一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)展目前一百零二頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的缺陷及新進(jìn)展序列不可能太長費(fèi)時(shí)費(fèi)力準(zhǔn)確度不高結(jié)構(gòu)復(fù)雜序列雜交法質(zhì)譜法DNA芯片法單分子法目前一百零三頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前一百零四頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.5DNA的定點(diǎn)誘變盒式取代切除;合成;轉(zhuǎn)化olig介導(dǎo)PCR誘變目前一百零五頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)olig片段退火合成轉(zhuǎn)化olig介導(dǎo)的誘變目前一百零六頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)OligonucleotidemismatchmutagenesiscancreateadesiredpointmutationatauniquepredeterminedsitewithinaclonedDNAmolecule目前一百零七頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)P

C

R

誘變目前一百零八頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)目前一百零九頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)4.6

DNA與蛋白質(zhì)互作分析Y2HsystemY1HsystemgelretardationassaysDNaseIfootprinting目前一百一十頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)1.酵母雙雜交(Y2H)GAL4proteinBD與UAS結(jié)合AD激活lacZ單獨(dú)不起作用GAL1UAS啟動(dòng)子lacZreporter目前一百一十一頁\總數(shù)一百二十頁\編于十一點(diǎn)G