循環(huán)免疫復(fù)合物檢測(cè)

第十七章循環(huán)免疫復(fù)合物檢測(cè)永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系楊曉斌病例-慢性腎小球腎炎發(fā)病機(jī)制

慢性腎小球腎炎大部分是免疫復(fù)合物疾病，由循環(huán)內(nèi)溶性免疫復(fù)合物沉積于腎小球，或由抗原與抗體在腎小球原位形成免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體，引起組織損傷，也可不通過免疫復(fù)合物，而由沉積于腎小球局部的細(xì)菌毒素、代謝產(chǎn)物等通過“旁路途徑”激活補(bǔ)體，從而引起一系列的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腎小球腎炎。病例-急性腎小球腎炎發(fā)病機(jī)制

當(dāng)溶血性鏈球菌感染后，鏈球菌體作為抗原，刺激機(jī)體B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)抗體；當(dāng)抗原稍多于抗體，可形成可溶性循環(huán)免疫復(fù)合物，而沉積于腎小球內(nèi)皮下面致腎炎。有人認(rèn)為鏈球菌胞膜抗原與腎小球基底膜間有交叉抗原反應(yīng)性，即鏈球菌胞膜的相應(yīng)抗體，亦可與腎小球基底膜相結(jié)合，由此激活補(bǔ)體系統(tǒng)，誘集白細(xì)胞，促使血小板釋放第3因子及氧自由基的產(chǎn)生，使腎小球內(nèi)發(fā)生彌漫性炎癥。病例-病毒性肝炎HBV進(jìn)入人體后，侵襲肝細(xì)胞，在其中復(fù)制繁殖，并從肝細(xì)胞中逸出，并不引起肝細(xì)胞的損害，但在肝細(xì)胞膜表面上形成特異性的病毒抗原。從肝細(xì)胞逸出的病毒進(jìn)入血循環(huán)后，可刺激免疫系統(tǒng)（T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞），產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞（細(xì)胞免疫）和特異性抗體（體液免疫）。此種致敏淋巴細(xì)胞與肝細(xì)胞膜表面上的病毒抗原相結(jié)合，使致敏淋巴細(xì)胞釋放出各種體液因子，如淋巴毒素、細(xì)胞毒因子、趨化因子、移動(dòng)抑制因子、轉(zhuǎn)移因子等，將病毒殺滅，肝細(xì)胞亦遭受損害，引起壞死和炎癥反應(yīng)。免疫反應(yīng)強(qiáng)烈的患者可能發(fā)生急性重癥肝炎（暴發(fā)性肝炎），細(xì)胞免疫功能低下者，感染HBV后易演變?yōu)槁愿窝谆驍y帶者；免疫功能正常且侵及肝細(xì)胞的病毒量較多時(shí)，臨床表現(xiàn)多為一般的急性黃疸型肝炎。概念免疫復(fù)合物（IC）：指由抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合而成的復(fù)合物。局部免疫復(fù)合物：沉積在機(jī)體的某一局部，如在皮膚血管壁或臟器的IC?？扇苄悦庖邚?fù)合物：游離于體液中的IC循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）：血液中的IC，即循環(huán)系統(tǒng)的IC。形成免疫復(fù)合物是機(jī)體清除抗原的一種形式。在正常情況下，形成的IC可被機(jī)體的防疫系統(tǒng)清除。在一定條件下，IC可沉積在局部，激活補(bǔ)體引起一系列反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷，形成免疫復(fù)合物病與IC有關(guān)的疾病：1.某些自身免疫病如SLE；類風(fēng)濕等。2.鏈球菌感染后腎小球腎炎3.慢性活動(dòng)性肝炎等。因此，檢測(cè)體內(nèi)IC對(duì)某些疾病的診斷，發(fā)病機(jī)制的研究，判斷病情、療效觀察、預(yù)后估計(jì)等均有重要意義。第一節(jié)抗原非特異性循環(huán)免疫復(fù)合物檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)CIC的方法很多可分為：

1.抗原特異性檢測(cè)技術(shù)

2.抗原非特異性檢測(cè)技術(shù)沉積在局部病變的IC可用熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)，而循環(huán)IC一般按抗體分子在結(jié)合抗原后發(fā)生的物理學(xué)和生物學(xué)特性的改變而設(shè)計(jì)。類別原理方法敏感性（mg/L）備注物理法分子大小1.超速離心－適用于研究2.分子超濾－適用于研究3.凝膠過濾30適用于研究溶解度1.PEG沉淀20簡(jiǎn)單粗定量2.PEG比濁20易推廣臨床應(yīng)用補(bǔ)體法固定補(bǔ)體抗補(bǔ)體試驗(yàn)0.1常用特異性差結(jié)合C1q1.C1q固相法0.1C1q不易精制2.C1q液相法10不易普及3.C1q偏離試驗(yàn)1~5膠固素膠固素結(jié)合試驗(yàn)1敏感穩(wěn)定抗球蛋白法結(jié)合RF1.mRF凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)100定性不敏感2.mRF固相抑制試驗(yàn)1~20不易普及結(jié)合Ig抗抗體法2~3不易普及細(xì)胞法Fc受體血小板凝集試驗(yàn)1~4需新鮮制備1.Raji細(xì)胞法6需維持細(xì)胞株2.花環(huán)抑制試驗(yàn)10影響因素多

抗原非特異性CIC的檢測(cè)方法一、物理學(xué)技術(shù)沉降系數(shù)單位離心場(chǎng)的沉降速度值,是表明大分子顆粒沉降速度的參數(shù)。以大寫S表示,1S=10-13秒。S=V/ω2rs是沉降系數(shù)，ω是離心轉(zhuǎn)子的角速度（弧度/秒），r是到旋轉(zhuǎn)中心的距離，v是沉降速度。（一）分子大小特性根據(jù)分子大小不同，可用超速離心，凝膠過濾等方法檢測(cè)，但特異性和敏感性差。（二）溶解度特性PEG沉淀法聚乙二醇，它的親水性強(qiáng)，溶于水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的PEG。①認(rèn)為沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。②由于聚合物有較強(qiáng)的親水性，使生物大分子脫水而發(fā)生沉淀。③聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復(fù)合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通過空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發(fā)生沉淀。PEG比濁法檢測(cè)CIC（一）原理CIC分子量大，采用低濃度（2％－4％）的聚乙二醇（有較強(qiáng)的脫水作用），可將CIC從液相中析出。同時(shí)PEG還可抑制CIC的解離，促使CIC進(jìn)一步聚和，形成更大的聚和物而沉淀，沉淀物的多少與CIC的量有關(guān)。利用比濁法可測(cè)出CIC的存在與含量。（二）材料：1.PH8.40.1mol／L硼酸鹽緩沖液（BBS）2.PEG－NaF稀釋液3.被檢血清（要求新鮮清亮）二、補(bǔ)體技術(shù)IgG和IgM類抗體與抗原結(jié)合后，重鏈CH2區(qū)的補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)暴露，可以固定C1q并激活補(bǔ)體的系列反應(yīng)，這是利用補(bǔ)體有關(guān)技術(shù)檢測(cè)免疫復(fù)合物的基礎(chǔ)。1、C1q固相試驗(yàn)將待檢血清先行加熱56℃30min，以滅活其中的補(bǔ)體和破壞已與CIC結(jié)合的C1q，空出補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)。先將C1q吸附于固相載體表面，加入待檢血清使CIC與C1q結(jié)合，再加入同位標(biāo)記的或酶標(biāo)記的抗人IgG或SPA，最后檢測(cè)其放射活性或酶活性。2、抗補(bǔ)體試驗(yàn)本法的原理類似補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。將一定量的補(bǔ)體（多為混合豚鼠血清）與滅活的待檢血清混合溫育，反應(yīng)后加入致敏綿羊紅細(xì)胞。如出現(xiàn)溶血表示血清中沒有CIC存在；不溶血說明標(biāo)本中有CIC存在。將血清標(biāo)本做不同稀釋，并與已知的熱聚合IgG作對(duì)照，可以計(jì)算出CIC的含量。本方法的靈敏度較高，且易于在一般實(shí)驗(yàn)室開展，不足之處是特異性較差3、膠固素結(jié)合試驗(yàn)?zāi)z固素（conglutinin）是牛血清中的一種正常蛋白，能與C3d特異性結(jié)合；體內(nèi)與補(bǔ)體結(jié)合的CIC都帶有C3d，因此膠固素可與CIC結(jié)合。用一定量的膠固素包被塑料管，往管中加入稀釋的血清標(biāo)本，溫育后再加入同位素標(biāo)記或酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，最后檢測(cè)各管的放射活性或酶活性，計(jì)算CIC的含量。膠固素性質(zhì)穩(wěn)定、容易保存、來源方便、價(jià)格便宜，檢測(cè)方法也不復(fù)雜，便于推廣。本法的不足是只能檢出已結(jié)合補(bǔ)體的CIC，但不論何種激活途徑都一樣檢出，并可用作CIC分離。三、抗球蛋白測(cè)定法-mRF凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)類風(fēng)濕因子（RF）為抗IgG的自身抗體，與變性IgG、熱聚合IgG和IC都有較強(qiáng)的親和力。單克隆RF（mRF）可從待發(fā)性冷球蛋白血癥的血清中提取，多克隆RF（pRF）可從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的血清中提取。用mRF比pRF的敏感性更高一些。mRF凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)是將mRF和標(biāo)本中的CIC在瓊脂凝膠中擴(kuò)散，結(jié)合形成沉淀。四、細(xì)胞技術(shù)測(cè)定-Raji細(xì)胞試驗(yàn)