根際微生物群落與促生菌多樣性及其篩選策略

根際微生物群落與促生菌多樣性及其篩選策略摘要:根際是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)，在生物圈功能中發(fā)揮著非常顯著的作用，微生物和植物在根際環(huán)境中形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)式關(guān)系會(huì)直接或間接地影響植物生長(zhǎng),深入了解并利用這種互作關(guān)系對(duì)于提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)出投入比以及篩選獲得更高效、廣適的促生菌尤為必要。綜述了根際微生物群落與促生菌多樣性以及篩選策略,分析了研究中尚存在的一些問題，并對(duì)今后的研究進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞:植物根際促生菌(PGPR);微生物群落;根際生態(tài);多樣性;篩選1904年，德國(guó)農(nóng)學(xué)家Hiltner發(fā)現(xiàn)豆科植物根附近區(qū)域的土壤微生物，由于受到根系分泌有機(jī)物質(zhì)對(duì)其產(chǎn)生的“效應(yīng)”，表現(xiàn)出相對(duì)更高活性的現(xiàn)象,并首次提出“根際”(Rhizosphere)這一概念［1］?，F(xiàn)在我們知道，這種“效應(yīng)”其實(shí)是根際微生態(tài)系統(tǒng)中的根際效應(yīng)。單棵植物根際范圍雖小，但放眼看,根際卻是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng),其能量流也極其巨大，因而，根際在生物圈功能中的作用非常顯著。曾有研究人員估算，植物20%?50%的光合產(chǎn)物是通過根部釋放出來的［2,3］。根際土壤中存在大量的宏觀生物和微生物，如細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和藻類生物等，細(xì)菌是該群體中數(shù)量最多的一類微生物。微生物和植物在根際環(huán)境中形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)式關(guān)系會(huì)直接和間接地影響植物生長(zhǎng)；反過來,植物通過分泌有機(jī)物，構(gòu)建起一個(gè)有選擇性的環(huán)境條件，以利于對(duì)其生長(zhǎng)有益的細(xì)菌,導(dǎo)致根際細(xì)菌多樣性偏低［4,5］。植物根際促生菌(Plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR)在根際微生物群體中研究最為熱門，也是對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最具有應(yīng)用價(jià)值的一類微生物。由于PGPR數(shù)量眾多,且在根際定殖時(shí)具有競(jìng)爭(zhēng)力，加之其作用機(jī)制的多樣性，因此能在很大程度上影響植物生長(zhǎng)。然而，人們?cè)谑褂肞GPR或相關(guān)制劑時(shí)，普遍發(fā)現(xiàn)大田應(yīng)用效果遠(yuǎn)不及盆栽或溫室條件下的效果理想，主要原因是PGPR對(duì)“陌生”環(huán)境的不適應(yīng)。根際微生物是野外環(huán)境中的主要“陌生”因素，因此,了解與某些基本生態(tài)過程，如復(fù)雜性、自然選擇、種間關(guān)系(共生、寄生、共棲和競(jìng)爭(zhēng))、演替或擾動(dòng)效應(yīng)有密切關(guān)系的根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性,可以幫助人們更好地理解根際生態(tài)系統(tǒng)，并為PGPR的篩選和高效利用提供理論依據(jù)?；诖?本文主要從根際微生物群落多樣性、PGPR生態(tài)和遺傳多樣性以及PGPR的篩選策略等3個(gè)方面進(jìn)行綜述。1根際微生物群落多樣性微生物多樣性包括物種、遺傳與變異以及功能多樣性［6］。在根際系統(tǒng)中,細(xì)菌群落的功能多樣性是基于其遺傳變異以及和其他原核、真核生物(如植物)的互作關(guān)系。直至現(xiàn)在,根際微生物多樣性與根際微生物功能之間的關(guān)系仍不十分清楚。根際微生物多樣性信息的缺乏，其原因一是其種類繁多,二是絕大多數(shù)微生物的不可培養(yǎng)性。1.1根際微生物群落結(jié)構(gòu)的研究方法研究微生物群落結(jié)構(gòu),就必須了解各類群微生物群體的種類及數(shù)量。傳統(tǒng)技術(shù)是通過從根際土壤中提取、分離微生物，實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化和遺傳學(xué)檢驗(yàn)。由于細(xì)菌往往和土壤基質(zhì)以及其他細(xì)胞緊密附著，因此在細(xì)菌提取中常用到分散劑，即用物理或化學(xué)方法將細(xì)胞和基質(zhì)區(qū)分開，之后才能對(duì)分離細(xì)菌生物量進(jìn)行測(cè)定。微生物生物量的測(cè)定常用方法有:顯微鏡下直接計(jì)數(shù)(如吖啶橙染料染色)［7］、微生物呼吸量測(cè)定(如基質(zhì)誘導(dǎo)呼吸量’Substrateinducedrespiration,SIR)［8］、ATP含量測(cè)定［9］、最大或然法(Mostprobablenumber,MPN)計(jì)數(shù)［10］,使用脂類生物標(biāo)志物［11］以及氯仿土壤熏蒸法［12］等。但是，土壤中可培養(yǎng)微生物比例畢竟極低。有研究者曾估算這一比例只有不足1.0%(0.2%?0.8%)［13］。正因?yàn)槿绱?基于平板培養(yǎng)法研究土壤微生物多樣性存在重大缺陷，免培養(yǎng)技術(shù)順應(yīng)而生。所涉及的技術(shù)包括磷脂脂肪酸(Phospholipidfattyacidanalysis,PLFA)分析法［14-16］、DNA/RNA雜交［17］、聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction,PCR)、核糖體RNA測(cè)序［18］、(G+C)含量［19］、溫度梯度凝膠電泳(Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)和變性梯度凝膠電泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)、限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)［20,21］、DNA微陣列(DNAmicroarray)［22］技術(shù)(又稱“DNA陣列”或“DNA芯片”)、克隆文庫(kù)分析等方法。過去20多年間，人們利用這些技術(shù)手段揭示了很多有關(guān)土壤微生物群落的信息［23］。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，正確選擇合適的方法進(jìn)行研究，有助于更準(zhǔn)確地了解根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征。1.2根際微生物活性和功能多樣性的研究方法及根際PGPR活性研究根際微生物活性的經(jīng)典方法，是將細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)、分離并作理化試驗(yàn)。另一個(gè)方法是利用細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率來表征該菌在環(huán)境中的生理特性、養(yǎng)分利用特點(diǎn)和自適應(yīng)策略［24］。目前，人們廣泛采用某一關(guān)鍵酶活性的測(cè)定來表征某類群微生物的多樣性和代謝活性。此外,Biolog體系也是應(yīng)用較為廣泛的方法之一［16,25］。另外，通過克隆構(gòu)建大片段DNA文庫(kù)(如BAClibrary)，有助于更準(zhǔn)確地揭示土壤中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物，以及土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的相關(guān)信息［22］。未來土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究無疑會(huì)大量運(yùn)用DNA微陣列技術(shù)［22］，因?yàn)樵摷夹g(shù)可以利用其高特異性特點(diǎn)，將不同活性微生物區(qū)分開，并有助于解釋同一菌株在不同環(huán)境土壤樣本中的生態(tài)位的異同。當(dāng)然，基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)也是未來微生物學(xué)研究中不可或缺的輔助手段［22,26］。根際微生物多樣性反映了微生物群落的代謝活躍程度。在土壤中接種PGPR,只要能存活，無論是否改變微生物群落結(jié)構(gòu),都會(huì)在一定程度上影響群落的代謝活性［15］。因此，接種PGPR是否能在土壤中存活并競(jìng)爭(zhēng)是一個(gè)十分關(guān)鍵的問題，受物理的(質(zhì)地、溫度和濕度等)、化學(xué)的(pH、養(yǎng)分的可利用性、有機(jī)質(zhì)含量等)以及和根際其他微生物之間的互作關(guān)系等因素的影響。其中,PGPR與根際土著微生物的互作關(guān)系是一個(gè)十分重要的影響因子，因?yàn)榻臃NPGPR需要在根際形成新的生態(tài)位，并在根際定殖,且能競(jìng)爭(zhēng)足夠的養(yǎng)分。總之，接種PGPR后，要能以有限的群體發(fā)揮應(yīng)有的生物效應(yīng)。目前，人們可借助多種技術(shù)研究根際土壤微生物活性，比如前面介紹過的同位素(3H、14C)標(biāo)記DNA的胸腺嘧啶核苷或蛋白質(zhì)的亮氨酸組分，來估算群落代謝活性和生長(zhǎng)狀況［7,27］。此外，還可以用SIR技術(shù)定量測(cè)定根際微生物活性［8］。2PGPR生態(tài)及遺傳多樣性近些年來，由于人們愈加深刻地認(rèn)識(shí)到根際生態(tài)系統(tǒng)的重要性，加之PGPR作用機(jī)制研究的不斷深入［28］,越來越多的PGPR被篩選出來并加以鑒定。從結(jié)果看，很多屬都有PGPR的分布。下面以目前PGPR相對(duì)集中的幾個(gè)屬來闡述其生態(tài)特征和多樣性。固氮PGPR(DiazotrophicPGPR)自生固氮菌大概是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有促生作用的根際微生物。自20世紀(jì)70年代,固氮螺菌屬(Azospirillumsp.)的菌株就已被分離出并應(yīng)用于實(shí)踐［29］。其他還有能起促生作用且能自生固氮的屬種主要有固氮弓菌屬(Azoarcus,Azonexus,Azospira)［30］、布克氏菌屬(Burkholderiasp.)、重氮營(yíng)養(yǎng)葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)、草螺菌屬(Herbaspirillumsp.)、固氮菌屬(Azotobactersp.)和多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)等［31］。上述這些細(xì)菌可以從許多種類植物，包括水稻、甘蔗、玉米、高粱以及其他谷物,甚至菠蘿、咖啡豆的根際分離到。最近，固氮弓菌因其遺傳和代謝多樣性而逐步引起研究者的關(guān)注。該屬細(xì)菌能生長(zhǎng)在以羧酸類或乙醇為碳源的培養(yǎng)基上，而且最適生長(zhǎng)溫度在37~42°C。桿菌(Bacillus)土壤中的G+桿菌有95%屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.),其余5%屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter)和弗蘭克氏菌(Frankia)［32］。許多桿菌能在逆境下形成芽孢以增強(qiáng)生存能力，一些桿菌如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)還具有固氮能力［33］。桿菌類的PGPR具備多種促生能力［14,34,35］。假單胞菌(Pseudomonas)在植物根際土壤G-細(xì)菌中，假單胞菌是數(shù)量最多的一類，該屬中的PGPR也因?yàn)榇偕芰V泛而被人們所熟知［14,36,37］。假單胞菌屬細(xì)菌生態(tài)多樣性豐富，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)從許多植物根際土壤中分離出大量該屬的細(xì)菌。假單胞菌細(xì)菌往往代謝功能多樣，可以產(chǎn)生抗生素、嗜鐵素或氤類化合物等多種代謝物［38］。這些代謝物通過抑制其他有害微生物以及幫助植物吸收土壤養(yǎng)分，從而影響根際生態(tài)環(huán)境。根瘤菌(Rhizobia)這里提及的根瘤菌是指能在非豆科植物根際進(jìn)行非特異性定殖,并釋放促生調(diào)控因子，如嗜鐵素、氤類化合物或進(jìn)行溶磷等作用，提高土壤養(yǎng)分的可利用性［39］。已有報(bào)道指出，在作物和一些非豆科植物輪作后，其根際微生物數(shù)量會(huì)大幅增加［40］,這對(duì)隨后的作物生長(zhǎng)十分有益［41］。3PGPR篩選策略由于野外植物根際土壤是PGPR高密度集中地，因此該區(qū)域成為篩選PGPR的最佳來源地。進(jìn)行篩選工作時(shí),不同土壤類型、植物種類、季節(jié)以及植物生長(zhǎng)期都必須考慮，以保證篩選到最多的菌株。且一般土壤根際有2%?5%的細(xì)菌屬于PGPR。由此可見,野外植物根際是篩選PGPR的最佳來源地［4,42］。細(xì)菌成為PGPR的先決條件是，當(dāng)被接種后，能在根際土壤微生物群體中表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)母?jìng)爭(zhēng)力。篩選PGPR的第一步工作，是獲得足夠多的根際土壤細(xì)菌。通常認(rèn)為根際土壤是指緊密附著在植物根表(1~3mm區(qū)域)的土壤。試驗(yàn)中，通常將植物根表土壤劇烈抖掉后，仍緊密附著的土壤作為根際土壤,用于篩選工作。當(dāng)然，根據(jù)研究需要，除了根際土壤細(xì)菌，也可篩選根際內(nèi)生細(xì)菌,因?yàn)檫@部分細(xì)菌也有不少是PGPR。也有一些研究者將植物根用自來水輕柔沖洗，仍附著的土壤被看作根際土壤而進(jìn)行PGPR篩選。根際土壤充分懸浮于無菌水、磷酸緩沖液或生理鹽水。一些化合物如焦磷酸鹽可作為土壤分散劑,但也可以影響細(xì)胞膜的通透性［43］。一些化學(xué)分散劑，如螯合劑可以用單價(jià)的陽(yáng)離子(Na+)交換土壤顆粒的多價(jià)陽(yáng)離子(Ca2+)，從而減弱土壤顆粒對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的離子吸附作用。不少研究者用亞氨基二乙酸制成的離子交換樹脂，如DowexA1［44］或Chelex-100［45,46］。其他的一些分散劑有Tris緩沖液或六偏磷酸鈉［47］。由于微生物細(xì)胞被其胞外聚合物緊密附著于土壤顆粒，有時(shí)也會(huì)使用去污劑。Macdonald［44］曾用0.1%的脫氧膽酸鈉作為去污